Name: preparation of mouse retinal cryo-sections for immunohistochemistry
Uploaded: 2019-07-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af midler fra NIH (RO1-GMO97327) og universitetets forskningsfond (UPenn). Vi takker især Svetlana Savina for hendes hjælp med at udvikle Immunhistokemi protokollen, Gordon Ruthel (University of Pennsylvania) og Penn vet Imaging Core for hjælp med mikroskopi og Leslie King, Ph.D. for kritisk læsning dette manuskript .

Alle metoder, der er beskrevet her, blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i National Institutes of Health guide for pleje og brug af forsøgsdyr fra Instituttet for Laboratoriedyrs ressourcer og blev godkendt af Institutionel dyrepleje og brug udvalg ved University of Pennsylvania.
Alle værktøjer og udstyr til metoderne er vist i figur 1 og opført i tabellen over materialer.
1. Mus øje enucleation, ...

<ol>
	<li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labelled+antigens+and+antibodies.">Labelled antigens and antibodies.</a> Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).</li><li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+antibodies+as+histochemical+tools.">Fluorescent antibodies as histochemical tools.</a> Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).</li><li>Coons, A. H., Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+antigen+in+tissue+cells;+improvements+in+a+method+for+the+detection+of+antigen+by+means+of+fluorescent+antibody.">Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody.</a> Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).</li><li>Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artefacts+in+histopathology.">Artefacts in histopathology.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).</li><li>Hartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+sections+from+Bouin-fixed+material+in+histopathology.">Frozen sections from Bouin-fixed material in histopathology.</a> Stain Technology. 20, 113 (1945).</li><li>Benerini Gatta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+alternative+fixatives+to+formalin+in+diagnostic+pathology.">Application of alternative fixatives to formalin in diagnostic pathology.</a> European Journal of Histochemistry. 56 (2), e12 (2012).</li><li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+cryoultramicrotomy+to+immunocytochemistry.">Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry.</a> Journal of Microscopy. 143 (Pt 2), 139-149 (1986).</li><li>Imai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+properties+of+rhodopsin+and+rod+function.">Molecular properties of rhodopsin and rod function.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6677-6684 (2007).</li><li>Lee, J. W., Lim, M. Y., Park, Y. S., Park, S. J., Kim, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reexamination+of+Dopaminergic+Amacrine+Cells+in+the+Rabbit+Retina:+Confocal+Analysis+with+Double-+and+Triple-labeling+Immunohistochemistry.">Reexamination of Dopaminergic Amacrine Cells in the Rabbit Retina: Confocal Analysis with Double- and Triple-labeling Immunohistochemistry.</a> Experimental Neurobiology. 26 (6), 329-338 (2017).</li><li>Bringmann, A., Grosche, A., Pannicke, T., Reichenbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+and+Glutamate+Uptake+and+Metabolism+in+Retinal+Glial+(Muller)+Cells.">GABA and Glutamate Uptake and Metabolism in Retinal Glial (Muller) Cells.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 4, 48 (2013).</li><li>Nakhai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ptf1a+is+essential+for+the+differentiation+of+GABAergic+and+glycinergic+amacrine+cells+and+horizontal+cells+in+the+mouse+retina.">Ptf1a is essential for the differentiation of GABAergic and glycinergic amacrine cells and horizontal cells in the mouse retina.</a> Development. 134 (6), 1151-1160 (2007).</li><li>Applebury, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+cone+photoreceptor:+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning.">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).</li></ol>

Mus nethinde dissektion er en delikat proces på grund af den lille størrelse og form af mus øjne og skrøbelighed af retinale væv. Selv om udførelsen af høj kvalitet dissektion er et spørgsmål om praksis, at have en detaljeret protokol, der giver effektive metoder og tips er en nødvendighed for at få nethinde sektioner og IHC. Ud over de protokoller, der er beskrevet her, er der flere tips, der giver mulighed for ensartede retinal sektioner af høj kvalitet, der egner sig til reproducerbare IHC.
<p class="j...

Immunohistochemistry (IHC) er en kraftfuld teknik til lokalisering af specifikke proteiner og cellulære strukturer i væv in situ1,2,3. Uhensigtsmæssige fikserings metoder og sub-optimale sektionering af komplekst væv kan forstyrre vævs strukturen, generere høj baggrunds farvning eller mindske antistof-epitope interaktioner, hvilket resulterer i farvning artefakter og deraf følgende fejlfortolkning af IHC-data4. Som hvirveldyr nethinden er en kompleks og meget organiseret neurale organ bestående af lag af indbyrdes forbundne fotoceller, interneuroner og ganglion cells, det er meget skrøbelig og kan let afbrydes under dissektion og skæring. En detaljeret, standardiseret og valideret protokol fra muse øje dissektion og orientering til immun farvning vil bidrage til at reducere IHC artefakter, derved øge pålideligheden af resultaterne og giver mulighed for mere præcise sammenlignende data Analyse.
Der er mange protokoller for vævs forberedelse til IHC, men ikke alle er egnet til retinale væv. Stærke fixativer som 10% formalin eller Bouin opløsning bevare retinale struktur under dissektion og skæring5. Desværre fører stærke fiktioner ofte til den forbedrede baggrunds fluorescens og epitop maskering på grund af den kemiske modifikation af epitoper6. På den anden side, mildere fixatives, ligesom 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) kan lindre nogle af disse artefakter, men kræver omhyggelig dissektion og skæring for at bevare den optimale retinale struktur. PFA trænger hurtigt ind i vævet, men cross-links proteiner meget langsomt, hvilket reducerer risikoen for epitop maskering. Da kort tid PFA inkubation er en relativt mild fiksering, væv ofte kræver hurtig frysning for at bevare antigener. Det er vigtigt at undgå iskrystal dannelse under vævs frysning, da de forvrænger og skader integriteten af celler og væv7.
Her beskriver vi detaljerede og standardiserede protokoller for dissektion, fiksering, og Cryo-beskyttelse af mus okulære posterior kopper, der giver konsistente og pålidelige IHC data.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1128px;" width="1129">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm)</td>
			<td style="width:209px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#MA-48</td>
			<td style="width:365px;">For liquid nitrogen (Figure 1E)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Aluminum foil&#160;</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Cauterizer&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Bovie</td>
			<td style="width:236px;">#AA01</td>
			<td style="width:365px;">To mark eye orientation (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:236px;">#72703-D</td>
			<td style="width:365px;">For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#15002-08</td>
			<td style="width:365px;">To circumferentially cut the cornea (Figure 1B)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Dental wax-coated 35mm dissection dish</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">For eye cup dissection (Figure 1C)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Dissecting microscope&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Leica, Houston, USA&#160;</td>
			<td style="width:236px;">MZ12.5 High-performance stereomicroscope</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Micro Knives - Plastic Handle&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#10315-12</td>
			<td style="width:365px;">To make a small incision at the burn mark (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Pink dental wax&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#72660</td>
			<td style="width:365px;">For coating dissection dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Slide Rack and Coverplate</td>
			<td style="width:209px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:236px;">#36107</td>
			<td style="width:365px;">For retinal IHC (Figure 1G)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Stainless Steel Beaker (89 x 114mm)</td>
			<td style="width:209px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#MA-40</td>
			<td style="width:365px;">For isopentane bath (Figure 1E)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Styrofoam box</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">For insulated cooler</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Thin forceps Dumont #5&#160;&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#11254-20</td>
			<td style="width:365px;">To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Tissue-Tek cryomold&#160; (10mm x 10mm x 5mm)</td>
			<td style="width:209px;">Electron Miscroscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#62534-10</td>
			<td style="width:365px;">Mold for OCT embedding</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Buffers and Reagents</td>
			<td style="width:209px;">Company</td>
			<td style="width:236px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:365px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Blocking solution</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="77">
			<td height="77" style="height:77px;width:317px;">Gelvatol (anti-fading mounting media)</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).&#160; Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops).&#160; Store in amber drop bottle at 4&#176;C&#160; (8).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Hoechst 33342 1000x Stock</td>
			<td style="width:209px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:236px;">#62249</td>
			<td style="width:365px;">1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4&#176;C for up to 1 year or at -20&#176;C for long term storage. Prepare fresh&#160; at 1 ug/mL (1x)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Isopentane, 99%&#160;</td>
			<td style="width:209px;">GFS Chemicals</td>
			<td style="width:236px;">#2961</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:317px;">Paraformaldehyde (PFA) in PBS</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#15710</td>
			<td style="width:365px;">Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4&#176;C in the dark.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:317px;">Permeabilization solution</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.&#160; Prepare fresh.</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:317px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:209px;">Bioworld&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#41620015-20</td>
			<td style="width:365px;">0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.&#160; Prepared from 10x stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Sucrose solutions</td>
			<td style="width:209px;">Fisher Scientific&#160;&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#S-5-500</td>
			<td style="width:365px;">Dissolve the appropriate amount of sucrose in&#160; 37&#176;C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4&#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Tissue-Tek OCT-compound&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Sakura</td>
			<td style="width:236px;">&#160;#4583</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Antibodies</td>
			<td style="width:209px;">Company</td>
			<td style="width:236px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:365px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-calbindin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8666</td>
			<td>To label horinzotal cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-GAD65</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB5082</td>
			<td>To label GABAergic amacrine cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-GS</td>
			<td>BD Transduction</td>
			<td>610517</td>
			<td>To label M&#252;ller cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-rhodopsin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5316</td>
			<td>To label rods</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of mouse retinal cryo-sections for immunohistochemistry

Forberedelse af høj kvalitet muse øje sektioner for Immunhistokemi (IHC) er afgørende for at vurdere den retinale struktur og funktion og til bestemmelse af de mekanismer, der underliggende retinale sygdomme. Opretholdelse af strukturel integritet i hele vævs præparatet er afgørende for at opnå reproducerbare retinale IHC-data, men kan være udfordrende på grund af den skrøbelige og komplekse nethinde cytoarkitektur. Stærke fiktioner som 10% formalin eller Bouin løsning optimalt bevare den retinale struktur, de ofte hæmmer IHC analyse ved at øge baggrunden fluorescens og/eller aftagende antistof-epitop interaktioner, en proces kendt som epitop maskering. Mildere fikser, på den anden side, som 4% PARAFORMALDEHYD, reducerer baggrunds fluorescens og epitope-maskering, omhyggelig dissektions teknikker skal udnyttes til at bevare den retinale struktur. I denne artikel præsenterer vi en omfattende metode til at forberede muse okulære posterior kopper til IHC, der er tilstrækkelig til at bevare de fleste antistof-epitope interaktioner uden tab af retinal strukturel integritet. Vi medtager repræsentative IHC med antistoffer mod forskellige retinale celletype markører for at illustrere vævs konservering og-orientering under optimale og suboptimale forhold. Vores mål er at optimere IHC undersøgelser af nethinden ved at give en komplet protokol fra okulær posterior kop dissektion til IHC.

For at illustrere, hvordan disse protokoller, sikre optimal retinal konservering for IHC, vi probed nethinde sektioner fra P28 WT mus (C57BL/6N) med antistoffer til rhodopsin (en fotocelle markør)8, glutaminsyre decarboxylase 65 (Gad65, en amacrine celler markør)9, Glutamin SYNTETASE (GS, en Müller cellemarkør)10, og calbindin (en vandret cellemarkør)11 (figur 4</stron...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry at JoVE.com

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Denne rapport beskriver omfattende metoder til at forberede frosne mus nethinden sektioner for Immunhistokemi (IHC). Beskrevne metoder omfatter dissektion af okulær posterior kop, PARAFORMALDEHYD fiksering, indlejring i optimal skæring temperatur (OCT) medier og vævs orientering, skæring og immun farvning.

Klargøring af muse retinale Cryo-sektioner til immun histokemi

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Mus retinal dissektion er en virkelig delikat proces på grund af størrelsen og formen af øjnene og skrøbelighed nethinden sektion. Bydende nødvendigt at praksis, der har en detaljeret protokol, der giver effektiv metode og tips er nøglen til høj kvalitet retinal dissektion og sektion. Vi giver tips og råd til at hjælpe forsker undgå fælles faldgrube og få nogle høj kvalitet retinal sektioner egnet til immunohistochemistry.Mark den tidsmæssige del af øjet af en aflivet mus ved hjælp af en hale cauterizer ved at røre hornhinden meget let og for ikke mere end et splitsekund til lidt brænde hornhinden og undgå at lave et hul. Umiddelbart efter, at der anvendes buede Dumont 545 kraftveser til at fremkalde museøjne. Ansluder øjnene i en 1,5 milliliter kryotube med en milliliter 4% PFA og PBS og inkuberes i 15 minutter på is.Derefter overføres de faste øjne ved hjælp af de buede Dumont 545-snævninger til en modificeret 35 millimeter dissektionsskål fyldt med PBS og sted under dissekere mikroskop. Brug en microknife til at lave et lille snit ved brændemærket vinkelret på og lige over limbus grænsen af hornhinden. Indsæt buet saks i snittet og udføre en omkreds snit af hornhinden efter limbus.Derefter, ved hjælp af tynde Dumont 5 stæt, fjerne hornhinden, udtrække linsen, og løft det forsigtigt væk fra den bageste del af øjet. Den glasagtige krop vil komme ud med linsen og nethinden vil være synlig som en hvid overflade, der dækker indersiden af den bageste øjenkop. De isolerede øjenkopper vaskes to gange i en milliliter PBS i 10 minutter ved stuetemperatur.For at kryo-beskytte øjet kopper, ligevægt dem i 15% saccharose og PBS natten over ved fire grader Celsius, indtil de synker. Derefter overføre øjet kopper til 30% saccharose og PBS i to til tre timer, indtil de synker. Placer øjet kopper i OCT i 10 af 10 millimeter kryo-forme til indlejring.Under et dissekerende mikroskop, orientere øjet i kryo-skimmel langs sin dorsale ventrale akse ved at dreje øjet, indtil brænde mærket er på toppen. Synsnerven er en venstre og skåret ud del af formen vender højre. For at fastgøre fryse retinal væv, nedsænke kryo-mug i mindst fem minutter i et metalbæger, der indeholder isopentan og derefter placere bægerglasset i flydende nitrogen op til en tredjedel af højden af bægerglasset.Fjern den frosne blok, pak den ind i aluminiumsfolie, og gem på minus 80 grader Celsius. Brug en pen eller Sharpie til at markere den frosne blok til at registrere dens retning. Efter justering af kryostattemperaturen mellem minus 20 og minus 25 grader Celsius, skal formene indeholdende de indlejrede øjenkopper indeni og give dem mulighed for at ligevægtere til kryostattemperaturen i en time.Monter blokken i kryostaten med den dorsale ventrale orientering og begynde at skære 10 mikrometer tykke serielle sektioner. Forsigtigt placere retinale sektioner på kommenterede og nummererede mikroskop dias og derefter opbevares i slide kasser på minus 20 grader Celsius eller minus 80 grader Celsius indtil klar til immunstaining. Immunohistochemistry med antistoffer mod rhodopsin, en fotoreceptormarkør, glutaminsyre decarboxylase 65 og amakrine cellemarkør, glutaminsyntetase og Muller cellemarkør, og calbindin, en vandret cellemarkør blev udført på retinale sektioner.Resultaterne viser, at denne protokol giver høj kvalitet og velbevarede retinale sektioner i modsætning til i dårlig kvalitet retinale sektioner opnået fra en anden protokol. Rhodopsin rige indre og ydre segmenter forbliver lodret og intakt med lidt at ingen adskillelse fra overliggende retinale pigmenterede epitel. Interneurons, såsom Gad65 positive amacrine celler, forbliver korrekt stratificeret inden for det indre nukleare lag og indre plexiform lag.Muller celler forbliver også godt bevaret med soma korrekt justeret i cytoplasmatiske processer, der spænder fra ganglion cellelag til det ydre nukleare lag. Desuden kan veldefinerede vandrette celler detekteres ved det indre nukleare lag og den ydre plexiformslagkant. Det er vigtigt at markere topper regionen af øjnene og holde orientering under indlejring.Præsentaner altid paraformaldehyd under kølerhjelmen med passende personlige værnemidler.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Udarbejdelse af ikke-menneskelig primat Brain Tissue til Pre-indlejring Immunohistokemi og Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optisk kohærens tomografi: Imaging mus Retinal Ganglion celler In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Optimization of the Retinal Vein Occlusion Mouse Model to Limit Variability

Optimering af musemodellen med retinal veneokklusion for at begrænse variabilitet

Mouse models of retinal vein occlusion (RVO) are often used in ophthalmology to study hypoxic-ischemic injury in the neural retina. In this report, a ...

Mouse Retina Isolation and Methanol Treatment for Studying Retinal Ganglion Cells

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells (Video) | JoVE 

Methanolbaseret helmonteret forberedelse til undersøgelse af retinale ganglionceller

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...

Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry

Påvisning af unormalt prionprotein ved immunhistokemi

Abnormal prion proteins (PrPSc) are the disease-associated isoform of cellular prion protein and diagnostic markers of transmissible spongiform ...

Mouse Retina OCT Fibergram Alignment with Confocal Images

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

Advancements in In Vivo and Ex Vivo Retinal Imaging for Improved Glaucoma Diagnosis and Treatment (Video) | JoVE

Justering af optisk kohærenstomografi i synligt lys med konfokale billeder af samme musenethinde

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...