Name: preparation of mouse retinal cryo-sections for immunohistochemistry
Uploaded: 2019-07-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من خلال أموال من المعاهد القومية للصحة (RO1-GMO97327) ومؤسسة البحوث الجامعية (UPenn). نشكر سفيتلانا سافينا بشكل خاص على مساعدتها في تطوير بروتوكول الكيمياء المناعية، وغوردون روثل (جامعة بنسلفانيا) وجامعة بن فيت للتصوير الأساسي للمساعدة في الفحص المجهري وليزلي كينغ، دكتوراه للقراءة الحرجة لهذه المخطوطة .

وقد تم تنفيذ جميع الأساليب الموصوفة هنا وفقا ً صارماً للتوصيات الواردة في دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية التي قدمها معهد الموارد الحيوانية المختبرية، وقد تمت الموافقة عليها من قبل معهد لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للرعاية الحيوانية في جامعة بنسلفان...

<ol>
	<li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labelled+antigens+and+antibodies.">Labelled antigens and antibodies.</a> Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).</li><li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+antibodies+as+histochemical+tools.">Fluorescent antibodies as histochemical tools.</a> Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).</li><li>Coons, A. H., Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+antigen+in+tissue+cells;+improvements+in+a+method+for+the+detection+of+antigen+by+means+of+fluorescent+antibody.">Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody.</a> Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).</li><li>Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artefacts+in+histopathology.">Artefacts in histopathology.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).</li><li>Hartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+sections+from+Bouin-fixed+material+in+histopathology.">Frozen sections from Bouin-fixed material in histopathology.</a> Stain Technology. 20, 113 (1945).</li><li>Benerini Gatta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+alternative+fixatives+to+formalin+in+diagnostic+pathology.">Application of alternative fixatives to formalin in diagnostic pathology.</a> European Journal of Histochemistry. 56 (2), e12 (2012).</li><li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+cryoultramicrotomy+to+immunocytochemistry.">Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry.</a> Journal of Microscopy. 143 (Pt 2), 139-149 (1986).</li><li>Imai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+properties+of+rhodopsin+and+rod+function.">Molecular properties of rhodopsin and rod function.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6677-6684 (2007).</li><li>Lee, J. W., Lim, M. Y., Park, Y. S., Park, S. J., Kim, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reexamination+of+Dopaminergic+Amacrine+Cells+in+the+Rabbit+Retina:+Confocal+Analysis+with+Double-+and+Triple-labeling+Immunohistochemistry.">Reexamination of Dopaminergic Amacrine Cells in the Rabbit Retina: Confocal Analysis with Double- and Triple-labeling Immunohistochemistry.</a> Experimental Neurobiology. 26 (6), 329-338 (2017).</li><li>Bringmann, A., Grosche, A., Pannicke, T., Reichenbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+and+Glutamate+Uptake+and+Metabolism+in+Retinal+Glial+(Muller)+Cells.">GABA and Glutamate Uptake and Metabolism in Retinal Glial (Muller) Cells.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 4, 48 (2013).</li><li>Nakhai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ptf1a+is+essential+for+the+differentiation+of+GABAergic+and+glycinergic+amacrine+cells+and+horizontal+cells+in+the+mouse+retina.">Ptf1a is essential for the differentiation of GABAergic and glycinergic amacrine cells and horizontal cells in the mouse retina.</a> Development. 134 (6), 1151-1160 (2007).</li><li>Applebury, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+cone+photoreceptor:+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning.">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).</li></ol>

إن ّ تَتَحَيَمُل شبكية العين بالفأرة عملية دقيقة بسبب صغر حجم وشكل عيون الفأر وهشاشة نسيج الشبكية. على الرغم من أن إجراء تشريح عالي الجودة هو مسألة ممارسة، وجود بروتوكول مفصل، وتوفير طرق فعالة ونصائح هو ضرورة للحصول على أقسام الشبكية وIHC. بالإضافة إلى البروتوكولات الموصوفة هنا، هناك العد?...

الكيمياء المناعية (IHC) هي تقنية قوية لتوطين بروتينات محددة والهياكل الخلوية في الأنسجة في الموقع1،2،3. طرق التثبيت غير المناسبة وتقسيم دون الأمثل من الأنسجة المعقدة يمكن أن تعطل بنية الأنسجة، وتوليد تلطيخ الخلفية العالية أو يقلل من التفاعلات الأجسام المضادة- الشبه، مما يؤدي إلى تلطيخ القطع الأثرية وما يترتب على ذلك من سوء تفسير بيانات IHC4. كما شبكية العين الفقارية هو جهاز عصبي معقد ومنظم للغاية تتألف من طبقات من مستقبلات ضوئية مترابطة، interneurons والخلايا العقدية، فهي هشة جدا ويمكن أن تتعطل بسهولة أثناء التشريح والقسم. وهناك بروتوكول مفصل وموحد ومصدق عليه من تشريح العين الماوس والتوجه إلى المناعية سوف تساعد على الحد بشكل كبير من التحف IHC، وبالتالي، زيادة موثوقية النتائج والسماح لبيانات مقارنة أكثر دقة تحليل.
هناك العديد من البروتوكولات لإعداد الأنسجة لIHC، ومع ذلك، ليست كلها مناسبة للأنسجة الشبكية. المثبتات قوية مثل 10٪ الرسمية أو محلول Bouin للحفاظ على بنية الشبكية خلال تشريح وتقسيم5. لسوء الحظ، المثبتات قوية غالبا ما يؤدي إلى الفلورسنت الخلفية المحسنة وتجسد اخفاء بسبب التعديل الكيميائي لepitopes6. من ناحية أخرى، يمكن للمثبتات الأكثر اعتدالا، مثل 4% بارافورمالديهايد (PFA) تخفيف بعض هذه القطع الأثرية ولكن تتطلب تشريح دقيق وتقسيم للحفاظ على بنية شبكية العين الأمثل. PFA يخترق الأنسجة بسرعة، ولكن عبر الروابط البروتينات ببطء شديد، والحد من خطر اخفاء مثال. منذ وقت قصير PFA الحضانة هو تثبيت معتدل نسبيا، والأنسجة غالبا ما تتطلب تجميد سريع للحفاظ على المستضدات. من المهم تجنب تشكيل الكريستال الجليدي أثناء تجميد الأنسجة لأنها تشوه وتضر بسلامة الخلايا والأنسجة7.
هنا نحن نوصف بروتوكولات مفصلة وموحدة للتشريح، والتثبيت، والحماية من البرد من الكؤوس الخلفية العين الماوس التي تسفر عن بيانات IHC متسقة وموثوق بها.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1128px;" width="1129">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm)</td>
			<td style="width:209px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#MA-48</td>
			<td style="width:365px;">For liquid nitrogen (Figure 1E)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Aluminum foil&#160;</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Cauterizer&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Bovie</td>
			<td style="width:236px;">#AA01</td>
			<td style="width:365px;">To mark eye orientation (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:236px;">#72703-D</td>
			<td style="width:365px;">For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#15002-08</td>
			<td style="width:365px;">To circumferentially cut the cornea (Figure 1B)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Dental wax-coated 35mm dissection dish</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">For eye cup dissection (Figure 1C)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Dissecting microscope&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Leica, Houston, USA&#160;</td>
			<td style="width:236px;">MZ12.5 High-performance stereomicroscope</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Micro Knives - Plastic Handle&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#10315-12</td>
			<td style="width:365px;">To make a small incision at the burn mark (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Pink dental wax&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#72660</td>
			<td style="width:365px;">For coating dissection dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Slide Rack and Coverplate</td>
			<td style="width:209px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:236px;">#36107</td>
			<td style="width:365px;">For retinal IHC (Figure 1G)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Stainless Steel Beaker (89 x 114mm)</td>
			<td style="width:209px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#MA-40</td>
			<td style="width:365px;">For isopentane bath (Figure 1E)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Styrofoam box</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">For insulated cooler</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Thin forceps Dumont #5&#160;&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#11254-20</td>
			<td style="width:365px;">To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Tissue-Tek cryomold&#160; (10mm x 10mm x 5mm)</td>
			<td style="width:209px;">Electron Miscroscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#62534-10</td>
			<td style="width:365px;">Mold for OCT embedding</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Buffers and Reagents</td>
			<td style="width:209px;">Company</td>
			<td style="width:236px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:365px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Blocking solution</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="77">
			<td height="77" style="height:77px;width:317px;">Gelvatol (anti-fading mounting media)</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).&#160; Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops).&#160; Store in amber drop bottle at 4&#176;C&#160; (8).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Hoechst 33342 1000x Stock</td>
			<td style="width:209px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:236px;">#62249</td>
			<td style="width:365px;">1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4&#176;C for up to 1 year or at -20&#176;C for long term storage. Prepare fresh&#160; at 1 ug/mL (1x)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Isopentane, 99%&#160;</td>
			<td style="width:209px;">GFS Chemicals</td>
			<td style="width:236px;">#2961</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:317px;">Paraformaldehyde (PFA) in PBS</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#15710</td>
			<td style="width:365px;">Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4&#176;C in the dark.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:317px;">Permeabilization solution</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.&#160; Prepare fresh.</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:317px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:209px;">Bioworld&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#41620015-20</td>
			<td style="width:365px;">0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.&#160; Prepared from 10x stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Sucrose solutions</td>
			<td style="width:209px;">Fisher Scientific&#160;&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#S-5-500</td>
			<td style="width:365px;">Dissolve the appropriate amount of sucrose in&#160; 37&#176;C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4&#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Tissue-Tek OCT-compound&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Sakura</td>
			<td style="width:236px;">&#160;#4583</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Antibodies</td>
			<td style="width:209px;">Company</td>
			<td style="width:236px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:365px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-calbindin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8666</td>
			<td>To label horinzotal cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-GAD65</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB5082</td>
			<td>To label GABAergic amacrine cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-GS</td>
			<td>BD Transduction</td>
			<td>610517</td>
			<td>To label M&#252;ller cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-rhodopsin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5316</td>
			<td>To label rods</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of mouse retinal cryo-sections for immunohistochemistry

يعد إعداد أقسام عين الفأر عالية الجودة للكيمياء المناعية (IHC) أمرًا بالغ الأهمية لتقييم بنية شبكية العين ووظيفتها وتحديد الآليات الكامنة وراء أمراض الشبكية. الحفاظ على السلامة الهيكلية في جميع أنحاء إعداد الأنسجة أمر حيوي للحصول على بيانات IHC الشبكية القابلة للاستنساخ ولكن يمكن أن يكون تحديا بسبب هشاشة وتعقيد الهندسة الشبكية السيتوالية. المثبتات قوية مثل 10% formalin أو محلول Bouin الحفاظ على الأمثل بنية الشبكية, أنها غالباً ما تعوق تحليل IHC عن طريق تعزيز الفلورسنت الخلفية و / أو تقليل التفاعلات الأجسام المضادة-epitope, عملية تعرف باسم تجسيد اخفاء. المثبتات أكثر اعتدالا، من ناحية أخرى، مثل 4٪ بارافورمالديهايد، ويقلل من الفلورسنت الخلفية ومثال اخفاء، يجب استخدام تقنيات التشريح الدقيق للحفاظ على بنية الشبكية. في هذه المقالة، نقدم طريقة شاملة لإعداد أكواب خلفية العين الماوس لIHC التي هي كافية للحفاظ على معظم التفاعلات الأجسام المضادة-الشبه دون فقدان السلامة الهيكلية الشبكية. نحن تشمل IHC تمثيلية مع الأجسام المضادة لمختلف علامات نوع الخلية الشبكية لتوضيح الحفاظ على الأنسجة والتوجه في ظل الظروف المثلى ودون الأمثل. هدفنا هو تحسين الدراسات IHC من شبكية العين من خلال توفير بروتوكول كامل من تشريح الكأس الخلفي العين يالأيه.

لتوضيح كيفية هذه البروتوكولات، وضمان الحفاظ على الشبكية الأمثل لIHC، ونحن التحقيق أقسام الشبكية من الفئران P28 WT (C57BL/6N) مع الأجسام المضادة لرودوبسين (علامة مستقبلات ضوئية) 8، حمض الجلوتاميك decarboxylase 65 (Gad65، خلية amacrine علامة)9، غلوتامين سينثتاز (GS، علام...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry at JoVE.com

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

يصف هذا التقرير الطرق الشاملة لإعداد أقسام شبكية العين المجمدة للكيمياء المناعية (IHC). وتشمل الأساليب الموصوفة تشريح كوب العين الخلفي، تثبيت البارافورمالديهايد، وتضمينها في درجة الحرارة القطع الأمثل (OCT) وسائل الإعلام واتجاه الأنسجة، وتقسيم ومناعة.

إعداد المقطعين الماهيينيات في شبكية العين للكيمياء المناعية

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

تشريح الشبكية الماوس هو عملية حساسة حقا نظرا لحجم وشكل العينين وهشاشة قسم الشبكية. ضرورة الممارسة، وجود بروتوكول مفصل التي توفر طريقة فعالة ونصائح هو المفتاح لتشريح شبكية العين عالية الجودة والقسم. نحن نقدم نصائح ونصائح لمساعدة الباحث على تجنب المزالق المشتركة والحصول على بعض أقسام شبكية العين عالية الجودة مناسبة للكيمياء المناعية.وضع علامة على الجزء الزمني من عين فأر القتل الرحيم باستخدام الكي الذيل عن طريق لمس القرنية بخفة ولا تزيد عن جزء من الثانية لحرق القرنية قليلا وتجنب إحداث ثقب. مباشرة بعد أن استخدم المنحني دومون 545 ملقط لـ enucleate عيون الماوس. ضع العينين في 1.5 ملليلتر على 1 ملم مع ملليلتر واحد من 4٪ PFA و PBS واحتضان لمدة 15 دقيقة على الجليد.ثم، نقل العينين ثابتة باستخدام ملقط 545 دوبون المنحنية إلى تعديل 35 ملليمتر تشريح طبق مليئة PBS ومكان تحت المجهر تشريح. استخدام microknife لجعل شق صغير في علامة الحرق عمودي على وفوق الحدود المتلخوة للقرنية. إدراج مقص منحني في شق وتنفيذ قطع ظرفي من القرنية التالية limbus.ثم، باستخدام رقيقة دومون 5 ملقط، وإزالة القرنية، واستخراج العدسة، ورفعه بدقة بعيدا عن الجزء الخلفي من العين. سيخرج الجسم الزجاجي بالعدسة وستكون الشبكية مرئية كسطح أبيض يغطي داخل كأس العين الخلفية. اغسلي أكواب العين المعزولة مرتين في ملليلتر واحد من PBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.لحماية أكواب العين، وايكوليبيلات لهم في 15٪ السكروز وبرنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية حتى أنها تغرق. ثم نقل أكواب العين إلى 30٪ السكروز وبرنامج تلفزيوني لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات حتى تغرق. ضع أكواب العين في OCT في 10 من 10 ملليمتر قوالب كريو لتضمينها.تحت مجهر تشريح، وتوجيه العين في قالب التبريد على طول محوره البطني الظهري عن طريق تدوير العين حتى علامة الحرق على القمة. العصب البصري هو واحد من اليسار وقطع جزء من القالب يواجه الحق. لتجميد نسيج الشبكية، غمر قالب البرد لمدة خمس دقائق على الأقل في كوب معدني يحتوي على إيسوبنتان ثم ضع الأكفر في النيتروجين السائل حتى ثلث ارتفاع الأكواب.إزالة كتلة المجمدة، والتفاف عليه في رقائق الألومنيوم، وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية. استخدم القلم أو Sharpie لوضع علامة على الكتلة المجمدة لتسجيل اتجاهها. بعد ضبط درجة حرارة التبريد بين ناقص 20 وناقص 25 درجة مئوية، ضع القوالب التي تحتوي على أكواب العين المدمجة داخل وتسمح لهم بتسوية درجة حرارة التبريد لمدة ساعة واحدة.تثبيت كتلة في cryostat مع الاتجاه البطني الظهرية والبدء في قطع 10 ميكرومتر سميكة المقاطع المسلسل. ضع أقسام الشبكية بعناية على شرائح المجهر المشروحة والمرقمة ثم قم بتخزينها في صناديق الشرائح عند ناقص 20 درجة مئوية أو ناقص 80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للمناعة. الكيمياء المناعية مع الأجسام المضادة لرودودبسين، علامة مستقبلات ضوئية، حمض الجلوتاميك ديكاربوكسيلاز 65، وعلامة خلية الأكاكرين، وغلوتامين سينفتاز وعلامة خلية مولر، وcalbindin، تم تنفيذ علامة الخلية الأفقية على أقسام الشبكية.وتشير النتائج إلى أن هذا البروتوكول ينتج عالية الجودة والحفاظ على أقسام شبكية العين بشكل جيد على عكس في أقسام شبكية العين ذات نوعية رديئة التي تم الحصول عليها من بروتوكول مختلف. 4- وتبقى الشرائح الداخلية والخارجية الغنية من الرودوبسين عمودية وسليمة مع القليل من الانفصال عن الظهارة المصطبغة في شبكية العين. وتبقى الـ Interneurons، مثل خلايا amacrine الإيجابية Gad65، طبقية بشكل صحيح داخل الطبقة النووية الداخلية وطبقة شبكية داخلية.أيضا، خلايا مولر تبقى محفوظة بشكل جيد مع سوما الانحياز بشكل صحيح في العمليات السيتوبلازمية التي تمتد من طبقة خلية العقدة إلى الطبقة النووية الخارجية. وعلاوة على ذلك، يمكن الكشف عن الخلايا الأفقية المحددة جيداً في الطبقة النووية الداخلية وحدود الطبقة الضبيقية الخارجية. من المهم وضع علامة على منطقة الـ topper للعيون والحفاظ على التوجه أثناء التضمين.دائماً إعداد شبهformaldehyde تحت غطاء محرك السيارة مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

إعداد أنسجة المخ فأرة للالميكروسكوب Immunoelectron

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

تسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا العصبية في الشبكية ماوس إعداد غامق تكييفها شريحة

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

لإعداد متفرقة الشبكية إلى سجل الاستجابة الخفيفة وراثيا من إعتبر خلايا الشبكية العقدة

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

تشريح العين ماوس لجبل الجامعة للصبغات الظهارة الشبكية

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

إعداد أنسجة المخ الرئيسيات غير البشرية لمرحلة ما قبل تضمين المناعية والمجهر الإلكتروني

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

التصوير المقطعي التماسك البصري: التصوير الماوس العقدة الشبكية خلايا في فيفو

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Optimization of the Retinal Vein Occlusion Mouse Model to Limit Variability

تحسين نموذج ماوس انسداد الوريد الشبكي للحد من التباين

Mouse models of retinal vein occlusion (RVO) are often used in ophthalmology to study hypoxic-ischemic injury in the neural retina. In this report, a ...

Mouse Retina Isolation and Methanol Treatment for Studying Retinal Ganglion Cells

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells (Video) | JoVE 

تحضير كامل قائم على الميثانول لفحص خلايا العقدة الشبكية

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...

Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry

الكشف عن بروتين البريون غير الطبيعي بواسطة الكيمياء الهيستولوجية المناعية

Abnormal prion proteins (PrPSc) are the disease-associated isoform of cellular prion protein and diagnostic markers of transmissible spongiform ...

Mouse Retina OCT Fibergram Alignment with Confocal Images

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

Advancements in In Vivo and Ex Vivo Retinal Imaging for Improved Glaucoma Diagnosis and Treatment (Video) | JoVE

محاذاة الألياف المقطعية للتماسك البصري للضوء المرئي مع الصور متحدة البؤر لشبكية العين للماوس نفسه

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...