Name: preparation of mouse retinal cryo-sections for immunohistochemistry
Uploaded: 2019-07-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי קרנות מ-NIH (RO1-GMO97327) והקרן לחקר האוניברסיטה (UPenn). אנו מודים במיוחד לסווטלנה סאוינה על עזרתה בפיתוח פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה, גורדון רותל (אונ' פנסילבניה) וליבת ההדמיה של פן וטרינר לסיוע במיקרוסקופיה ולסלי קינג, Ph.D. לקריאה קריטית של כתב היד .

כל השיטות המתוארות כאן בוצעו בהתאמה קפדנית עם ההמלצות של המכונים הלאומיים למדריך בריאות לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה שסופקו על ידי המכון למשאבי בעלי חיים במעבדה ואושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים והוועדה השתמש של אוניברסיטת פנסילבניה.
כל הכלים והציוד עבור השיטות מוצגים...

<ol>
	<li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labelled+antigens+and+antibodies.">Labelled antigens and antibodies.</a> Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).</li><li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+antibodies+as+histochemical+tools.">Fluorescent antibodies as histochemical tools.</a> Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).</li><li>Coons, A. H., Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+antigen+in+tissue+cells;+improvements+in+a+method+for+the+detection+of+antigen+by+means+of+fluorescent+antibody.">Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody.</a> Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).</li><li>Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artefacts+in+histopathology.">Artefacts in histopathology.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).</li><li>Hartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+sections+from+Bouin-fixed+material+in+histopathology.">Frozen sections from Bouin-fixed material in histopathology.</a> Stain Technology. 20, 113 (1945).</li><li>Benerini Gatta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+alternative+fixatives+to+formalin+in+diagnostic+pathology.">Application of alternative fixatives to formalin in diagnostic pathology.</a> European Journal of Histochemistry. 56 (2), e12 (2012).</li><li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+cryoultramicrotomy+to+immunocytochemistry.">Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry.</a> Journal of Microscopy. 143 (Pt 2), 139-149 (1986).</li><li>Imai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+properties+of+rhodopsin+and+rod+function.">Molecular properties of rhodopsin and rod function.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6677-6684 (2007).</li><li>Lee, J. W., Lim, M. Y., Park, Y. S., Park, S. J., Kim, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reexamination+of+Dopaminergic+Amacrine+Cells+in+the+Rabbit+Retina:+Confocal+Analysis+with+Double-+and+Triple-labeling+Immunohistochemistry.">Reexamination of Dopaminergic Amacrine Cells in the Rabbit Retina: Confocal Analysis with Double- and Triple-labeling Immunohistochemistry.</a> Experimental Neurobiology. 26 (6), 329-338 (2017).</li><li>Bringmann, A., Grosche, A., Pannicke, T., Reichenbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+and+Glutamate+Uptake+and+Metabolism+in+Retinal+Glial+(Muller)+Cells.">GABA and Glutamate Uptake and Metabolism in Retinal Glial (Muller) Cells.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 4, 48 (2013).</li><li>Nakhai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ptf1a+is+essential+for+the+differentiation+of+GABAergic+and+glycinergic+amacrine+cells+and+horizontal+cells+in+the+mouse+retina.">Ptf1a is essential for the differentiation of GABAergic and glycinergic amacrine cells and horizontal cells in the mouse retina.</a> Development. 134 (6), 1151-1160 (2007).</li><li>Applebury, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+cone+photoreceptor:+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning.">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).</li></ol>

לנתיחה הרשתית של העכבר הוא תהליך עדין בשל גודל קטן וצורה של עיניים העכבר ושבריאת הרקמות הרשתית. למרות ביצוע הניתוח באיכות גבוהה הוא עניין של תרגול, בעל פרוטוקול מפורט, מתן שיטות יעילות וטיפים הוא הכרח להשיג חלקים ברשתית ו-IHC. בנוסף לפרוטוקולים המתוארים כאן, קיימים מספר טיפים המאפשרים למקטע...

אימונוהיסטוכימיה (ihc) היא טכניקה רבת-עוצמה לאיתור חלבונים ומבני סלולר ספציפיים ברקמות באתרו1,2,3. שיטות קיבעון בלתי הולמים והפחתה תת-אופטימלית של רקמות מורכבות יכול לשבש את מבנה הרקמה, ליצור כתמים ברקע גבוה או להפחית נוגדן-אפירופה אינטראקציות, וכתוצאה מכך מכתים חפצים והסוגר וטעה של נתוני IHC4. כמו הרשתית בעלי החוליות הוא איבר עצבי מורכב ומאורגן מאוד מורכב משכבות של פוטוטורקטורים מחוברים, הביננוירונים ותאים גנגליון, זה שברירי מאוד ניתן לשבש בקלות במהלך הניתוח והפריית. פרוטוקול מפורט, מתוקננת, ומאומת מפני הפחתת עין העכבר והתמצאות לכתמים מסייעים להפחית באופן משמעותי את הממצאים של IHC, ובכך להגדיל את האמינות של התוצאות ולאפשר נתונים השוואתיים יותר מדויקים ניתוח.
ישנם פרוטוקולים רבים עבור הכנת רקמות עבור IHC, עם זאת, לא כל מתאים לרקמות רשתית. תיקונים חזקים כמו 10% פורמלין או הפתרון של bouin לשמר את המבנה הרשתית במהלך הניתוח והאפשרות5. למרבה הצער, תיקונים חזקים מובילים לעיתים קרובות לאור הזריחה המשופרת והמסיכה כתוצאה משינוי כימי של אפיסקופים6. מצד שני, תיקונים מתון יותר, כמו 4% פאראמפורמלדהיד (בתחתית) יכולים להקל על כמה מהחפצים האלה, אבל דורשים לעבור ניתוח קפדני והקפדה כדי לשמר את המבנה הרשתית האופטימלי. הכדורגלן חודר במהירות לרקמות, אבל מצמצמים את החלבונים מאוד לאט, ומפחיתים את הסיכון של הסוואה. מאז הדגירה התחתית זמן קצר היא קיבעון קל יחסית, רקמות לעתים קרובות דורשים קיפאון מהיר כדי לשמר אנטיגנים. חשוב להימנע היווצרות גביש הקרח במהלך הקפאת רקמות כפי שהם לעוות ולפגוע היושרה של תאים ורקמות7.
כאן אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים וסטנדרטיים עבור ניתוח, קיבעון, הגנה על ההקפאה של כוסות העכבר האחורי העינית התשואה נתונים IHC עקבית ואמין.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1128px;" width="1129">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm)</td>
			<td style="width:209px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#MA-48</td>
			<td style="width:365px;">For liquid nitrogen (Figure 1E)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Aluminum foil&#160;</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Cauterizer&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Bovie</td>
			<td style="width:236px;">#AA01</td>
			<td style="width:365px;">To mark eye orientation (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:236px;">#72703-D</td>
			<td style="width:365px;">For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#15002-08</td>
			<td style="width:365px;">To circumferentially cut the cornea (Figure 1B)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Dental wax-coated 35mm dissection dish</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">For eye cup dissection (Figure 1C)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Dissecting microscope&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Leica, Houston, USA&#160;</td>
			<td style="width:236px;">MZ12.5 High-performance stereomicroscope</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Micro Knives - Plastic Handle&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#10315-12</td>
			<td style="width:365px;">To make a small incision at the burn mark (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Pink dental wax&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#72660</td>
			<td style="width:365px;">For coating dissection dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Slide Rack and Coverplate</td>
			<td style="width:209px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:236px;">#36107</td>
			<td style="width:365px;">For retinal IHC (Figure 1G)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Stainless Steel Beaker (89 x 114mm)</td>
			<td style="width:209px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#MA-40</td>
			<td style="width:365px;">For isopentane bath (Figure 1E)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Styrofoam box</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">For insulated cooler</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Thin forceps Dumont #5&#160;&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#11254-20</td>
			<td style="width:365px;">To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Tissue-Tek cryomold&#160; (10mm x 10mm x 5mm)</td>
			<td style="width:209px;">Electron Miscroscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#62534-10</td>
			<td style="width:365px;">Mold for OCT embedding</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Buffers and Reagents</td>
			<td style="width:209px;">Company</td>
			<td style="width:236px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:365px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Blocking solution</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="77">
			<td height="77" style="height:77px;width:317px;">Gelvatol (anti-fading mounting media)</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).&#160; Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops).&#160; Store in amber drop bottle at 4&#176;C&#160; (8).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Hoechst 33342 1000x Stock</td>
			<td style="width:209px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:236px;">#62249</td>
			<td style="width:365px;">1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4&#176;C for up to 1 year or at -20&#176;C for long term storage. Prepare fresh&#160; at 1 ug/mL (1x)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Isopentane, 99%&#160;</td>
			<td style="width:209px;">GFS Chemicals</td>
			<td style="width:236px;">#2961</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:317px;">Paraformaldehyde (PFA) in PBS</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#15710</td>
			<td style="width:365px;">Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4&#176;C in the dark.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:317px;">Permeabilization solution</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.&#160; Prepare fresh.</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:317px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:209px;">Bioworld&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#41620015-20</td>
			<td style="width:365px;">0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.&#160; Prepared from 10x stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Sucrose solutions</td>
			<td style="width:209px;">Fisher Scientific&#160;&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#S-5-500</td>
			<td style="width:365px;">Dissolve the appropriate amount of sucrose in&#160; 37&#176;C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4&#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Tissue-Tek OCT-compound&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Sakura</td>
			<td style="width:236px;">&#160;#4583</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Antibodies</td>
			<td style="width:209px;">Company</td>
			<td style="width:236px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:365px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-calbindin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8666</td>
			<td>To label horinzotal cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-GAD65</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB5082</td>
			<td>To label GABAergic amacrine cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-GS</td>
			<td>BD Transduction</td>
			<td>610517</td>
			<td>To label M&#252;ller cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-rhodopsin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5316</td>
			<td>To label rods</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of mouse retinal cryo-sections for immunohistochemistry

הכנת סעיפים באיכות גבוהה עכבר העין עבור אימונוהיסטוכימיה (IHC) הוא קריטי להערכת מבנה ותפקוד רשתית ולקביעת מנגנונים המשמשים מחלות רשתית. שמירה על השלמות המבנית לאורך הכנת הרקמה חיונית להשגת נתונים ברשתית שניתן לתחזק, אך יכול להיות מאתגר בשל שבריאת והמורכבות של האדריכלות הרשתית. תיקונים חזקים כמו 10% פורמלין או הפתרון של bouin לשמר בצורה אופטימלית את המבנה הרשתית, הם לעתים קרובות לעכב את ניתוח ihc על ידי שיפור הרקע של זריחה ו/או הפוחתת נוגדן האינטראקציות, תהליך המכונה מיסוך אפירופה. תיקונים מתון יותר, מצד שני, כמו 4% פאראפורמלדהיד, מפחית את הרקע של זריחה ואפירופה-מיסוך, טכניקות הניתוח מוקפד חייב להיות מנוצל כדי לשמר את המבנה הרשתית. במאמר זה, אנו מציגים שיטה מקיפה כדי להכין את העכבר כוסות האחורי העינית עבור IHC כי הוא מספיק כדי לשמר את האינטראקציות הנוגדן ביותר מבלי לאבד שלמות מבנית ברשתית. אנו כוללים נציג IHC עם נוגדנים שונים סוג תא סמנים ברשתית כדי להמחיש שימור רקמות וכיוון בתנאים מיטביים ותת אופטימלית. המטרה שלנו היא לייעל את מחקרי IHC של הרשתית על ידי מתן פרוטוקול מלאה מתוך ניתוח הספל האחורי העינית ל-IHC.

כדי להמחיש כיצד פרוטוקולים אלה, להבטיח שימור הרשתית אופטימלית עבור ihc, אנו בדקו מקטעים ברשתית מ P28 WT עכברים (C57BL/6n) עם נוגדנים לרודוסין (הסמן תא קולט אור)8, גלוטמית חומצה decarboxylase 65 (Gad65, תא אמקרין marker)9, גלוטמין הבורסה (GS, מסמן תא מולר)10, ו calb...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry at JoVE.com

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

דו ח זה מתאר שיטות מקיפות של הכנת העכבר הקפוא מקטעים רשתית עבור אימונוהיסטוכימיה (IHC). השיטות שתוארו כוללות ניתוח של הספל האחורי העינית, קיבעון הפרפורמלדהיד, הטבעה של טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) מדיה ורקמות כיוון, הסרת וכתמים חיסוני.

הכנת שאיפה של העכבר רשתית-סעיפים עבור אימונוהיסטוכימיה

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

ניתוח רשתית העכבר הוא תהליך עדין באמת בשל הגודל והצורה של העיניים ואת השבריריות של סעיף הרשתית. הכרחי לתרגול, בעל פרוטוקול מפורט המספקים שיטה יעילה וטיפים הוא המפתח לנתח רשתית באיכות גבוהה ומקטע. אנו מספקים טיפים וייעוץ כדי לסייע לחוקרים להימנע ממלכודות נפוצות ולקבל כמה סעיפים רשתית באיכות גבוהה המתאימים לאימונוהיסטוכימיה.סמן את החלק הזמני של העין של עכבר המתת סנפיר באמצעות צרוב זנב על ידי נגיעה בקרנית בקלילות רבה ולא יותר משבריר שנייה כדי לשרוף מעט את הקרנית ולהימנע מלעשות חור. מיד לאחר מכן השתמשו בדומונט 545 מדפים מעוקלים כדי להחנות עיני עכבר. מניחים את העיניים ב cryotube 1.5 מיליליטר עם מיליליטר אחד של 4%PFA ו PBS ודגירה במשך 15 דקות על קרח.לאחר מכן, להעביר את העיניים קבוע באמצעות מדפים מעוקל Dumont 545 לצלחת ניתוח 35 מילימטר שונה מלא PBS וממוקמים תחת מיקרוסקופ ניתוח. השתמש microknife לעשות חתך קטן על סימן הכוויה בניצב אל וקצת מעל הגבול limbus של הקרנית. הכנס מספריים מעוגלים לתוך החתך ולבצע חתך היקפי של הקרנית בעקבות הלימבוס.לאחר מכן, באמצעות מדפים דקים של Dumont 5, להסיר את הקרנית, לחלץ את העדשה, ולהרים אותו בעדינות מן החלק האחורי של העין. הגוף הזינה ית לצאת עם העדשה ואת הרשתית יהיה גלוי כמו משטח לבן המכסה את החלק הפנימי של העין האחורית. לשטוף את כוסות העין המבודדות פעמיים במיליליטר אחד של PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.כדי להגן על כוסות העיניים, יש לצייד אותן ב-15% סוכרוז ו-PBS למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס עד שהן שוקעות. לאחר מכן מעבירים את כוסות העיניים ל-30% סוכרוז ו-PBS למשך שעתיים עד שלוש שעות עד שהם שוקעים. מניחים את כוסות העין ב OCT ב 10 על ידי 10 מילימטר קריו-תבניות להטמיע.תחת מיקרוסקופ ניתוח, לכוון את העין בתבנית קריו לאורך ציר הגחון הגבי שלה על ידי סיבוב העין עד סימן הכוויה הוא על גבי. עצב הראייה הוא אחד שמאלה ואת חלק לחתוך את התבנית פונה ימינה. כדי לצלם להקפיא את רקמת הרשתית, לטבול את ההקפאה-עובש לפחות חמש דקות בסק מתכת המכיל isopentane ולאחר מכן למקם את הקוטקר בחנקן נוזלי עד שליש מגובה התוך של המקור.מוציאים את הבלוק הקפוא, עוטפים אותו בנייר אלומיניום, ומאחסנים במינוס 80 מעלות צלזיוס. השתמש בעט או שארפי כדי לסמן את הבלוק הקפוא כדי לתעד את הכיוון שלו. לאחר התאמת טמפרטורת ההקפאה בין מינוס 20 למינוס 25 מעלות צלזיוס, מניחים את התבניות המכילות את כוסות העיניים המוטבעות בפנים ומאפשרים להם לצייד לטמפרטורת ההקפאה למשך שעה.התקן את הבלוק ב cryostat עם כיוון הגחון הגבי ולהתחיל לחתוך 10 חלקים טוריים עבים מיקרומטר. מניחים בזהירות את קטעי הרשתית על שקופיות מיקרוסקופ מבואר ממוספר ולאחר מכן לאחסן בתיבות שקופיות במינוס 20 מעלות צלזיוס או מינוס 80 מעלות צלזיוס עד מוכן immunostaining. אימונוהיסטוכימיה עם נוגדנים לרודופסין, סמן פוטורצפטור, חומצה גלוטמית decarboxylase 65, וסמן תאים אמקרין, סינתזת גלוטמין וסמן תא מולר, ו calbindin, סמן תא אופקי בוצע על קטעי רשתית.התוצאות מצביעות על כך שפרוטוקול זה מניב סעיפי רשתית באיכות גבוהה ונשמר היטב שלא כמו בקטעי רשתית באיכות ירודה המתקבלים מפרוטוקול אחר. הקטעים הפנימיים והחיצויים העשירים ברודופסין נשארים אנכיים וללא כל הפרדה מאפיתל פיגמנט רשתית. Interneurons, כגון תאי אמקרין חיוביים Gad65, נשארים מרודים כראוי בתוך השכבה הגרעינית הפנימית ואת שכבת plexiform הפנימית.כמו כן, תאי מולר נשמרים היטב עם סומא מיושר כראוי בתהליכים ציטופלסמיים המשתרעים משכבת תא הגנגליון לשכבה הגרעינית החיצונית. יתר על כן, תאים אופקיים מוגדרים היטב ניתנים לגילוי בשכבה הגרעינית הפנימית ובגבול שכבת הפלקסיפורם החיצוני. חשוב לסמן את אזור טופר של העיניים ולשמור על הכיוון במהלך הטבעה.תמיד להכין paraformaldehyde מתחת למכסה המנוע עם ציוד מגן אישי המתאים.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

הכנת רקמות מוח עכבר מיקרוסקופית Immunoelectron

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

הצמד תיקון הקלטות מתא עצב עכבר רשתית בהכנת Dark המותאמות פרוסה

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

הכנה רשתית מבודד להקליט תגובה האור תווית גנטית לתאי הגנגליון ברשתית

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Dissection העין עכבר על הר שלם של האפיתל פיגמנט רשתית

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

הכנה של רקמת מוח הפרימאטים לא-אנושית עבור טרום הטבעת אימונוהיסטוכימיה ו מיקרוסקופי אלקטרונים

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

טומוגרפיה אופטית קוהרנטית: הדמיה העכבר גנגליון תאים In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Optimization of the Retinal Vein Occlusion Mouse Model to Limit Variability

אופטימיזציה של מודל העכבר לחסימת ורידים ברשתית כדי להגביל את השונות

Mouse models of retinal vein occlusion (RVO) are often used in ophthalmology to study hypoxic-ischemic injury in the neural retina. In this report, a ...

Mouse Retina Isolation and Methanol Treatment for Studying Retinal Ganglion Cells

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells (Video) | JoVE 

תכשיר שלם על בסיס מתנול לחקר תאי גנגליון ברשתית

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...

Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry

זיהוי של חלבון פריון חריג על ידי אימונוהיסטוכימיה

Abnormal prion proteins (PrPSc) are the disease-associated isoform of cellular prion protein and diagnostic markers of transmissible spongiform ...

Mouse Retina OCT Fibergram Alignment with Confocal Images

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

Advancements in In Vivo and Ex Vivo Retinal Imaging for Improved Glaucoma Diagnosis and Treatment (Video) | JoVE

יישור של טומוגרפיית טומוגרפיה קוהרנטית אופטית של אור נראה עם תמונות קונפוקליות של אותה רשתית עכבר

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...