Name: preparation of mouse retinal cryo-sections for immunohistochemistry
Uploaded: 2019-07-01T14:00:00
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Ces travaux ont été soutenus par des fonds des NIH (RO1-GMO97327) et de l'University Research Foundation (UPenn). Nous remercions tout particulièrement Svetlana Savina pour son aide dans le développement du protocole d'immunohistochimie, Gordon Ruthel (Université de Pennsylvanie) et le Penn Vet Imaging Core pour son aide en microscopie et Leslie King, Ph.D. pour la lecture critique de ce manuscrit. .

Toutes les méthodes décrites ici ont été mises en œuvre dans le strict respect des recommandations du Guide national des instituts de santé pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire fournis par l'Institut des ressources animales de laboratoire et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université de Pennsylvanie.
Tous les outils et équipements pour les méthodes sont indiqués à la figure 1</s...

<ol>
	<li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labelled+antigens+and+antibodies.">Labelled antigens and antibodies.</a> Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).</li><li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+antibodies+as+histochemical+tools.">Fluorescent antibodies as histochemical tools.</a> Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).</li><li>Coons, A. H., Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+antigen+in+tissue+cells;+improvements+in+a+method+for+the+detection+of+antigen+by+means+of+fluorescent+antibody.">Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody.</a> Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).</li><li>Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artefacts+in+histopathology.">Artefacts in histopathology.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).</li><li>Hartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+sections+from+Bouin-fixed+material+in+histopathology.">Frozen sections from Bouin-fixed material in histopathology.</a> Stain Technology. 20, 113 (1945).</li><li>Benerini Gatta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+alternative+fixatives+to+formalin+in+diagnostic+pathology.">Application of alternative fixatives to formalin in diagnostic pathology.</a> European Journal of Histochemistry. 56 (2), e12 (2012).</li><li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+cryoultramicrotomy+to+immunocytochemistry.">Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry.</a> Journal of Microscopy. 143 (Pt 2), 139-149 (1986).</li><li>Imai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+properties+of+rhodopsin+and+rod+function.">Molecular properties of rhodopsin and rod function.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6677-6684 (2007).</li><li>Lee, J. W., Lim, M. Y., Park, Y. S., Park, S. J., Kim, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reexamination+of+Dopaminergic+Amacrine+Cells+in+the+Rabbit+Retina:+Confocal+Analysis+with+Double-+and+Triple-labeling+Immunohistochemistry.">Reexamination of Dopaminergic Amacrine Cells in the Rabbit Retina: Confocal Analysis with Double- and Triple-labeling Immunohistochemistry.</a> Experimental Neurobiology. 26 (6), 329-338 (2017).</li><li>Bringmann, A., Grosche, A., Pannicke, T., Reichenbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+and+Glutamate+Uptake+and+Metabolism+in+Retinal+Glial+(Muller)+Cells.">GABA and Glutamate Uptake and Metabolism in Retinal Glial (Muller) Cells.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 4, 48 (2013).</li><li>Nakhai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ptf1a+is+essential+for+the+differentiation+of+GABAergic+and+glycinergic+amacrine+cells+and+horizontal+cells+in+the+mouse+retina.">Ptf1a is essential for the differentiation of GABAergic and glycinergic amacrine cells and horizontal cells in the mouse retina.</a> Development. 134 (6), 1151-1160 (2007).</li><li>Applebury, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+cone+photoreceptor:+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning.">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).</li></ol>

La dissection de la rétine de la souris est un processus délicat en raison de la petite taille et la forme des yeux de souris et de la fragilité du tissu rétinien. Même si la dissection de haute qualité est une question de pratique, avoir un protocole détaillé, fournir des méthodes et des conseils efficaces est une nécessité pour obtenir des sections rétiniennes et IHC. En plus des protocoles décrits ici, il y a plusieurs bouts qui tiennent des sections rétiniennes cohérentes de haute qualité qui convienn...

L'immunohistochimie (IHC) est une technique puissante pour localiser des protéines spécifiques et des structures cellulaires dans les tissus in situ1,2,3. Des méthodes de fixation inappropriées et une section sous-optimale de tissus complexes peuvent perturber la structure des tissus, générer une coloration de fond élevée ou diminuer les interactions anticorps-épitopètes, ce qui entraîne la coloration d'artefacts et, par conséquent, une mauvaise interprétation des Données du CSI4. Comme la rétine des vertébrés est un organe neuronal complexe et très organisé composé de strates de photorécepteurs interconnectés, d'interneurones et de cellules ganglionnaires, il est très fragile et peut être facilement perturbé lors de la dissection et de la section. Un protocole détaillé, normalisé et validé, de la dissection et de l'orientation des yeux de souris à l'immunostaining, aidera à réduire considérablement les artefacts du CiSE, ce qui augmentera la fiabilité des résultats et permettra d'obtenir des données comparatives plus précises. analyse.
Il existe de nombreux protocoles pour la préparation des tissus pour le CiSE, cependant, tous ne sont pas adaptés pour le tissu rétinien. Des fixatifs solides comme la formaline de 10 % ou la solution de Bouin préservent la structure rétinienne pendant la dissection et la section5. Malheureusement, les fixatifs forts mènent souvent à la fluorescence de fond amélioréeet au masquage d'épitope dû à la modification chimique des épitopes 6. D'autre part, des fixatifs plus doux, comme le paraformaldéhyde (PFA) de 4 %, peuvent soulager certains de ces artefacts, mais nécessitent une dissection méticuleuse et des sections pour préserver la structure rétinienne optimale. PfA pénètre rapidement les tissus, mais les protéines transversales très lentement, réduisant le risque de masquage épitope. Étant donné que l'incubation de PFA de courte durée est une fixation relativement légère, les tissus nécessitent souvent une congélation rapide pour préserver les antigènes. Il est important d'éviter la formation de cristaux de glace pendant la congélation des tissus car ils déforment et endommagent l'intégrité des cellules et des tissus7.
Ici nous décrivons des protocoles détaillés et normalisés pour la dissection, la fixation, et la cryo-protection des tasses postérieures oculaires de souris qui donnent des données cohérentes et fiables de IHC.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1128px;" width="1129">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm)</td>
			<td style="width:209px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#MA-48</td>
			<td style="width:365px;">For liquid nitrogen (Figure 1E)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Aluminum foil&#160;</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Cauterizer&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Bovie</td>
			<td style="width:236px;">#AA01</td>
			<td style="width:365px;">To mark eye orientation (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:236px;">#72703-D</td>
			<td style="width:365px;">For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#15002-08</td>
			<td style="width:365px;">To circumferentially cut the cornea (Figure 1B)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Dental wax-coated 35mm dissection dish</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">For eye cup dissection (Figure 1C)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Dissecting microscope&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Leica, Houston, USA&#160;</td>
			<td style="width:236px;">MZ12.5 High-performance stereomicroscope</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Micro Knives - Plastic Handle&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#10315-12</td>
			<td style="width:365px;">To make a small incision at the burn mark (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Pink dental wax&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#72660</td>
			<td style="width:365px;">For coating dissection dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Slide Rack and Coverplate</td>
			<td style="width:209px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:236px;">#36107</td>
			<td style="width:365px;">For retinal IHC (Figure 1G)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Stainless Steel Beaker (89 x 114mm)</td>
			<td style="width:209px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#MA-40</td>
			<td style="width:365px;">For isopentane bath (Figure 1E)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Styrofoam box</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">For insulated cooler</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Thin forceps Dumont #5&#160;&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#11254-20</td>
			<td style="width:365px;">To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Tissue-Tek cryomold&#160; (10mm x 10mm x 5mm)</td>
			<td style="width:209px;">Electron Miscroscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#62534-10</td>
			<td style="width:365px;">Mold for OCT embedding</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Buffers and Reagents</td>
			<td style="width:209px;">Company</td>
			<td style="width:236px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:365px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Blocking solution</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="77">
			<td height="77" style="height:77px;width:317px;">Gelvatol (anti-fading mounting media)</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).&#160; Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops).&#160; Store in amber drop bottle at 4&#176;C&#160; (8).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Hoechst 33342 1000x Stock</td>
			<td style="width:209px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:236px;">#62249</td>
			<td style="width:365px;">1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4&#176;C for up to 1 year or at -20&#176;C for long term storage. Prepare fresh&#160; at 1 ug/mL (1x)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Isopentane, 99%&#160;</td>
			<td style="width:209px;">GFS Chemicals</td>
			<td style="width:236px;">#2961</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:317px;">Paraformaldehyde (PFA) in PBS</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#15710</td>
			<td style="width:365px;">Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4&#176;C in the dark.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:317px;">Permeabilization solution</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.&#160; Prepare fresh.</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:317px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:209px;">Bioworld&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#41620015-20</td>
			<td style="width:365px;">0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.&#160; Prepared from 10x stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Sucrose solutions</td>
			<td style="width:209px;">Fisher Scientific&#160;&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#S-5-500</td>
			<td style="width:365px;">Dissolve the appropriate amount of sucrose in&#160; 37&#176;C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4&#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Tissue-Tek OCT-compound&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Sakura</td>
			<td style="width:236px;">&#160;#4583</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Antibodies</td>
			<td style="width:209px;">Company</td>
			<td style="width:236px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:365px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-calbindin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8666</td>
			<td>To label horinzotal cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-GAD65</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB5082</td>
			<td>To label GABAergic amacrine cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-GS</td>
			<td>BD Transduction</td>
			<td>610517</td>
			<td>To label M&#252;ller cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-rhodopsin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5316</td>
			<td>To label rods</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of mouse retinal cryo-sections for immunohistochemistry

La préparation de sections oculaires de souris de haute qualité pour l'immunohistochimie (IHC) est essentielle pour évaluer la structure et la fonction rétiniennes et pour déterminer les mécanismes sous-jacents aux maladies rétiniennes. Le maintien de l'intégrité structurelle tout au long de la préparation des tissus est essentiel pour obtenir des données reproductibles du CIH rétinien, mais peut être difficile en raison de la fragilité et de la complexité de la cytoarchitecture rétinienne. Des fixatifs forts comme la formaline de 10 % ou la solution de Bouin préservent de façon optimale la structure rétinienne, ils entravent souvent l'analyse du CiSE en améliorant la fluorescence de fond et/ou en diminuant les interactions anticorps-épitopes, un processus connu sous le nom de masquage épitope. Les fixatifs plus doux, d'autre part, comme le paraformaldéhyde de 4%, réduit la fluorescence de fond et les techniques méticuleuses de dissection d'épitope-masquant doivent être employées pour préserver la structure rétinienne. Dans cet article, nous présentons une méthode complète pour préparer des tasses postérieures oculaires de souris pour IHC qui est suffisante pour préserver la plupart des interactions anticorps-épitope sans perte de l'intégrité structurale rétinienne. Nous incluons le CiPH représentatif avec des anticorps à divers marqueurs de type de cellules rétiniennes pour illustrer la conservation et l'orientation de tissu dans des conditions optimales et sous-optimales. Notre objectif est d'optimiser les études IHC de la rétine en fournissant un protocole complet de la dissection oculaire de tasse postérieure à IHC.

Pour illustrer comment ces protocoles, assurer la conservation rétinienne optimale pour IHC, nous avons sondé les sections rétiniennes des souris P28 WT (C57BL/6N) avec des anticorps à la rhodopsine (un marqueur photorécepteur)8, décarboxylase d'acide glutamique 65 (Gad65, cellule amacrine marqueur)9, la glutamine synthetase (GS, un marqueur cellulaire de M-ller)10, et la calbindine (un marqueur cellulaire horiz...

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Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Ce rapport décrit des méthodes complètes pour préparer les sections congelées de rétine de souris pour l'immunohistochimie (IHC). Les méthodes décrites incluent la dissection de la tasse postérieure oculaire, la fixation de paraformaldehyde, l'intégration dans la température de coupe optimale (OCT) orientation de médias et de tissu, sectionnement et immunostaining.

Préparation de la souris Retinal Cryo-sections pour l'immunohistochimie

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

La dissection rétinienne de la souris est un processus très délicat en raison de la taille et de la forme des yeux et de la fragilité de la section rétine. Impératif de pratiquer, avoir un protocole détaillé qui fournissent une méthode efficace et des conseils est la clé de la dissection rétinienne de haute qualité et la section. Nous fournissons des conseils et des conseils pour aider les chercheurs à éviter les pièges courants et à obtenir des sections rétiniennes de haute qualité adaptées à l’immunohistochimie.Marquer la partie temporelle de l’œil d’une souris euthanasiée à l’aide d’un cautérisateur de queue en touchant la cornée très légèrement et pendant au plus une fraction de seconde pour brûler légèrement la cornée et éviter de faire un trou. Immédiatement après cela utilisé courbe Dumont 545 forceps pour enucleate yeux de souris. Placez les yeux dans un cryotube de 1,5 millilitre avec un millilitre de 4% PFA et PBS et incubez pendant 15 minutes sur la glace.Ensuite, transférez les yeux fixes à l’aide des forceps Dumont 545 incurvés vers un plat de dissection modifié de 35 millimètres rempli de PBS et placez-le au microscope disséquant. Utilisez un microknife pour faire une petite incision à la marque de brûlure perpendiculaire à et juste au-dessus de la bordure des limbes de la cornée. Insérez des ciseaux incurvés dans l’incision et effectuez une coupe circonférentielle de la cornée suivant le limbe.Ensuite, à l’aide de minces forceps Dumont 5, retirez la cornée, extrayez la lentille et soulevez-la délicatement loin de la partie postérieure de l’œil. Le corps vitreux sortira avec la lentille et la rétine sera visible comme une surface blanche couvrant l’intérieur de la coupe postérieure de l’œil. Lavez les cils isolés deux fois en un millilitre de PBS pendant 10 minutes à température ambiante.Pour cryo-protéger les cils, équilibrez-les en saccharose à 15 % et en PBS pendant la nuit à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils coulent. Ensuite, transférez les cils à 30% saccharose et PBS pendant deux à trois heures jusqu’à ce qu’ils coulent. Placez les cils en OCT en cryo-moules de 10 par 10 millimètres pour l’intégration.Sous un microscope disséquant, orientez l’œil dans le cryo-moule le long de son axe ventral dorsal en tournant l’œil jusqu’à ce que la marque de brûlure soit sur le dessus. Le nerf optique est l’un à gauche et la partie découpée du moule fait face à la droite. Pour casser le tissu rétinien, immerger le cryo-moule pendant au moins cinq minutes dans un bécher métallique contenant de l’isopentane, puis placer le bécher dans de l’azote liquide jusqu’à un tiers de la hauteur du bécher.Retirer le bloc congelé, l’envelopper dans du papier d’aluminium et le conserver à moins 80 degrés Celsius. Utilisez un stylo ou Sharpie pour marquer le bloc gelé pour enregistrer son orientation. Après avoir ajusté la température du cryostat entre moins 20 et moins 25 degrés Celsius, placez les moules contenant les cils intégrés à l’intérieur et laissez-les équilibrer à la température du cryostat pendant une heure.Installez le bloc dans le cryostat avec l’orientation ventrale dorsale et commencez à couper 10 sections de série micrométriques d’épaisseur. Placez soigneusement les sections rétiniennes sur des diapositives annotées et numérotées au microscope, puis rangez-les dans des boîtes à diapositives à moins 20 degrés Celsius ou moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour l’immunostaining. Immunohistochimie avec des anticorps à la rhodopsine, un marqueur photorécepteur, decarboxylase acide glutamique 65, et marqueur cellulaire amacrine, synthétase de glutamine et marqueur cellulaire muller, et calbindin, un marqueur horizontal de cellules a été exécuté sur des sections rétiniennes.Les résultats indiquent que ce protocole donne des sections rétiniennes de haute qualité et bien conservées contrairement aux sections rétiniennes de mauvaise qualité obtenues à partir d’un protocole différent. Les segments intérieurs et extérieurs riches en rhodopsine restent verticaux et intacts avec peu ou pas de séparation de l’épithélium pigmenté rétinien. Les interneurones, tels que les cellules amacrines positives Gad65, restent correctement stratifiés dans la couche nucléaire interne et la couche plexiforme interne.En outre, les cellules muller restent bien conservées avec du soma correctement aligné dans les processus cytoplasmiques qui s’étendent de la couche cellulaire ganglionnaire à la couche nucléaire externe. En outre, des cellules horizontales bien définies sont détectables à la couche nucléaire intérieure et à la bordure extérieure de la couche plexiforme. Il est important de marquer la région topper des yeux et de garder l’orientation pendant l’intégration.Préparez toujours du paraformaldéhyde sous le capot avec l’équipement de protection individuelle approprié.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Préparation du tissu cérébral de souris pour microscopie électronique

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Recherche

Neurosciences

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Enregistrements Patch Clamp à partir de neurones rétiniens souris dans une préparation adaptés à l&#39;obscurité Slice

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

Une préparation isolée rétinienne pour enregistrer la réponse de Lumière génétiquement marqués cellules ganglionnaires rétiniennes

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Dissection d&#39;un oeil de la souris pour un mont entiers de l&#39;épithélium pigmentaire rétinien

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Préparation du Primat tissu cérébral non humain pour immunohistochimie pré-enrobage et microscopie électronique

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Tomographie par cohérence optique : Imagerie souris ganglionnaires rétiniennes cellules In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Optimization of the Retinal Vein Occlusion Mouse Model to Limit Variability

Optimisation du modèle murin d’occlusion veineuse rétinienne pour limiter la variabilité

Mouse models of retinal vein occlusion (RVO) are often used in ophthalmology to study hypoxic-ischemic injury in the neural retina. In this report, a ...

Mouse Retina Isolation and Methanol Treatment for Studying Retinal Ganglion Cells

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells (Video) | JoVE 

PRÉPARATION À MONTAGE ENTIER À BASE DE MÉTHANOL POUR L’ÉTUDE DES CELLULES GANGLIONNAIRES DE LA RÉTINE

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...

Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry

Détection de la protéine prion anormale par immunohistochimie

Abnormal prion proteins (PrPSc) are the disease-associated isoform of cellular prion protein and diagnostic markers of transmissible spongiform ...

Mouse Retina OCT Fibergram Alignment with Confocal Images

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

Advancements in In Vivo and Ex Vivo Retinal Imaging for Improved Glaucoma Diagnosis and Treatment (Video) | JoVE

Alignement de fibrogrammes de tomographie par cohérence optique en lumière visible avec des images confocales de la même rétine de souris

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...