Name: preparation of mouse retinal cryo-sections for immunohistochemistry
Uploaded: 2019-07-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door fondsen van NIH (RO1-GMO97327) en de Universitaire Stichting van het onderzoek (UPenn). Wij danken Svetlana Savina vooral voor haar hulp bij de ontwikkeling van het Immunohistochemistry protocol, Gordon Ruthel (University of Pennsylvania) en de Penn vet Imaging Core voor hulp bij microscopie en Leslie King, Ph.D. voor kritisch lezen van dit manuscript .

Alle hier beschreven methoden werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de nationale instituten van de gezondheidsgids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren die door het Instituut voor laboratorium dierlijke hulpbronnen en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en het gebruik Comite van de Universiteit van Pennsylvania.
Alle gereedschappen en apparatuur voor de methoden worden weergegeven in Figuur 1 en vermeld ...

<ol>
	<li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labelled+antigens+and+antibodies.">Labelled antigens and antibodies.</a> Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).</li><li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+antibodies+as+histochemical+tools.">Fluorescent antibodies as histochemical tools.</a> Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).</li><li>Coons, A. H., Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+antigen+in+tissue+cells;+improvements+in+a+method+for+the+detection+of+antigen+by+means+of+fluorescent+antibody.">Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody.</a> Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).</li><li>Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artefacts+in+histopathology.">Artefacts in histopathology.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).</li><li>Hartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+sections+from+Bouin-fixed+material+in+histopathology.">Frozen sections from Bouin-fixed material in histopathology.</a> Stain Technology. 20, 113 (1945).</li><li>Benerini Gatta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+alternative+fixatives+to+formalin+in+diagnostic+pathology.">Application of alternative fixatives to formalin in diagnostic pathology.</a> European Journal of Histochemistry. 56 (2), e12 (2012).</li><li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+cryoultramicrotomy+to+immunocytochemistry.">Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry.</a> Journal of Microscopy. 143 (Pt 2), 139-149 (1986).</li><li>Imai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+properties+of+rhodopsin+and+rod+function.">Molecular properties of rhodopsin and rod function.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6677-6684 (2007).</li><li>Lee, J. W., Lim, M. Y., Park, Y. S., Park, S. J., Kim, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reexamination+of+Dopaminergic+Amacrine+Cells+in+the+Rabbit+Retina:+Confocal+Analysis+with+Double-+and+Triple-labeling+Immunohistochemistry.">Reexamination of Dopaminergic Amacrine Cells in the Rabbit Retina: Confocal Analysis with Double- and Triple-labeling Immunohistochemistry.</a> Experimental Neurobiology. 26 (6), 329-338 (2017).</li><li>Bringmann, A., Grosche, A., Pannicke, T., Reichenbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+and+Glutamate+Uptake+and+Metabolism+in+Retinal+Glial+(Muller)+Cells.">GABA and Glutamate Uptake and Metabolism in Retinal Glial (Muller) Cells.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 4, 48 (2013).</li><li>Nakhai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ptf1a+is+essential+for+the+differentiation+of+GABAergic+and+glycinergic+amacrine+cells+and+horizontal+cells+in+the+mouse+retina.">Ptf1a is essential for the differentiation of GABAergic and glycinergic amacrine cells and horizontal cells in the mouse retina.</a> Development. 134 (6), 1151-1160 (2007).</li><li>Applebury, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+cone+photoreceptor:+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning.">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).</li></ol>

Muis Retina dissectie is een delicaat proces te wijten aan de kleine omvang en de vorm van muis ogen en de kwetsbaarheid van het netvlies weefsel. Hoewel het uitvoeren van kwalitatief hoogwaardige dissectie is een kwestie van de praktijk, met een gedetailleerd protocol, het verstrekken van efficiënte methoden en tips is een noodzaak om het netvlies secties en IHC te verkrijgen. In aanvulling op de hier beschreven protocollen, zijn er verschillende tips die het mogelijk maken voor een consistente hoge kwaliteit netvlies ...

Immunohistochemistry (IHC) is een krachtige techniek voor het lokaliseren van specifieke eiwitten en cellulaire structuren in weefsels in situ1,2,3. Ongepaste fixatie methoden en sub-optimale afdeling van complexe weefsels kan verstoren weefselstructuur, het genereren van hoge achtergrond vlekken of te verminderen antilichaam-epitope interacties, wat resulteert in vlekken artefacten en daaruit voortvloeiende verkeerde interpretatie van IHC gegevens4. Als de gewervelde Retina is een complex en zeer georganiseerd neuraal orgaan bestaat uit lagen van onderling verbonden fotoreceptoren, interneuronen en ganglioncellen, het is zeer kwetsbaar en kan gemakkelijk worden verstoord tijdens de dissectie en de sectie. Een gedetailleerd, gestandaardiseerd, en gevalideerd Protocol van muis oog dissectie en oriëntatie naar immunokleuring zal helpen aanzienlijk verminderen IHC artefacten, waardoor de betrouwbaarheid van de resultaten en waardoor meer accurate vergelijkende gegevens Analyse.
Er zijn vele protocollen voor weefsel voorbereiding voor IHC, echter, niet zijn allen geschikt voor netvlies weefsel. Sterke Fixatieven zoals 10% formaline of de oplossing van Bouin behouden de netvlies structuur tijdens dissectie en sectioning5. Helaas, sterke Fixatieven vaak leiden tot de versterkte achtergrond fluorescentie en epitope masking als gevolg van de chemische modificatie van epitopes6. Aan de andere kant, mildere Fixatieven, net als 4% Paraformaldehyde (toppunt) kan verlichten sommige van deze artefacten, maar vereisen nauwgezette dissectie en het delen van de optimale retinale structuur te behouden. Het snel doordringen van het gaasweefsel, maar dwars-verbindingen proteïnen zeer langzaam, verminderend het risico van epitope masking. Sinds korte tijd is de incubatie van het middel een vrij milde fixatie, vereisen de weefsels vaak het snelle bevriezen om antigenen te bewaren. Het is belangrijk om te voorkomen dat ijs kristalvorming tijdens het bevriezen van weefsels als ze vervormen en beschadiging van de integriteit van cellen en weefsels7.
Hier beschrijven we gedetailleerde en gestandaardiseerde protocollen voor dissectie, fixatie, en Cryo-bescherming van de muis oculaire achterste cups die consistente en betrouwbare IHC gegevens opleveren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1128px;" width="1129">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm)</td>
			<td style="width:209px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#MA-48</td>
			<td style="width:365px;">For liquid nitrogen (Figure 1E)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Aluminum foil&#160;</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Cauterizer&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Bovie</td>
			<td style="width:236px;">#AA01</td>
			<td style="width:365px;">To mark eye orientation (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:236px;">#72703-D</td>
			<td style="width:365px;">For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#15002-08</td>
			<td style="width:365px;">To circumferentially cut the cornea (Figure 1B)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Dental wax-coated 35mm dissection dish</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">For eye cup dissection (Figure 1C)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Dissecting microscope&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Leica, Houston, USA&#160;</td>
			<td style="width:236px;">MZ12.5 High-performance stereomicroscope</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Micro Knives - Plastic Handle&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#10315-12</td>
			<td style="width:365px;">To make a small incision at the burn mark (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Pink dental wax&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#72660</td>
			<td style="width:365px;">For coating dissection dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Slide Rack and Coverplate</td>
			<td style="width:209px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:236px;">#36107</td>
			<td style="width:365px;">For retinal IHC (Figure 1G)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Stainless Steel Beaker (89 x 114mm)</td>
			<td style="width:209px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#MA-40</td>
			<td style="width:365px;">For isopentane bath (Figure 1E)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Styrofoam box</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">For insulated cooler</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Thin forceps Dumont #5&#160;&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#11254-20</td>
			<td style="width:365px;">To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Tissue-Tek cryomold&#160; (10mm x 10mm x 5mm)</td>
			<td style="width:209px;">Electron Miscroscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#62534-10</td>
			<td style="width:365px;">Mold for OCT embedding</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Buffers and Reagents</td>
			<td style="width:209px;">Company</td>
			<td style="width:236px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:365px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Blocking solution</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="77">
			<td height="77" style="height:77px;width:317px;">Gelvatol (anti-fading mounting media)</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).&#160; Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops).&#160; Store in amber drop bottle at 4&#176;C&#160; (8).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Hoechst 33342 1000x Stock</td>
			<td style="width:209px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:236px;">#62249</td>
			<td style="width:365px;">1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4&#176;C for up to 1 year or at -20&#176;C for long term storage. Prepare fresh&#160; at 1 ug/mL (1x)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Isopentane, 99%&#160;</td>
			<td style="width:209px;">GFS Chemicals</td>
			<td style="width:236px;">#2961</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:317px;">Paraformaldehyde (PFA) in PBS</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#15710</td>
			<td style="width:365px;">Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4&#176;C in the dark.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:317px;">Permeabilization solution</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.&#160; Prepare fresh.</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:317px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:209px;">Bioworld&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#41620015-20</td>
			<td style="width:365px;">0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.&#160; Prepared from 10x stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Sucrose solutions</td>
			<td style="width:209px;">Fisher Scientific&#160;&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#S-5-500</td>
			<td style="width:365px;">Dissolve the appropriate amount of sucrose in&#160; 37&#176;C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4&#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Tissue-Tek OCT-compound&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Sakura</td>
			<td style="width:236px;">&#160;#4583</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Antibodies</td>
			<td style="width:209px;">Company</td>
			<td style="width:236px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:365px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-calbindin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8666</td>
			<td>To label horinzotal cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-GAD65</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB5082</td>
			<td>To label GABAergic amacrine cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-GS</td>
			<td>BD Transduction</td>
			<td>610517</td>
			<td>To label M&#252;ller cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-rhodopsin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5316</td>
			<td>To label rods</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of mouse retinal cryo-sections for immunohistochemistry

De voorbereiding van hoge-kwaliteit muis oog secties voor Immunohistochemistry (IHC) is van cruciaal belang voor de beoordeling van de netvlies structuur en functie en voor het bepalen van de mechanismen ten grondslag liggen aan het netvlies ziekten. Het handhaven van structurele integriteit in het weefsel preparaat is van vitaal belang voor het verkrijgen van reproduceerbare retinale IHC gegevens, maar kan uitdagend zijn als gevolg van de kwetsbaarheid en complexiteit van het netvlies cytoarchitecture. Sterke Fixatieven zoals 10% formaline of de oplossing van Bouin de retinale structuur optimaal te bewaren, belemmeren zij vaak IHC analyse door de achtergrond fluorescentie en/of afnemende antilichaam-epitope interacties, een proces te verbeteren dat als epitope masking wordt bekend. Milder Fixatieven, aan de andere kant, zoals 4% Paraformaldehyde, vermindert de achtergrond fluorescentie en epitope-masking, nauwgezette dissectie technieken moeten worden gebruikt om het netvlies structuur te behouden. In dit artikel presenteren we een uitgebreide methode om muis oculaire achterste cups voor IHC die voldoende is om de meeste antilichaam-epitope interacties te behouden zonder verlies van retinale structurele integriteit te bereiden. Wij omvatten vertegenwoordiger IHC met antilichamen aan diverse retinale cel type tellers om weefsel behoud en richtlijn onder optimale en sub-optimale voorwaarden te illustreren. Ons doel is het optimaliseren van IHC studies van het netvlies door het verstrekken van een compleet Protocol van oculaire posterior Cup dissectie IHC.

Om te illustreren hoe deze protocollen, zorgen voor een optimale retinale bewaring voor IHC, we probed netvlies secties van P28 WT muizen (C57BL/6N) met antilichamen tegen rhodopsine (een fotoreceptor marker)8, glutamine acid decarboxylase 65 (Gad65, een amacrine cel marker)9, glutamine SYNTHETASE (GS, een Müller-cel marker)10, en calbindin (een horizontale cel marker)11 (...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry at JoVE.com

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Dit rapport beschrijft uitgebreide methoden voor de voorbereiding van bevroren muis Retina secties voor Immunohistochemistry (IHC). Beschreven methoden omvatten dissectie van de oculaire posterior Cup, Paraformaldehyde fixatie, inbedding in optimale snij-temperatuur (OCT) media en weefsel oriëntatie, sectioneren en immunokleuring.

Voorbereiding van de muis netvlies Cryo-profielen voor Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Muis retinale dissectie is een echt delicaat proces als gevolg van de grootte en vorm van de ogen en de kwetsbaarheid van het netvlies sectie. Noodzakelijk om te oefenen, met een gedetailleerd protocol dat efficiënte methode en tips bieden is de sleutel tot hoge kwaliteit retinale dissectie en sectie. We geven tips en advies om onderzoekers te helpen veelvoorkomende valkuilen te vermijden en een aantal hoogwaardige netvliessecties te verkrijgen die geschikt zijn voor immunohistochemie.Markeer het tijdelijke deel van het oog van een geëuthanaseerde muis met behulp van een staart cauterizer door het aanraken van het hoornvlies zeer licht en voor niet meer dan een fractie van een seconde om iets te branden het hoornvlies en vermijd het maken van een gat. Onmiddellijk daarna gebruikt gebogen Dumont 545 tangen om muisogen te geven. Plaats de ogen in een 1,5 milliliter cryotube met een milliliter van 4%PFA en PBS en incubeer gedurende 15 minuten op ijs.Breng vervolgens de vaste ogen met behulp van de gebogen Dumont 545 tangen over naar een gemodificeerde 35 millimeter dissectieschotel gevuld met PBS en plaats onder ontledenmicroscoop. Gebruik een micromes om een kleine incisie te maken bij de brandwond loodrecht op en net boven de limbus grens van het hoornvlies. Steek gebogen schaar in de incisie en voer een omtreksnede van het hoornvlies na de limbus.Dan, met behulp van dunne Dumont 5 tangen, verwijder het hoornvlies, extract van de lens, en til het subtiel uit de buurt van het achterste gedeelte van het oog. Het glasvocht lichaam zal komen met de lens en het netvlies zal zichtbaar zijn als een wit oppervlak dat de binnenkant van de achterste oogbeker. Was de geïsoleerde oogcups twee keer in één milliliter PBS gedurende 10 minuten op kamertemperatuur.Om de oogbekers te cryo-beschermen, equilibrate ze in 15% sacharose en PBS 's nachts op vier graden Celsius totdat ze zinken. Breng vervolgens de oogcups over naar 30% sacharose en PBS gedurende twee tot drie uur totdat ze zinken. Plaats de oogcups in OCT in 10 bij 10 millimeter cryo-mallen voor inbedding.Onder een ontledende microscoop, oriënteren het oog in de cryo-mal langs de rug ventrale as door het draaien van het oog tot de brandwond is op de top. De oogzenuw is een van de linker en de uitgesneden deel van de mal gezichten aan de rechterkant. Om het netvliesweefsel te bevriezen, dompelt u de cryo-mal gedurende ten minste vijf minuten onder in een metalen beker met isopentane en plaatst u het bekerglas in vloeibare stikstof tot een derde van de hoogte van het bekerglas.Verwijder het bevroren blok, wikkel het in aluminiumfolie en bewaar op min 80 graden Celsius. Gebruik een pen of Sharpie om het bevroren blok te markeren om de afdrukstand op te nemen. Na het aanpassen van de cryostat temperatuur tussen min 20 en min 25 graden Celsius, plaats de mallen met de ingebedde oogcups binnen en laat ze in evenwicht zijn met de cryostat temperatuur gedurende een uur.Installeer het blok in de cryostat met de rug ventrale oriëntatie en beginnen met het snijden van 10 micrometer dikke seriële secties. Plaats voorzichtig de netvliessecties op geannoteerde en genummerde microscoopdia's en bewaar vervolgens in diadozen bij min 20 graden Celsius of min 80 graden Celsius tot ze klaar zijn voor immunostaining. Immunohistochemie met antilichamen tegen rhodopsine, een fotoreceptormarkering, glutaminezuur decarboxylase 65, en amacrine celmarker, glutamine synthetase en Muller-celmarker en calbindin, een horizontale celmarker, werd uitgevoerd op netvliessecties.De resultaten geven aan dat dit protocol levert hoge kwaliteit en goed bewaard netvlies secties in tegenstelling tot in slechte kwaliteit retinale secties verkregen uit een ander protocol. Rhodopsine rijke binnenste en buitenste segmenten blijven verticaal en intact met weinig tot geen scheiding van bovenalig het netvlies gepigmenteerde epitheel. Interneuronen, zoals Gad65 positieve amacrine cellen, blijven goed gestratificeerd binnen de binnenste nucleaire laag en binnen plexiforme laag.Ook Muller cellen blijven goed bewaard met soma goed uitgelijnd in cytoplasma processen die zich uitstrekken van de ganglion cellaag naar de buitenste nucleaire laag. Bovendien zijn goed gedefinieerde horizontale cellen detecteerbaar bij de binnenste kernlaag en buitenste plexiforme laagrand. Het is belangrijk om de topper regio van de ogen te markeren en de oriëntatie te behouden tijdens het inbedden.Bereid paraformaldehyde altijd onder de motorkap met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Voorbereiding van de muis hersenweefsel voor Immunoelectron Microscopie

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Patch Clamp Opnamen van Mouse Retinal Neuronen in een donker aangepaste Slice Voorbereiding

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

Een geïsoleerde Retinale Voorbereiding op Light Response Opnemen van genetisch Labeled retinale ganglioncellen

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Ontleding van een muis Oog voor een hele berg van de retinaal pigment epitheel

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

De bereiding van niet-menselijke primaten Brain Tissue voor Pre-embedding immunohistochemie en elektronenmicroscopie

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optische coherentie tomografie: Beeldvorming muis retinale Ganglion cellen In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Optimization of the Retinal Vein Occlusion Mouse Model to Limit Variability

Optimalisatie van het Retinal Vein Occlusion Mouse Model om variabiliteit te beperken

Mouse models of retinal vein occlusion (RVO) are often used in ophthalmology to study hypoxic-ischemic injury in the neural retina. In this report, a ...

Mouse Retina Isolation and Methanol Treatment for Studying Retinal Ganglion Cells

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells (Video) | JoVE 

Op methanol gebaseerd hele-mountpreparaat voor het onderzoek van retinale ganglioncellen

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...

Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry

Detectie van abnormaal prioneiwit door immunohistochemie

Abnormal prion proteins (PrPSc) are the disease-associated isoform of cellular prion protein and diagnostic markers of transmissible spongiform ...

Mouse Retina OCT Fibergram Alignment with Confocal Images

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

Advancements in In Vivo and Ex Vivo Retinal Imaging for Improved Glaucoma Diagnosis and Treatment (Video) | JoVE

Uitlijning van optische coherentietomografievezelgrammen in zichtbaar licht met confocale beelden van hetzelfde netvlies van de muis

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...