Name: preparation of mouse retinal cryo-sections for immunohistochemistry
Uploaded: 2019-07-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch Mittel des NIH (RO1-GMO97327) und der University Research Foundation (UPenn) unterstützt. Wir danken insbesondere Svetlana Savina für ihre Hilfe bei der Entwicklung des Immunhistochemie-Protokolls, Gordon Ruthel (University of Pennsylvania) und dem Penn Vet Imaging Core für die Unterstützung bei der Mikroskopie und Leslie King, Ph.D. für die kritische Lektüre dieses Manuskripts. .

Alle hier beschriebenen Methoden wurden in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen des National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt, der vom Institut für Labortierressourcen zur Verfügung gestellt wurde, und wurden von der Institutional Animal Care and Use Committee der University of Pennsylvania.
Alle Werkzeuge und Geräte für die Methoden sind in Abbildung 1 dargestellt und in der Tabelle der Mate...

<ol>
	<li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labelled+antigens+and+antibodies.">Labelled antigens and antibodies.</a> Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).</li><li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+antibodies+as+histochemical+tools.">Fluorescent antibodies as histochemical tools.</a> Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).</li><li>Coons, A. H., Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+antigen+in+tissue+cells;+improvements+in+a+method+for+the+detection+of+antigen+by+means+of+fluorescent+antibody.">Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody.</a> Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).</li><li>Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artefacts+in+histopathology.">Artefacts in histopathology.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).</li><li>Hartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+sections+from+Bouin-fixed+material+in+histopathology.">Frozen sections from Bouin-fixed material in histopathology.</a> Stain Technology. 20, 113 (1945).</li><li>Benerini Gatta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+alternative+fixatives+to+formalin+in+diagnostic+pathology.">Application of alternative fixatives to formalin in diagnostic pathology.</a> European Journal of Histochemistry. 56 (2), e12 (2012).</li><li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+cryoultramicrotomy+to+immunocytochemistry.">Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry.</a> Journal of Microscopy. 143 (Pt 2), 139-149 (1986).</li><li>Imai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+properties+of+rhodopsin+and+rod+function.">Molecular properties of rhodopsin and rod function.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6677-6684 (2007).</li><li>Lee, J. W., Lim, M. Y., Park, Y. S., Park, S. J., Kim, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reexamination+of+Dopaminergic+Amacrine+Cells+in+the+Rabbit+Retina:+Confocal+Analysis+with+Double-+and+Triple-labeling+Immunohistochemistry.">Reexamination of Dopaminergic Amacrine Cells in the Rabbit Retina: Confocal Analysis with Double- and Triple-labeling Immunohistochemistry.</a> Experimental Neurobiology. 26 (6), 329-338 (2017).</li><li>Bringmann, A., Grosche, A., Pannicke, T., Reichenbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+and+Glutamate+Uptake+and+Metabolism+in+Retinal+Glial+(Muller)+Cells.">GABA and Glutamate Uptake and Metabolism in Retinal Glial (Muller) Cells.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 4, 48 (2013).</li><li>Nakhai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ptf1a+is+essential+for+the+differentiation+of+GABAergic+and+glycinergic+amacrine+cells+and+horizontal+cells+in+the+mouse+retina.">Ptf1a is essential for the differentiation of GABAergic and glycinergic amacrine cells and horizontal cells in the mouse retina.</a> Development. 134 (6), 1151-1160 (2007).</li><li>Applebury, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+cone+photoreceptor:+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning.">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).</li></ol>

Maus Netzhaut-Sektion ist ein empfindlicher Prozess aufgrund der geringen Größe und Form der Mausaugen und die Fragilität der Netzhautgewebe. Auch wenn die Durchführung von qualitativ hochwertigen Sezierungen eine Frage der Praxis ist, ist es eine Notwendigkeit, mit einem detaillierten Protokoll effiziente Methoden und Tipps zu erhalten, um Netzhautabschnitte und IHC zu erhalten. Zusätzlich zu den hier beschriebenen Protokollen gibt es einige Tipps, die konsistente hochwertige Netzhautabschnitte ermöglichen, die f?...

Immunohistochemistry (IHC) ist eine leistungsfähige Technik zur Lokalisierung spezifischer Proteine und zellulärer Strukturen in Geweben in situ1,2,3. Ungeeignete Fixierungsmethoden und suboptimale Schnitte komplexer Gewebe können die Gewebestruktur stören, eine hohe Hintergrundfärbung erzeugen oder Antikörper-Epitop-Wechselwirkungen verringern, was zu Färbeartefakten und daraus resultierender Fehlinterpretation von IHC-Daten4. Da die Netzhaut des Wirbeltiers ein komplexes und hochorganisiertes neuronales Organ ist, das aus Schichten miteinander verbundener Photorezeptoren, Interneuroner und Ganglienzellen besteht, ist es sehr zerbrechlich und kann leicht während der Zerlegung und Schnitte gestört werden. Ein detailliertes, standardisiertes und validiertes Protokoll von der Mausaugensektion und -orientierung bis zur Immunfärbung wird dazu beitragen, IHC-Artefakte deutlich zu reduzieren, wodurch die Zuverlässigkeit der Ergebnisse erhöht und genauere Vergleichsdaten möglich sind. analyse.
Es gibt viele Protokolle für die Gewebevorbereitung für IHC, jedoch sind nicht alle für Netzhautgewebe geeignet. Starke Fixative wie 10% Formalin oder Bouin-Lösung bewahren die Netzhautstruktur während der Zerlegung und Schnittung5. Leider führen starke Fixative oft zur verstärkten Hintergrundfluoreszenz und Epitopmaskierung aufgrund der chemischen Modifikation von Epitopen6. Auf der anderen Seite können mildere Fixative, wie 4% Paraformaldehyd (PFA), einige dieser Artefakte lindern, erfordern aber eine sorgfältige Zerlegung und Schnitte, um die optimale Netzhautstruktur zu erhalten. PFA dringt schnell in Gewebe ein, aber Kreuz-Links-Proteine sehr langsam, wodurch das Risiko der Epitopmaskierung reduziert wird. Da die PFA-Inkubation in kurzer Zeit eine relativ milde Fixierung ist, benötigen Gewebe oft schnelles Einfrieren, um Antigene zu erhalten. Es ist wichtig, die Bildung von Eiskristallen beim Einfrieren des Gewebes zu vermeiden, da sie die Integrität von Zellen und Geweben verzerren und schädigen7.
Hier beschreiben wir detaillierte und standardisierte Protokolle für Sezieren, Fixierung und Kryoschutz von Maus-Okularbechern, die konsistente und zuverlässige IHC-Daten liefern.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1128px;" width="1129">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm)</td>
			<td style="width:209px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#MA-48</td>
			<td style="width:365px;">For liquid nitrogen (Figure 1E)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Aluminum foil&#160;</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Cauterizer&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Bovie</td>
			<td style="width:236px;">#AA01</td>
			<td style="width:365px;">To mark eye orientation (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:236px;">#72703-D</td>
			<td style="width:365px;">For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#15002-08</td>
			<td style="width:365px;">To circumferentially cut the cornea (Figure 1B)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Dental wax-coated 35mm dissection dish</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">For eye cup dissection (Figure 1C)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Dissecting microscope&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Leica, Houston, USA&#160;</td>
			<td style="width:236px;">MZ12.5 High-performance stereomicroscope</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Micro Knives - Plastic Handle&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#10315-12</td>
			<td style="width:365px;">To make a small incision at the burn mark (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Pink dental wax&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#72660</td>
			<td style="width:365px;">For coating dissection dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Slide Rack and Coverplate</td>
			<td style="width:209px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:236px;">#36107</td>
			<td style="width:365px;">For retinal IHC (Figure 1G)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Stainless Steel Beaker (89 x 114mm)</td>
			<td style="width:209px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#MA-40</td>
			<td style="width:365px;">For isopentane bath (Figure 1E)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Styrofoam box</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">For insulated cooler</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Thin forceps Dumont #5&#160;&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#11254-20</td>
			<td style="width:365px;">To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Tissue-Tek cryomold&#160; (10mm x 10mm x 5mm)</td>
			<td style="width:209px;">Electron Miscroscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#62534-10</td>
			<td style="width:365px;">Mold for OCT embedding</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Buffers and Reagents</td>
			<td style="width:209px;">Company</td>
			<td style="width:236px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:365px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Blocking solution</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="77">
			<td height="77" style="height:77px;width:317px;">Gelvatol (anti-fading mounting media)</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).&#160; Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops).&#160; Store in amber drop bottle at 4&#176;C&#160; (8).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Hoechst 33342 1000x Stock</td>
			<td style="width:209px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:236px;">#62249</td>
			<td style="width:365px;">1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4&#176;C for up to 1 year or at -20&#176;C for long term storage. Prepare fresh&#160; at 1 ug/mL (1x)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Isopentane, 99%&#160;</td>
			<td style="width:209px;">GFS Chemicals</td>
			<td style="width:236px;">#2961</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:317px;">Paraformaldehyde (PFA) in PBS</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#15710</td>
			<td style="width:365px;">Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4&#176;C in the dark.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:317px;">Permeabilization solution</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.&#160; Prepare fresh.</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:317px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:209px;">Bioworld&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#41620015-20</td>
			<td style="width:365px;">0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.&#160; Prepared from 10x stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Sucrose solutions</td>
			<td style="width:209px;">Fisher Scientific&#160;&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#S-5-500</td>
			<td style="width:365px;">Dissolve the appropriate amount of sucrose in&#160; 37&#176;C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4&#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Tissue-Tek OCT-compound&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Sakura</td>
			<td style="width:236px;">&#160;#4583</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Antibodies</td>
			<td style="width:209px;">Company</td>
			<td style="width:236px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:365px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-calbindin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8666</td>
			<td>To label horinzotal cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-GAD65</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB5082</td>
			<td>To label GABAergic amacrine cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-GS</td>
			<td>BD Transduction</td>
			<td>610517</td>
			<td>To label M&#252;ller cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-rhodopsin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5316</td>
			<td>To label rods</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of mouse retinal cryo-sections for immunohistochemistry

Die Vorbereitung hochwertiger Mausaugenabschnitte für die Immunhistochemie (IHC) ist entscheidend für die Beurteilung der Netzhautstruktur und -funktion und für die Bestimmung der Mechanismen, die Netzhauterkrankungen zugrunde liegen. Die Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität während der gesamten Gewebepräparation ist für die Gewinnung reproduzierbarer retinaler IHC-Daten von entscheidender Bedeutung, kann aber aufgrund der Fragilität und Komplexität der retinalen Zytoarchitektur eine Herausforderung darstellen. Starke Fixative wie 10% Formalin oder Bouins Lösung bewahren die Netzhautstruktur optimal, sie behindern oft die IHC-Analyse, indem sie die Hintergrundfluoreszenz und/oder die abnehmenden Antikörper-Epitop-Wechselwirkungen verbessern, ein Prozess, der als Epitopmaskierung bekannt ist. Milderfixative hingegen, wie 4% Paraformaldehyd, reduziert Die Hintergrundfluoreszenz und Epitopmaskierung, sorgfältige Seziertechniken müssen verwendet werden, um die Netzhautstruktur zu erhalten. In diesem Artikel stellen wir eine umfassende Methode zur Vorbereitung von Maus-Okularbechern für IHC vor, die ausreicht, um die meisten Antikörper-Epitop-Wechselwirkungen ohne Verlust der strukturellen Integrität der Netzhaut zu erhalten. Wir schließen repräsentative IHC mit Antikörpern gegen verschiedene Netzhautzelltypmarker ein, um die Gewebeerhaltung und -orientierung unter optimalen und suboptimalen Bedingungen zu veranschaulichen. Unser Ziel ist es, IHC-Studien der Netzhaut zu optimieren, indem wir ein komplettes Protokoll von der okularen hinteren Bechersektion bis zum IHC bereitstellen.

Um zu veranschaulichen, wie diese Protokolle eine optimale Netzhautkonservierung für IHC gewährleisten, untersuchten wir Netzhautabschnitte von P28 WT-Mäusen (C57BL/6N) mit Antikörpern gegen Rhodopsin (ein Photorezeptormarker)8, Glutaminsäure-Decarboxylase 65 (Gad65, eine Marker)9, Glutamin-Synthetase (GS, ein Müller-Zellmarker)10und Calbindin (ein horizontaler Zellmarker)11 (<strong clas...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry at JoVE.com

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Dieser Bericht beschreibt umfassende Methoden zur Vorbereitung von gefrorenen Mausnetzteilen für die Immunhistochemie (IHC). Die beschriebenen Methoden umfassen die Zerlegung des okularen posterioren Bechers, die Paraformaldehydfixierung, die Einbettung in die Medien der optimalen Schnitttemperatur (OCT) und die Gewebeorientierung, die Schnitt- und Immunfärbung.

Vorbereitung von Maus-Retinal-Cryo-Sektionen für die Immunhistochemie

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Maus Netzhaut-Sektion ist ein wirklich empfindlicher Prozess aufgrund der Größe und Form der Augen und die Fragilität der Netzhaut abschnitt. Imperative zu üben, mit einem detaillierten Protokoll, das effiziente Methode und Tipps bieten ist der Schlüssel zu qualitativ hochwertigen Netzhaut-Sektion und Abschnitt. Wir geben Tipps und Ratschläge, um Forschern zu helfen, häufige Fallstricke zu vermeiden und einige hochwertige Netzhautabschnitte zu erhalten, die für die Immunhistochemie geeignet sind.Markieren Sie den zeitlichen Teil des Auges einer eingeschläferten Maus mit einem Schwanzkauterizer, indem Sie die Hornhaut sehr leicht und für nicht mehr als eine Sekunde berühren, um die Hornhaut leicht zu verbrennen und ein Loch zu vermeiden. Unmittelbar danach verwendet gekrümmte Dumont 545 Zangen, um Mausaugen zu enukleatisieren. Die Augen in ein 1,5-Milliliter-Kryotube mit einem Milliliter 4%PFA und PBS legen und 15 Minuten auf Eis brüten.Dann übertragen Sie die fixierten Augen mit den gekrümmten Dumont 545 Zangen auf eine modifizierte 35-Millimeter-Sektionsschale, die mit PBS gefüllt ist, und unter das Sezieren des Mikroskops stellen. Verwenden Sie ein Mikromesser, um einen kleinen Schnitt an der Brandmarke senkrecht und knapp über der Limbusgrenze der Hornhaut zu machen. Fügen Sie eine gekrümmte Schere in den Schnitt ein und führen Sie einen Umfangsschnitt der Hornhaut nach dem Limbus durch.Dann, mit dünnen Dumont 5 Zangen, entfernen Sie die Hornhaut, extrahieren Sie die Linse, und heben Sie es zart weg von der hinteren Teil des Auges. Der Glaskörper wird mit der Linse herauskommen und die Netzhaut wird als weiße Oberfläche sichtbar sein, die die Innenseite der hinteren Augentasse bedeckt. Waschen Sie die isolierten Augenbecher zweimal in einem Milliliter PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur.Um die Augenbecher kryo-schützen, gleicht sie in 15% Saccharose und PBS über Nacht bei vier Grad Celsius aus, bis sie sinken. Dann die Augenbecher für zwei bis drei Stunden auf 30% Saccharose und PBS übertragen, bis sie sinken. Legen Sie die Augenbecher in OCT in 10 mal 10 Millimeter Kryo-Formen zum Einbetten.Richten Sie das Auge in der Kryoform unter einem Sezierendes Mikroskop entlang seiner dorsalen ventralen Achse aus, indem Sie das Auge so lange drehen, bis sich die Brandmarke oben befindet. Der Sehnerv ist einer links und der ausgeschnittene Teil der Form nach rechts. Um das Netzhautgewebe einzufrieren, tauchen Sie die Kryoform für mindestens fünf Minuten in einen Metallbecher mit Isopentan ein und legen Sie das Becherglas dann bis zu einem Drittel der Höhe des Becherglases in flüssigen Stickstoff.Entfernen Sie den gefrorenen Block, wickeln Sie ihn in Aluminiumfolie und lagern Sie ihn bei minus 80 Grad Celsius. Verwenden Sie einen Stift oder Sharpie, um den eingefrorenen Block zu markieren, um seine Ausrichtung aufzuzeichnen. Nach der Einstellung der Kryostattemperatur zwischen minus 20 und minus 25 Grad Celsius, legen Sie die Formen mit den eingebetteten Augenbechern innen und lassen Sie sie auf die Kryostattemperatur für eine Stunde ausgrenzen.Installieren Sie den Block im Kryostat mit der dorsalen ventralen Ausrichtung und beginnen Sie, 10 Mikrometer dicke serielle Abschnitte zu schneiden. Stellen Sie die Netzhautabschnitte vorsichtig auf kommentierte und nummerierte Mikroskopdias und lagern Sie dann in Diaboxen bei minus 20 Grad Celsius oder minus 80 Grad Celsius, bis sie zum Immunstainieren bereit sind. Immunhistochemie mit Antikörpern gegen Rhodopsin, einen Photorezeptormarker, Glutaminsäure-Decarboxylase 65 und Amacrine-Zellmarker, Glutamin-Synthetase und Muller-Zellmarker und Calbindin, ein horizontaler Zellmarker, wurde an Netzhautabschnitten durchgeführt.Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieses Protokoll hohe Qualität und gut erhaltene Netzhautabschnitte liefert, im Gegensatz zu schlechter Qualität Netzhautabschnitte aus einem anderen Protokoll erhalten. Rhodopsin reiche innere und äußere Segmente bleiben vertikal und intakt mit wenig bis gar keine Trennung vom Überlegen des retinalen pigmentierten Epithels. Interneuronen, wie Gad65-positive Amacrinzellen, bleiben innerhalb der inneren Kernschicht und der inneren Plexiformschicht richtig geschichtet.Außerdem bleiben Muller-Zellen gut erhalten mit Soma, der in zytoplasmatischen Prozessen, die sich von der Ganglienzellschicht bis zur äußeren Kernschicht erstrecken, richtig ausgerichtet ist. Darüber hinaus sind gut definierte horizontale Zellen an der inneren Kernschicht und dem äußeren Plexiformschichtrahmen nachweisbar. Es ist wichtig, den Topperbereich der Augen zu markieren und die Orientierung während der Einbettung zu behalten.Bereiten Sie Paraformaldehyd unter der Haube immer mit der entsprechenden persönlichen Schutzausrüstung vor.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Vorbereitung von Gehirngewebe der Maus für Immunelektronenmikroskopie

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Forschung

Neurowissenschaften

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Patch Clamp Messungen von Mouse Netzhautneuronen in einem Dark-Scheiben angepasst Vorbereitung

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

Eine isolierte Retinal Vorbereitung auf leichte Ansprache aus genetisch markierten retinalen Ganglienzellen Rekord

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Präparation einer Maus Eye für einen ganzen Berg von retinalen Pigmentepithel

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Herstellung von nichtmenschlichen Primaten Hirngewebe für die Pre-Einbettung Immunhistochemie und Elektronenmikroskopie

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optische Kohärenztomographie: Maus retinalen Ganglienzellen Zellen In Vivo Imaging

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Optimization of the Retinal Vein Occlusion Mouse Model to Limit Variability

Optimierung des Mausmodells mit retinalen Venenverschlüssen zur Begrenzung der Variabilität

Mouse models of retinal vein occlusion (RVO) are often used in ophthalmology to study hypoxic-ischemic injury in the neural retina. In this report, a ...

Mouse Retina Isolation and Methanol Treatment for Studying Retinal Ganglion Cells

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells (Video) | JoVE 

Methanol-basiertes Whole-Mount-Präparat zur Untersuchung retinaler Ganglienzellen

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...

Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry

Nachweis von abnormalem Prionprotein durch Immunhistochemie

Abnormal prion proteins (PrPSc) are the disease-associated isoform of cellular prion protein and diagnostic markers of transmissible spongiform ...

Mouse Retina OCT Fibergram Alignment with Confocal Images

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

Advancements in In Vivo and Ex Vivo Retinal Imaging for Improved Glaucoma Diagnosis and Treatment (Video) | JoVE

Abgleich von optischen Kohärenztomographie-Fasergrammen im sichtbaren Licht mit konfokalen Bildern derselben Maus-Netzhaut

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...