Name: human neural organoids for studying brain cancer and neurodegenerative diseases
Uploaded: 2019-06-28T13:40:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Neural Organoids for Studying Brain Cancer and Neurodegenerative Diseases at JoVE.com

Авторы благодарят La Ligue Genevoise Contre le Cancer (Генева, Швейцария), ISREC Foundation (Лозанна, Швейцария) и Фонд Клейтона по исследованиям (Хьюстон, Техас, США) за финансовую поддержку. Кроме того, авторы благодарят HES-HO и Центр Висса за финансовую поддержку. Мы благодарим лабораторию Краузе за полезные обсуждения и поддержку, а д-ра Халаха Кутаиша за корректуры.

<ol>
	<li>Louis, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+World+Health+Organization+Classification+of+Tumors+of+the+Central+Nervous+System:+a+summary.">The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary.</a> Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).</li><li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma.">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).</li><li>Daphu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+animal+models+for+studying+brain+metastasis:+value+and+limitations.">In vivo animal models for studying brain metastasis: value and limitations.</a> Clinical and Experimental Metastasis. 30 (5), 695-710 (2013).</li><li>Huszthy, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+models+of+primary+brain+tumors:+pitfalls+and+perspectives.">In vivo models of primary brain tumors: pitfalls and perspectives.</a> Neuro Oncology. 14 (8), 979-993 (2012).</li><li>Nayernia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+brain+tumor+cell+invasion+of+engineered+neural+tissues+and+in+vivo+features+of+glioblastoma.">The relationship between brain tumor cell invasion of engineered neural tissues and in vivo features of glioblastoma.</a> Biomaterials. 34 (33), 8279-8290 (2013).</li><li>Cosset, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tissue+engineering+allows+the+identification+of+active+miRNA+regulators+of+glioblastoma+aggressiveness.">Human tissue engineering allows the identification of active miRNA regulators of glioblastoma aggressiveness.</a> Biomaterials. 107, 74-87 (2016).</li><li>Pringsheim, T., Jette, N., Frolkis, A., Steeves, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+Parkinson's's+disease:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">The prevalence of Parkinson's's disease: a systematic review and meta-analysis.</a> Movement Disorders. 29 (13), 1583-1590 (2014).</li><li>Rajput, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globus+pallidus+dopamine+and+Parkinson's+motor+subtypes:+clinical+and+brain+biochemical+correlation.">Globus pallidus dopamine and Parkinson's motor subtypes: clinical and brain biochemical correlation.</a> Neurology. 70 (16 Pt 2), 1403-1410 (2008).</li><li>Jellinger, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+Parkinson's's+disease.+Changes+other+than+the+nigrostriatal+pathway.">Pathology of Parkinson's's disease. Changes other than the nigrostriatal pathway.</a> Molecular and Chemical Neuropathology. 14 (3), 153-197 (1991).</li><li>Bernheimer, H., Birkmayer, W., Hornykiewicz, O., Jellinger, K., Seitelberger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+dopamine+and+the+syndromes+of+Parkinson’s+and+Huntington.+Clinical,+morphological+and+neurochemical+correlations.">Brain dopamine and the syndromes of Parkinson’s and Huntington. Clinical, morphological and neurochemical correlations.</a> Journal of Neurological Science. 20 (4), 415-455 (1973).</li><li>Tieng, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+midbrain+organoids+containing+long-lived+dopaminergic+neurons.">Engineering of midbrain organoids containing long-lived dopaminergic neurons.</a> Stem Cells and Development. 23 (13), 1535-1547 (2014).</li><li>Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Biomimetic+Cultures:+The+Next+Platform+for+Cell+Biology.">3D Biomimetic Cultures: The Next Platform for Cell Biology.</a> Trends in Cell Biology. 26 (11), 798-800 (2016).</li><li>Friedl, P., Sahai, E., Weiss, S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+dimensions+in+cell+migration.">New dimensions in cell migration.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 743-747 (2012).</li><li>Byers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNCA+triplication+Parkinson's's+patient's+iPSC-derived+DA+neurons+accumulate+alpha-synuclein+and+are+susceptible+to+oxidative+stress.">SNCA triplication Parkinson's's patient's iPSC-derived DA neurons accumulate alpha-synuclein and are susceptible to oxidative stress.</a> PLoS ONE. 6 (11), e26159 (2011).</li><li>Flierl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+vulnerability+and+stress+sensitivity+of+neuronal+precursor+cells+carrying+an+alpha-synuclein+gene+triplication.">Higher vulnerability and stress sensitivity of neuronal precursor cells carrying an alpha-synuclein gene triplication.</a> PLoS ONE. 9 (11), e112413 (2014).</li></ol>

Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих финансовых интересах.

Одним из наиболее важных аспектов этого протокола является поддержание плюрипотентности hESC во время культивирования клеток и тщательный мониторинг сфер и нейроорганоидной морфологии. hESCs очень чувствительны, и каждая манипуляция может привести к ранней неконтролируемой дифференциации, а также смерти клеток. Для повышения экспериментальной воспроизводимости и избежания возникновения аномальных кариотипных явлений рекомендуется криоконсервировать несколько партий гЭСК при самом низком проходе после проверки их хромосомного устойчивости. Кроме того, рекомендуется разморозить новый флакон для каждого эксперимента и проверять поведение клеток каждый день. Если сферы менее рефракционные с аномальным более высоким размером, они, скорее всего, начнут агрегировать и умирать.
Одним из улучшений в этой системе является либо перфузии или реализации васкуляризированной системы (путем добавления эндотелиальных клеток или в 3D жидкости микрочип)12,13. Однако контроль толщины нервного органоида (300 мкм) позволяет эффективно перетусывать кислород и питательные раны и предотвращает некроз. Другим усовершенствованием является введение иммунных клеток (микроглии). С учетом этих ограничений, нервные органоиды плюс система GIC может быть соответствующим инструментом по нескольким причинам. Во-первых, эта система позволяет скрининг наркотиков для мониторинга того, как терапевтическое соединение может повлиять на органоид или опухолевые клетки. Во-вторых, можно изучить взаимодействие между клетками и клетками, а микроэкологические детерминанты, лежащие в основе индивидуальных и коллективных вторжений, можно визуализировать и изучить5,6,13.
В контексте болезни Паркинсона, нервный органоид, обогащенный нейронами DA, может представлять собой соответствующую и точную 3D-модель для изучения развития болезни. В предыдущих исследованиях, Паркинсона пациента полученных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, дифференцированных по отношению к DA нейронов были использованы для изучения пострадавших нейронных подтипов. Следует отметить, что некоторые связанные с болезнями фенотипы, такие как накопление синуклеина и чувствительность к окислительному стрессу, наблюдались14,15. Кроме того, нервный органоид может быть использован в качестве инструмента для проверки терапевтических молекул. Тем не менее, конкретные и соответствующие считывании должны быть созданы для оценки dA нейронов выживания и функциональности, такие как производство допамина и электрофизиологической активности. В целом, этот протокол обеспечивает два стандартизированных и точных подходов на основе стволовых клеток для генерации нервных органоидов.

Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) классифицирует астроцитомы как низкоклассные (i класс i-II) или высокие (классы III и IV). Глиобластома мультиформ (GBM) является астроцитома класса IV, наиболее смертоносных первичных опухолей головного мозга, что является устойчивым ко всем текущим формам лечения1. Несмотря на стандартную терапию, включая нейрохирургию, химиотерапию и лучевую терапию, ГБМ остается смертельным, и 15-месячная общая выживаемость не сильно изменилась за последние 15 лет2. Для достижения значительного прогресса в понимании ПАтогенеза ГБМ, использование соответствующих моделей является ключевым фактором. До сих пор, изучение GBM полагалось на клеточные линии, грызунов органотипических ломтиков, и ксенотрансплантации пациентов полученных клеток в мышей или трансгенных мышей развивающихся спонтанных опухолей3,4. Хотя эти модели были полезны для изучения метастази мозга и агрессивности опухоли, они ограничены различиями между видами, и в результате выводы могут быть неправильно переведены на человеческие ткани. Кроме того, существующие модели с человеческими клетками такжеограничены отсутствием взаимодействия ткани хозяина/опухоли 3,4. Экспериментальные модели имеют решающее значение для перевода с фундаментальной науки на терапевтические цели. Таким образом, описывая протокол для производства в пробирке человеческих нервных органоидов совместно с GBM-инициирующих клеток (GICs) может обеспечить соответствующую систему, которая имитирует морфологические и функциональные особенности развития GBM. Эта система воспроизводит некоторые in vivo особенности развития GBM, такие как диффузная миграция вторгшихся клеток и областей некроза, и она подчеркивает экспрессию генов, имеющих отношение к биологии опухоли. Как было выявлено ранее, некоторые критические микроРНК индуцируются во время развития GIC в 3D нервной ткани5,6.
PD является одним из основных нейродегенеративных расстройств и связанных с дегенерацией нескольких нейрональных подтипов7. Даже если прогрессирующее начало симптомов (например, брадикинезия, асимметричный тремор отдыха, жесткость и нестабильность осанки) характеризуют болезнь, ее точная этиология четко не установлена. Действительно, многие исследования выявили доказательства того, что основные факторы риска могут быть результатом сочетания генетических и экологических факторов. Симптомы Паркинсона связаны с двусторонней дегенерацией дофаминергических нейронов в субстанции нигра (SN), что приводит к исчезновению дофаминергических (DA) аксонов, проецирующихся на стриатум8,9. Таким образом, снижение уровня стриатал допамина коррелирует с прогрессированием двигательной дисфункции у пациентов PD. Допамингические нейроны содержат гидроксилазу тирозина (TH), ключевой фермент в синтезе катехоламинергических нейротрансмиттеров, который преобразует аминокислоту L-тирозин в L-3,4-dihydroxyphenylalaninein (L-DOPA, прекурсор допамина) в допамин10. Ранняя потеря активности TH с последующим снижением экспрессии белка TH является отличительной чертой PD.
Это исследование описывает два протокола с использованием человеческих нервных органоидов, с одним специально ориентированных на средний мозг, как фенотип обогащенный TH-положительных клеток.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1569px;" width="1569">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;width:455px;">6-well plate (6-well plate)</td>
			<td style="width:203px;">Falcon / Corning</td>
			<td style="width:167px;">07-201-588</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">ABI Prism 7900 HT detection system&#160; (Real-Time PCR detection systems)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Aggrewell 400 (Microwell culture plates )</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td align="right">34421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Amplifier (W2100-HS32)&#160; (Amplifier)</td>
			<td>Multi Channel Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Anti-EGFR (phospho Y1101) antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76195</td>
			<td>1/100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Anti-GFAP Antibody</td>
			<td>Dako&#160;</td>
			<td>Z334&#160;</td>
			<td>1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Anti-Nestin, Human Antibody</td>
			<td>Millipore&#160;</td>
			<td>ABD69&#160;</td>
			<td>1/400 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Anti-Synapsin I Antibody</td>
			<td>Chemicon&#160;</td>
			<td>AB1543P&#160;</td>
			<td>1/500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">B27 supplements (B27)</td>
			<td>Life Technologies / Invitrogen</td>
			<td align="right">1238</td>
			<td>For both protocol, stock solution 100x, final solution 1x</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Brain-derived neurotrophic factor&#160; (BDNF)</td>
			<td>Cell Guidance</td>
			<td>GFH1-2</td>
			<td>For both protocol,&#160; stock solution 100 &#181;g/mL in pure H2O, final solution 20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">CHIR-99021 (GSK-3&#946; inhibitor )</td>
			<td>Axon Medchem</td>
			<td>ct99021</td>
			<td>For Dopaminergic protocol,&#160; stock solution 7.5 mM in DMSO, final solution 3 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Compound E a &#947;&#8211;secretase inhibitor (&#947;&#8211;secretase inhibitor)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>CAS 209986-17-4</td>
			<td>For both protocol (gamma-secretase inhibitor XXI),&#160; stock solution 5 mM in DMSO, final solution 1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Coulochem III&#160; (Coulometric detector parameters)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Dibutyryl cyclic-AMP (Dibutyryl cAMP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td>For Dopaminergic protocol,&#160; stock solution 0.5 M in DMSO, final solution 0.5 mM</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Dimethyl Sulfoxide Pure (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6164</td>
			<td>Compounds solvent, ready to use</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12491-015</td>
			<td>For cell culture, ready to use</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium Mixture F-12 (DMEM-F12)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">11320033</td>
			<td>For cell culture, ready to use</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">EDTA 0.1 mM (EDTA)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9912</td>
			<td>For cell culture, ready to use</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0313</td>
			<td>For GIC culture,&#160; stock solution 100 &#181;g/mL in pure H2O, final solution 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Fibroblast Growth Factor 20 (FGF20)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-41</td>
			<td>For Dopaminergic protocol,&#160; stock solution 100 &#181;g/mL in pure H2O, final solution 5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">fibroblast growth factor 8&#160; (FGF8)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>GFH176-5</td>
			<td>For Dopaminergic protocol,&#160; stock solution 100 &#181;g/mL in pure H2O, final solution 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Fibroblast growth factor-basic (bFGF)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0024</td>
			<td>For GIC culture,&#160; stock solution 100 &#181;g/mL in pure H2O, final solution 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">G5 supplements (G5)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td align="right">17503012</td>
			<td>For GIC culture, stock solution 100x, final solution 1x</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF)</td>
			<td>Cell Guidance</td>
			<td>GFH2-2</td>
			<td>For both protocol,&#160; stock solution 100 &#181;g/mL in pure H2O, final solution 20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Hydrophilic polytetrafluoroethylene&#160; membrane (PTFE membrane)</td>
			<td>BioCell-Interface</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">LDN-193189 (BMP inhibitor)</td>
			<td>Axon Medchem /Stemgen</td>
			<td>04-0072-02 /1509</td>
			<td>Dual/Smad,&#160; stock solution 5 mM in DMSO, final solution 0.5 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">L-glutamine (L-glutamine)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">25030081</td>
			<td>L-Glutamine (200 mM), stock solution 200 mM, final solution 2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Matrigel (extracellular matrix)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td align="right">354277</td>
			<td>hESC-qualified Matrix, stock solution 18-22 mg/mL, final solution 180-220 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Millicell-CM Culture plate insert&#160; (0.4 &#181;m) (Culture plate insert)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICM03050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Monoclonal Anti-&#946;-Tubulin III antibody</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>T8660&#160;</td>
			<td>1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">MS Orbital Shaker, MS-NOR-30 (Orbital shaker)</td>
			<td>Major Science</td>
			<td>MS-NRC-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">N2 supplements (N2)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>For GIC culture, stock solution 100x, final solution 1x</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Nanodrop (Nanodrop)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Neurobasal (Neurobasal)</td>
			<td>Life Technologies / Gibco</td>
			<td align="right">21103049</td>
			<td>Maintenance and maturation embryonic neuronal cell populations&#160;, ready to use</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Non-Essential Amino Acids&#160; (NEAA)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">11140</td>
			<td>Non-essential Amino Acids 100X, stock solution 100x, final solution 1x</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Nurr1 Antibody (M-196)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-5568</td>
			<td>1/100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Nutristem&#160; (hESC medium )</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td>Stem cell media, ready to use</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Penicilin / Streptomycin&#160; (Penicilin / Streptomycin )</td>
			<td>Life Technologies / Gibco</td>
			<td align="right">15140122</td>
			<td>For cell culture, stock solution 5 mg/mL, final solution 50 &#181;g/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Perchloric acid 0.1N (HCLO4)</td>
			<td>Merck</td>
			<td align="right">100519</td>
			<td>For HPLC, ready to use</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline without Ca2+/Mg2+&#160; (PBS without Ca2+/Mg2+ )</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td align="right">14190250</td>
			<td>For cell culture, ready to use</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">PrimeScript RT-PCR Kit (Reverse transcription kit)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR014A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Purmorphamin (smoothened agonist)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>SML0868</td>
			<td>For Dopaminergic protocol,&#160; stock solution 10 mM in DMSO, final solution 2 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Rho-associated Kinase Y-27632 (ROCK)</td>
			<td>Abcam Biochemicals</td>
			<td>ab120129-1</td>
			<td>Rock Inhibitor,&#160; stock solution 50 mM in DMSO, final solution 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">RNeasy mini kit (RNA extraction kit )</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">SB-431542 (TGF&#946;/Activin/Nodal inhibitor )</td>
			<td>Ascent</td>
			<td>Asc- 163</td>
			<td>Dual-Smad,&#160; stock solution 50 mM in DMSO, final solution 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Sonic Hedgehog (SHH)</td>
			<td>Cell Guidance</td>
			<td>GFH168-5</td>
			<td>For Dopaminergic protocol,&#160; stock solution 100 &#181;g/mL in pure H2O, final solution 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">StemPro Accutase (hESC enzymatic solution)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11105-01</td>
			<td>hESC enzymatic solution, ready to use</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Symmetry C-18,5 mm (4.6 150mm2)&#160; (Reversed-phase column)</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">T150 flask (T150 flask)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-772-1F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">TH Antibody (F-11)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-25269</td>
			<td>1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Transforming Growth Factors beta 3 (TGF&#946;3)</td>
			<td>Cell Guidance</td>
			<td>GFH109-2</td>
			<td>For Dopaminergic protocol,&#160; stock solution 100 &#181;g/mL in pure ethanol , final solution 1 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Trichostatine A (inhibitor of histone deacetylase )</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8552</td>
			<td>For Dopaminergic protocol,&#160; stock solution 100 &#181;M in DMSO, final solution 20 nM</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">TrypLE (recombinant enzymatic solution)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td align="right">12604021</td>
			<td>recombinant enzymatic solution, ready to use</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Trypsin 0.25% (enzymatic solution)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td align="right">15050065</td>
			<td>enzymatic solution, ready to use</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">W2100, Multi Channel Systems (Data acquisition system )</td>
			<td></td>
			<td>WAT045905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">X-vivo (serum free medium)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE04-743Q</td>
			<td>serum free medium, ready to use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human neural organoids for studying brain cancer and neurodegenerative diseases

Отсутствие соответствующих нейронных моделей in vitro является важным препятствием на пути медицинского прогресса в области нейропатологии. Создание соответствующих клеточных моделей имеет решающее значение как для лучшего понимания патологических механизмов этих заболеваний, так и для выявления новых терапевтических целей и стратегий. Чтобы быть уместным, модель in vitro должна воспроизвести патологические особенности болезни человека. Однако, в контексте нейродегенеративных заболеваний, соответствующая модель in vitro должна обеспечить замену нервных клеток в качестве ценной терапевтической возможности.
Такая модель не только позволит скрининг терапевтических молекул, но и может быть использована для оптимизации дифференциации нейронных протоколов (например, в контексте трансплантации при болезни Паркинсона (PD)). Это исследование описывает два протокола in vitro 1) развития глиобластомы человека в рамках человеческих нервных органоидов (NO) и 2) нейрон дофаминергической (DA) дифференциации генерации трехмерной (3D) органоидов. Для этого был разработан хорошо стандартизированный протокол, позволяющий вырабатывать размеры нейросфер, полученных из гениальной стволовой клетки человека (HESC). Первая модель может быть использована для выявления молекулярных и клеточных событий, происходящих во время развития глиобластомы в нервной органоидов, в то время как органоид DA не только представляет собой подходящий источник нейронов DA для клеточной терапии при болезни Паркинсона, но также может использоваться для тестирования на наркотики.

Критические шаги этого протокола должны быть хорошо определены и обработаны должным образом. Таким образом, диаграмма культурных условий, указывающих на промежуток времени для каждого шага, а также соединения, используемые для протокола дифференциации, иллюстрируются на рисунке 1A и Рисунке 3A для NO плюс GBM и DA нейронных органоидов, соответственно. Рисунок1B,C,D,E,F иллюстрирует клетки, сферы и НЕТ и показывает типичную морфологию для каждого шага. Рисунок 1G,H, я иллюстрирую иммунофлуоресценции окрашивания с некоторыми нейронных маркеров.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59682/59682fig1.jpg"> Рисунок 1 : Человеческий нервный органоид (NO) протокол адифференциации. (A) Стандартизированный протокол для генерации NO, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека (hESC). (B) hESCs поддерживаются на внеклеточной матрице в среде hESC. (C) Microwell пластины были использованы для создания откалиброванных нейросфер. В 2 недели, нейросферы были покрыты на вставку, содержащую мембрану PTFE (шкала бар 50 мкм). (D) Макроскопический вид НЕТ в вставку в один колодец из 6 хорошо пластины. В первые дни наблюдались розетки (черная стрелка) (Е). (F) Макроскопический вид NO плюс GIC сфере на вершине. (G-I) Иммунофлуоресценция анализ NO плюс GIC сферы (EGFR-положительный; шкала бар 50 мкм) (G) и НЕТ в одиночку, который показал иммунную реактивность для нейронального маркера ЗIII-тубулин и слегка положительным для nestin; однако, синапсин 1 показал слабый сигнал (H,I) (шкала баров - 100 мкм и 50 мкм соответственно). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59682/59682fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59682/59682fig2.jpg"> Рисунок 2 : Иллюстрация некротических сфер и незрелых НЕТ. Нейросферы (A) и NO (B) может пройти некроз, когда они слишком многочисленны в колодце или негабаритных (C) (шкала бар 10 мкм). (D) Один GIC инфицированных томатный репортер помочь отслеживать вторжение опухолевых клеток в НЕТ, шкала бар, 10 мкм. Пример незрелых НЕТ с нервными трубками (E) и не нервных труб (F) (шкала бар 50 мкм). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59682/59682fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59682/59682fig3.jpg"> Рисунок 3 : Стандартизированный протокол для генерации нервного органоида DA и электрофизиологического и морфологического анализа. (A) Стандартизированный протокол для генерации нервных органоидов DA. (B) Иммунофлуоресценция анализ DA нервного органоида; TH-иммунореактивные клетки, совместно выражающие Nurr1, маркер среднего мозга (шкала бар 50 мкм). Данные представлены в виде средних SEM (n No 3). (C) Графики представляют кинетику ЭКСПРЕССии генов TH и Nurr1, оцениваемые qRT-PCR. (D) Представитель HPLC: пик допамина (стрелка) был обнаружен HPLC из DA нервного органоида лизата. (E) Пример необработанных данных, записанных с платформой MEA. Каждый шип отображается вертикальной линией (штампами времени), в то время как оставшийся след — это шум. (F) Изображение представляющих нейросферы на хранение на MEA. (G) Суперпозиция типичных шипов (синих и красных кривых), обнаруженных на необработанных данных. Черная смелая кривая указывает среднее значение соответствующих красных кривых. (H) Raster участок с указанием времени марки, связанные с каждым всплеском обнаружены. Различные цвета подчеркивают различные электроды. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59682/59682fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a> 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Ген</td>
			<td>Фоуард</td>
			<td>Обратный</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nurr1</td>
			<td>GGCTGAAGCCATCTTGTGTGT</td>
			<td>GTGAGGTCCATGCTAACTGACA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Й</td>
			<td>GCACCTTCGCGCAGTTCTCT</td>
			<td>CCCGAACTCCGTGAA</td>
		</tr>
<tr>
<td>EEF1</td>
			<td>АГКААААААТКАКАККАААТГ</td>
			<td>GCCTGGATGGTCAGGATA</td>
		</tr>
<tr>
<td>GAPDH</td>
			<td>ГКАКАААГАГААААГАГАГАГАГАГАЗАк</td>
			<td>AGGGGAGATCAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Праймеры, используемые в этом протоколе.

Watch this Scientific Journal Video about Human Neural Organoids for Studying Brain Cancer and Neurodegenerative Diseases at JoVE.com

Human Neural Organoids for Studying Brain Cancer and Neurodegenerative Diseases

Это исследование вводит и описывает протоколы для получения двух конкретных человеческих нервных органоидов в качестве соответствующей и точной модели для изучения 1) развития глиобластомы человека в человеческих нервных органоидов исключительно у людей и 2) нейрон дофаминергических дифференциации, генерирующей трехмерный органоид.

Человеческие нейронные органоиды для изучения рака мозга и нейродегенеративных заболеваний

The lack of relevant in vitro neural models is an important obstacle on medical progress for neuropathologies. Establishment of relevant cellular models ...

В регенеративной медицине, надежный протокол дифференциации плюрипотентных стволовых клеток к определенному типу нервной клетки является ценным инструментом. В нашем случае, эти протоколы были очень полезны для изучения как развития глиобластомы и болезни Паркинсона. Итак, во-первых, генерация трехмерного органоида имеет то преимущество, что тесно имитирует физиологическое развитие, а также производство калиброванных по размеру нейросфер из плюрипотентных стволовых клеток имеет высокую воспроизводимость.Следующую процедуру продемонстрирует Манон Локателли, аспирант нашей лаборатории. За 24 часа до начала трех-D культуры, заменить hESC среды с сывороткой свободной среде дополняется 10-микромоляной ингибитор ROCK. Клетки должны быть на 60%-м месте.На следующий день отсоедините колонии HESC как одиночные клетки, удалив средний и полоскающий кальций и без магния PBS. Затем добавьте пять миллилитров раствора энзиматической растворения и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение одной-двух минут. После этого соберите клетки в среде, свободной от сыворотки с 10-микромоляной ингибитором ROCK и центрифугой клеток при 300 раз g в течение пяти минут.После центрифугации проверьте размер клеточной гранулы. Удалите супернатант и посчитайте клетки в 10 миллилитров среды, свободной от сыворотки, дополненной 10-микромолярным ингибитором ROCK. Параллельно промыть микроуровн пластины с двумя миллилитров сыворотки свободной среды на колодец и центрифуги пластины на 1, 200 раз г в течение пяти минут, чтобы удалить все пузырьки, с тем чтобы предотвратить образование нейросферы.Затем приготовьте 28,2 миллиона клеток в 12,5 миллилитров среды без сыворотки, дополненной 10-микромоляным ингибитором ROCK. Выпределите 1000 клеток на микроуэлл. Центрифуга клетки в 300 раз г в течение пяти минут и проверить однородное повторное участие клеток в микроуровн пластины под микроскопом.Поместите тарелку в инкубатор при 37 градусах по Цельсию на ночь. На следующий день изучите микроокровнную пластину, чтобы проверить размер сформированных сфер в каждом микроуровне. Перенесите сферы на шестиясную пластину, используя среду, дополненную коктейлем ингибирования двойного SMAD для содействия быстрой индукции нейронов.С этого шага вперед, сферы культурны в вращении на 60 оборотов в минуту, чтобы предотвратить их от прилипания друг к другу или к пластине. На первый-четвертый день меняем среду каждые два-три дня перед выполнением нейронной индукции. С 4-го по 11-й день, способствовать распространению HESC полученных нейронных розеток, добавив EGF и bFGF на 10 нанограмм на миллилитр в B27 среды дополняется двойной SMAD коктейль.С 11-го по 13-й день культуры сферы в среде B27 дополнены ингибитором BMP 0,5 микромоля. С 13 по 21 день, культура сферы в среде B27 дополняется GDNF и BDNF на 10 нанограмм на миллилитр и один микромолярный ингибитор гамма-секретазы. На 21 день поместите одну вставку пластины культуры в один колодец новой пластины из шести хорошо.После этого добавьте один миллилитр среды B27, дополненный факторами роста и ингибиторами, к каждому хорошо под мембранной вставкой. Впоследствии пластины сфер на гидрофильной мембране PTFE откладываются на культурную пластину вставки и изменить среды каждые два-три дня в течение следующих трех недель дифференциации. Остановите вращение от этого шага.Наличие розеток указывает на начало нейронной дифференциации. С 21 по 25 день культивируйте человеческие нервные органоиды в той же среде созревания нейронов. Затем, с 25 по 28 день, только дополняют B27 среды с одним микромоляной гамма-секретазы ингибитор.С 28-го по 39-й день прекратите добавлять ингибитор гамма-секретазы и продолжайте нейрооноидную культуру человека только в среде B27. Через три недели нервные органоиды готовы к использованию для имплантации ГИК. На нулевом дне усиливают гЕУ в двух-D культуре до 60% стечения.Затем замените среду стволовых клеток, используемую для поддержания плюрипотентности особенностей гЭСК с сывороткой свободной среды, содержащей двойной SMAD ингибирования коктейль, чтобы начать нейронной индукции и 10-микромоляры ROCK ингибитор для увеличения выживаемости клеток во время прохождения на следующий день. В первый день подготовьте микроокровую пластину с 2,5 миллилитров на колодец свободной от сыворотки среды, содержащей ту же концентрацию ингибитора ROCK и молекул ингибирования с двойным SMAD. Чтобы дифференцировать клетки к брюшной модели нервной трубки, добавьте SHH и FGF8 на 100 нанограмм на миллилитр и два микромолары сглаженный агонист.После добавления среды, центрифуга пластины на 1200 раз г в течение пяти минут, чтобы удалить пузырьки воздуха из микроуровн. После того, как пластина микроуэлла готова к использованию с половиной дифференциации среды, удалить среду hESCs и быстро мыть с кальцием и хлоридом магния свободной PBS. Разъединяйте колонии в одноклеточную подвеску, добавляя 7,5 миллилитров рекомбинантного энзиматичного раствора в колбу T75.Инкубировать клетки в течение двух минут при 37 градусах по Цельсию, а затем добавить 7,5 миллилитров DMEM F12. Впоследствии соберите подвесную клетку и центрифугу по 300 раз г в течение пяти минут. Затем удалите супернатант и подсчитайте клетки в той же среде, используемой для подготовки пластины микроуэлла.Отрегулируйте средний объем, чтобы получить подвеску клетки, позволяющую формировать нейросферы, содержащие 1000 клеток на микроуэлл, подготавлив 4,7 миллиона клеток в 2,5 миллилитров среды, и добавив его к предыдущим 2,5 миллилитров среднего уже помещены в пластину. Для того, чтобы правильно распределить клетки в каждом микроуэлле, аккуратно встряхните пластину и центрифуга ее в 300 раз г в течение пяти минут. Затем инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в течение 24 часов для генерации сфер.На второй день аккуратно промыть микроуэллы со средним и передать сферы в ткани обработанные шесть хорошо пластины. Поместите сферы в вращение при 37 градусах по Цельсию и измените половину среды со свежей средой каждые два-три дня. На третий-13-й день для усиления нервной индукции и преобразования в нервных прародителей с идентичностью среднего мозга, дополнить среду трехмимолярным ГСК-3-бета ингибитором.Разделите образец на две новые обработанные тканями шести хорошо пластины, чтобы уменьшить плотность сферы и избежать агрегации сферы. На восьмой день начните созревание нейронов, переключившись на новую среду с факторами роста и меняйте среду каждые два-три дня. На 21-й день поместите одну культурную пластину в один колодец новой пластины из шести хорошо и добавьте 1,2 миллилитров нервной среды созревания, используемой для нейросферной дифференциации под мембранной вставкой.Затем сместьте мембрану PTFE на вставку пластины культуры. Наконец, для создания нервного органоида, семян около 100 нейросфер в условиях воздушно-жидкого интерфейса на мембране PTFE. Остановите вращение от этого шага и меняй среду каждые два-три дня до тех пор, пока не будет достигнута требуемая точка времени дифференциации.Вот схема стандартизированного протокола для генерации дофаминергических нервных органоидов. Иммунофторесценция анализ дофаминергических нервных органоидов показано на этих изображениях указывает на TH иммунореактивных клеток coexpressing Nurr1, среднего мозга конкретных маркера. Эти два графика представляют собой кинетику экспрессии генов TH и Nurr1, оцениваемую количественным RT-PCR.Вот пример необработанных данных, записанных с платформы MEA. Каждый шип отображается вертикальной линией, в то время как оставшийся след - шум. И эта картина представляет собой нейросферу, отложенную на MEA.Эти графики показывают суперпозицию типичных шипов, обнаруженных на основе необработанных данных. Черная смелая кривая указывает на среднее значение соответствующих красных кривых. Этот сюжет raster показывает отметки времени, связанные с каждым обнаруженным всплеском.Различные цвета подчеркивают различные электроды. Эти протоколы позволяют исследователю ответить на вопрос о взаимодействии раковых клеток с нервной органоидной, а также прямой скрининг с дофаминергическим органоидом.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Utilization of Plasmonic and Photonic Crystal Nanostructures for Enhanced Micro- and Nanoparticle Manipulation

Использование плазмонных наноструктур и фотонных кристаллов для работы с улучшенными микро-и наночастиц Манипуляция

A method to manipulate the position and orientation of submicron particles nondestructively would be an incredibly useful tool for basic biological ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

Культивирование прав нервные клетки-предшественники в 3-мерном самоорганизации пептидов Гидрогель

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Endothelialized Microfluidics для изучения взаимодействий в микрососудистой гематологические заболевания

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Улучшенная способ получения человеческой клетки на основе, Связаться Модель гематоэнцефалического барьера

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Fabrication and Implantation of Miniature Dual-element Strain Gages for Measuring In Vivo Gastrointestinal Contractions in Rodents.

Fabrication and Implantation of Miniature Dual-element Strain Gages for Measuring In Vivo Gastrointestinal Contractions in Rodents.

Изготовление и Имплантация Миниатюрные Dual-элементных тензорезисторы для измерения<em&gt; В Vivo</em&gt; Желудочно Схватки в Грызунов.

Gastrointestinal dysfunction remains a major cause of morbidity and mortality. Indeed, gastrointestinal (GI) motility in health and disease remains an ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Чувствительный Обнаружение Proteopathic посев деятельности с FRET проточной цитометрии

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Microfluidic подложке для инженерных васкуляризированной ткани и Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

Человек 3D Экстраклеточная матрица-Адипоцит Культура Модель для изучения Матрица-Клеточная метаболический перекрестный разговор

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Масштабируемое поколение зрелых мозжечковых органоидов из плюрипотентных стволовых клеток человека и характеристика иммуностимулированием

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Manipulation of Single Neural Stem Cells and Neurons in Brain Slices using Robotic Microinjection

Манипуляция одиночными нервными стволовыми клетками и нейронами в ломтиках мозга с помощью роботизированной микроинъекции

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, ...