Name: preparation of mouse retinal cryo-sections for immunohistochemistry
Uploaded: 2019-07-01T14:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto da fondi del NIH (RO1-GMO97327) e della University Research Foundation (UPenn). Ringraziamo in particolare Svetlana Savina per il suo aiuto nello sviluppo del protocollo di immunohistochimica, Gordon Ruthel (Università della Pennsylvania) e Penn Vet Imaging Core per l'assistenza con la microscopia e Leslie King, Ph.D. per la lettura critica di questo manoscritto .

Tutti i metodi qui descritti sono stati realizzati in stretta conformità con le raccomandazioni della Guida nazionale per la cura e l'uso degli animali da laboratorio fornite dall'Istituto di risorse animali da laboratorio e sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università della Pennsylvania.
Tutti gli strumenti e le attrezzature per i metodi sono illustrati nella Figura 1 ed elencati nella tabella dei mat...

<ol>
	<li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labelled+antigens+and+antibodies.">Labelled antigens and antibodies.</a> Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).</li><li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+antibodies+as+histochemical+tools.">Fluorescent antibodies as histochemical tools.</a> Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).</li><li>Coons, A. H., Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+antigen+in+tissue+cells;+improvements+in+a+method+for+the+detection+of+antigen+by+means+of+fluorescent+antibody.">Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody.</a> Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).</li><li>Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artefacts+in+histopathology.">Artefacts in histopathology.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).</li><li>Hartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+sections+from+Bouin-fixed+material+in+histopathology.">Frozen sections from Bouin-fixed material in histopathology.</a> Stain Technology. 20, 113 (1945).</li><li>Benerini Gatta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+alternative+fixatives+to+formalin+in+diagnostic+pathology.">Application of alternative fixatives to formalin in diagnostic pathology.</a> European Journal of Histochemistry. 56 (2), e12 (2012).</li><li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+cryoultramicrotomy+to+immunocytochemistry.">Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry.</a> Journal of Microscopy. 143 (Pt 2), 139-149 (1986).</li><li>Imai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+properties+of+rhodopsin+and+rod+function.">Molecular properties of rhodopsin and rod function.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6677-6684 (2007).</li><li>Lee, J. W., Lim, M. Y., Park, Y. S., Park, S. J., Kim, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reexamination+of+Dopaminergic+Amacrine+Cells+in+the+Rabbit+Retina:+Confocal+Analysis+with+Double-+and+Triple-labeling+Immunohistochemistry.">Reexamination of Dopaminergic Amacrine Cells in the Rabbit Retina: Confocal Analysis with Double- and Triple-labeling Immunohistochemistry.</a> Experimental Neurobiology. 26 (6), 329-338 (2017).</li><li>Bringmann, A., Grosche, A., Pannicke, T., Reichenbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+and+Glutamate+Uptake+and+Metabolism+in+Retinal+Glial+(Muller)+Cells.">GABA and Glutamate Uptake and Metabolism in Retinal Glial (Muller) Cells.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 4, 48 (2013).</li><li>Nakhai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ptf1a+is+essential+for+the+differentiation+of+GABAergic+and+glycinergic+amacrine+cells+and+horizontal+cells+in+the+mouse+retina.">Ptf1a is essential for the differentiation of GABAergic and glycinergic amacrine cells and horizontal cells in the mouse retina.</a> Development. 134 (6), 1151-1160 (2007).</li><li>Applebury, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+cone+photoreceptor:+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning.">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).</li></ol>

La dissezione della retina del topo è un processo delicato a causa delle piccole dimensioni e della forma degli occhi del topo e della fragilità del tessuto retinica. Anche se eseguire dissezione di alta qualità è una questione di pratica, avere un protocollo dettagliato, fornire metodi e suggerimenti efficienti è una necessità per ottenere sezioni retiniche e IHC. Oltre ai protocolli descritti qui, ci sono diversi suggerimenti che consentono sezioni retiniche coerenti di alta qualità che sono adatti per IHC ripro...

L'immunohistochimica (IHC) è una potente tecnica per localizzare specifiche proteine e strutture cellulari nei tessuti in situ1,2,3. Metodi di fissazione inappropriati e sezionamento non ottimale di tessuti complessi possono interrompere la struttura del tessuto, generare un'elevata colorazione di fondo o diminuire le interazioni anticorpo-epitopo, con conseguente colorazione artefatti e conseguente interpretazione errata di Dati IHC4. Poiché la retina vertebrata è un organo neurale complesso e altamente organizzato composto da strati di fotorecettori interconnessi, interneuroni e cellule gangliari, è molto fragile e può essere facilmente interrotto durante la dissezione e la sezionamento. Un protocollo dettagliato, standardizzato e convalidato dalla dissezione dell'occhio del mouse e dall'orientamento all'immunostaining contribuirà a ridurre significativamente gli artefatti IHC, aumentando così l'affidabilità dei risultati e consentendo dati comparativi più accurati analisi.
Ci sono molti protocolli per la preparazione dei tessuti per IHC, tuttavia, non tutti sono adatti per il tessuto retinica. Fissativi forti come 10% formalina o soluzione di Bouin preservare la struttura della retina durante la dissezione e sezionamento5. Sfortunatamente, forti fissativi spesso portano alla maggiore fluorescenza di fondo e mascheramento dell'epitopo a causa della modifica chimica degli epitopi6. D'altra parte, fissativi più miti, come 4% paraformaldeide (PFA) possono alleviare alcuni di questi artefatti, ma richiedono una dissezione meticolosa e la sezionamento per preservare la struttura della retina ottimale. Il PFA penetra rapidamente nel tessuto, ma si incrocia le proteine molto lentamente, riducendo il rischio di mascheramento dell'epitopo. Da breve tempo l'incubazione di PFA è una fissazione relativamente lieve, i tessuti spesso richiedono un congelamento rapido per preservare gli antigeni. È importante evitare la formazione di cristalli di ghiaccio durante il congelamento dei tessuti in quanto distorcono e danneggiano l'integrità delle cellule e dei tessuti7.
Qui descriviamo protocolli dettagliati e standardizzati per la dissezione, la fissazione e la crio-protezione delle tazze posteriori oculari del topo che producono dati IHC coerenti e affidabili.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1128px;" width="1129">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm)</td>
			<td style="width:209px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#MA-48</td>
			<td style="width:365px;">For liquid nitrogen (Figure 1E)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Aluminum foil&#160;</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Cauterizer&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Bovie</td>
			<td style="width:236px;">#AA01</td>
			<td style="width:365px;">To mark eye orientation (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:236px;">#72703-D</td>
			<td style="width:365px;">For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#15002-08</td>
			<td style="width:365px;">To circumferentially cut the cornea (Figure 1B)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Dental wax-coated 35mm dissection dish</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">For eye cup dissection (Figure 1C)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Dissecting microscope&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Leica, Houston, USA&#160;</td>
			<td style="width:236px;">MZ12.5 High-performance stereomicroscope</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Micro Knives - Plastic Handle&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#10315-12</td>
			<td style="width:365px;">To make a small incision at the burn mark (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Pink dental wax&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#72660</td>
			<td style="width:365px;">For coating dissection dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Slide Rack and Coverplate</td>
			<td style="width:209px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:236px;">#36107</td>
			<td style="width:365px;">For retinal IHC (Figure 1G)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Stainless Steel Beaker (89 x 114mm)</td>
			<td style="width:209px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#MA-40</td>
			<td style="width:365px;">For isopentane bath (Figure 1E)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Styrofoam box</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">For insulated cooler</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Thin forceps Dumont #5&#160;&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#11254-20</td>
			<td style="width:365px;">To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Tissue-Tek cryomold&#160; (10mm x 10mm x 5mm)</td>
			<td style="width:209px;">Electron Miscroscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#62534-10</td>
			<td style="width:365px;">Mold for OCT embedding</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Buffers and Reagents</td>
			<td style="width:209px;">Company</td>
			<td style="width:236px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:365px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Blocking solution</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="77">
			<td height="77" style="height:77px;width:317px;">Gelvatol (anti-fading mounting media)</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).&#160; Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops).&#160; Store in amber drop bottle at 4&#176;C&#160; (8).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Hoechst 33342 1000x Stock</td>
			<td style="width:209px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:236px;">#62249</td>
			<td style="width:365px;">1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4&#176;C for up to 1 year or at -20&#176;C for long term storage. Prepare fresh&#160; at 1 ug/mL (1x)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Isopentane, 99%&#160;</td>
			<td style="width:209px;">GFS Chemicals</td>
			<td style="width:236px;">#2961</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:317px;">Paraformaldehyde (PFA) in PBS</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#15710</td>
			<td style="width:365px;">Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4&#176;C in the dark.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:317px;">Permeabilization solution</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.&#160; Prepare fresh.</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:317px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:209px;">Bioworld&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#41620015-20</td>
			<td style="width:365px;">0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.&#160; Prepared from 10x stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Sucrose solutions</td>
			<td style="width:209px;">Fisher Scientific&#160;&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#S-5-500</td>
			<td style="width:365px;">Dissolve the appropriate amount of sucrose in&#160; 37&#176;C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4&#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Tissue-Tek OCT-compound&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Sakura</td>
			<td style="width:236px;">&#160;#4583</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Antibodies</td>
			<td style="width:209px;">Company</td>
			<td style="width:236px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:365px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-calbindin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8666</td>
			<td>To label horinzotal cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-GAD65</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB5082</td>
			<td>To label GABAergic amacrine cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-GS</td>
			<td>BD Transduction</td>
			<td>610517</td>
			<td>To label M&#252;ller cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-rhodopsin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5316</td>
			<td>To label rods</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of mouse retinal cryo-sections for immunohistochemistry

La preparazione di sezioni oculari del topo di alta qualità per l'immunoistochimica (IHC) è fondamentale per valutare la struttura e la funzione della retina e per determinare i meccanismi alla base delle malattie retiniche. Mantenere l'integrità strutturale durante la preparazione dei tessuti è fondamentale per ottenere dati IHC retinici riproducibili, ma può essere difficile a causa della fragilità e della complessità della citoarchitettura retinica. Fissativi forti come 10% formalina o soluzione di Bouin preservare in modo ottimale la struttura della retina, spesso impediscono l'analisi IHC migliorando la fluorescenza di fondo e/ o diminuendo le interazioni anticorpo-epitope, un processo noto come mascheramento epitopiano. I fissativi più lievi, d'altra parte, come il 4% di paraformaldeide, riduce la fluorescenza di fondo e la mascheratura epitope, devono essere utilizzate tecniche di dissezione meticolose per preservare la struttura retinica. In questo articolo, presentiamo un metodo completo per preparare tazze posteriori oculari del topo per IHC che è sufficiente per preservare la maggior parte delle interazioni anticorpo-epitopo senza perdita di integrità strutturale retinica. Includiamo l'IHC rappresentativo con anticorpi a vari marcatori di tipo cellule retiniche per illustrare la conservazione e l'orientamento dei tessuti in condizioni ottimali e non ottimali. Il nostro obiettivo è ottimizzare gli studi IHC della retina fornendo un protocollo completo dalla dissezione della tazza posteriore oculare all'IHC.

Per illustrare come questi protocolli, garantire la conservazione ottimale della retina per IHC, abbiamo sondato le sezioni retiniche da topi P28 WT (C57BL/6N) con anticorpi a rodopsina (un marcatore fotorecettore)8, acido glutammico decarboxylase 65 (Gad65, una cellula amacina marcatore)9, sintetasi di glutammina (GS, un marcatore di cellule M-ller)10e calbindin (un marcatore di cella orizzontale)11...

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Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Questo rapporto descrive metodi completi per la preparazione di sezioni della retina del topo congelato per l'immunohistochimica (IHC). I metodi descritti includono la dissezione della coppa posteriore oculare, la fissazione della paraformaldeide, l'incorporamento nei supporti e nell'orientamento dei tessuti della temperatura di taglio ottimale (OCT), il sezionamento e l'immunostaining.

Preparazione delle sezioni ricrello della retina

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

La dissezione retinica del topo è un processo davvero delicato a causa delle dimensioni e della forma degli occhi e della fragilità della sezione della retina. Imperativo da praticare, avere un protocollo dettagliato che fornisca metodi e suggerimenti efficienti è la chiave per la dissezione retinica e la sezione di alta qualità. Forniamo suggerimenti e consigli per aiutare il ricercatore a evitare insidie comuni e ottenere alcune sezioni retiniche di alta qualità adatte all'immunoistochimica.Segnare la parte temporale dell'occhio di un topo eutanasiato usando un cauterizzatore di coda toccando la cornea molto leggermente e per non più di una frazione di secondo per bruciare leggermente la cornea ed evitare di fare un buco. Subito dopo usava le forcep Dumont 545 curve per enucleare gli occhi del topo. Mettere gli occhi in un criotubo da 1,5 millilitri con un millilitro del 4%PFA e PBS e incubare per 15 minuti sul ghiaccio.Quindi, trasferire gli occhi fissi utilizzando le forcep Dumont 545 curve in un piatto di dissezione modificato da 35 millimetri riempito con PBS e posto al microscopio sezionato. Utilizzare un microknife per fare una piccola incisione al segno di bruciatura perpendicolare e appena sopra il bordo limbo della cornea. Inserire forbici curve nell'incisione ed eseguire un taglio circonferenziale della cornea seguendo il limbo.Quindi, usando sottili forcep Dumont 5, rimuovere la cornea, estrarre la lente e sollevarla delicatamente lontano dalla porzione posteriore dell'occhio. Il corpo vitreo verrà fuori con l'obiettivo e la retina sarà visibile come una superficie bianca che copre l'interno della coppa degli occhi posteriore. Lavare le coppe per gli occhi isolate due volte in un millilitro di PBS per 10 minuti a temperatura ambiente.Per crioprotettare le coppe per gli occhi, equilibratele nel 15% di saccarosio e PBS durante la notte a quattro gradi Celsius fino a quando non affondano. Quindi trasferire le coppe per gli occhi al 30% di saccarosio e PBS per due o tre ore fino a quando non affondano. Posizionare le coppe per gli occhi in OCT in crio-stampi da 10 per 10 millimetri per l'incorporamento.Al microscopio sezionato, orientare l'occhio nel crio-muffa lungo il suo asse ventrale dorsale ruotando l'occhio fino a quando il segno di bruciatura è in cima. Il nervo ottico è uno a sinistra e la parte ritaglia dello stampo si affaccia a destra. Per congelare il tessuto retinale, immergere il criosta stampo per almeno cinque minuti in un bicchiere metallico contenente isopentane e quindi posizionare il becher in azoto liquido fino a un terzo dell'altezza del becher.Rimuovere il blocco congelato, avvolgerlo in un foglio di alluminio e conservarlo a meno 80 gradi Celsius. Utilizzare una penna o una sharpie per contrassegnare il blocco bloccato per registrarne l'orientamento. Dopo aver regolato la temperatura del criostato tra meno 20 e meno 25 gradi Celsius, posizionare gli stampi contenenti le coppe oculari incorporate all'interno e consentire loro di equilibrare alla temperatura del criostato per un'ora.Installare il blocco nel criostato con l'orientamento ventrale dorsale e iniziare a tagliare sezioni seriali spesse 10 micrometri. Posizionare con cura le sezioni retiniche su vetrini al microscopio annotati e numerati e quindi conservare in caselle di scorrimento a meno 20 gradi Celsius o meno 80 gradi Celsius fino a quando non sono pronti per l'immunosottenzione. Immunoistochimica con anticorpi contro la rodopsina, un marcatore fotorecettore, decarbossilasi dell'acido glutammico 65, marcatore cellulare di amacrina, glutammina sintetasi e marcatore cellulare muller, e calbindina, un marcatore cellulare orizzontale è stato eseguito su sezioni retiniche.I risultati indicano che questo protocollo produce sezioni retiniche di alta qualità e ben conservate a differenza delle sezioni retiniche di scarsa qualità ottenute da un protocollo diverso. I segmenti interni ed esterni ricchi di rodopsina rimangono verticali e intatti con poca o nessuna separazione dall'sovrascrivere l'epitelio pigmentato retinico. Gli internaurioni, come le cellule di amacrina positiva gad65, rimangono adeguatamente stratificati all'interno dello strato nucleare interno e dello strato plexiforme interno.Inoltre, le cellule di Muller rimangono ben conservate con soma correttamente allineato nei processi citoplasmatici che vanno dallo strato cellulare ganglio allo strato nucleare esterno. Inoltre, cellule orizzontali ben definite sono rilevabili allo strato nucleare interno e al bordo esterno dello strato di plexiforme. È importante contrassegnare la regione topper degli occhi e mantenere l'orientamento durante l'incorporamento.Preparare sempre la paraformaldeide sotto il cofano con gli opportuni dispositivi di protezione individuale.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Preparazione del tessuto cerebrale del mouse per la microscopia Immunoelectron

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Ricerca

Neuroscienze

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Bloccare Registrazioni patch da neuroni della retina del mouse in un Dark-adattato Preparazione Slice

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

Una preparazione isolati retina per registrare Risposta Luce da Geneticamente etichetta cellule gangliari della retina

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Dissezione di un occhio mouse per un monte intero di dell&#39;epitelio pigmentato retinico

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Preparazione del tessuto cerebrale Primate non umano per la pre-embedding immunoistochimica e microscopia elettronica

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Tomografia a coerenza ottica: Imaging Mouse ganglionari cellule In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Optimization of the Retinal Vein Occlusion Mouse Model to Limit Variability

Ottimizzazione del modello murino di occlusione venosa retinica per limitare la variabilità

Mouse models of retinal vein occlusion (RVO) are often used in ophthalmology to study hypoxic-ischemic injury in the neural retina. In this report, a ...

Mouse Retina Isolation and Methanol Treatment for Studying Retinal Ganglion Cells

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells (Video) | JoVE 

Preparato a base di metanolo a montaggio intero per lo studio delle cellule gangliari retiniche

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...

Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry

Rilevazione di proteine prioniche anomale mediante immunoistochimica

Abnormal prion proteins (PrPSc) are the disease-associated isoform of cellular prion protein and diagnostic markers of transmissible spongiform ...

Mouse Retina OCT Fibergram Alignment with Confocal Images

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

Advancements in In Vivo and Ex Vivo Retinal Imaging for Improved Glaucoma Diagnosis and Treatment (Video) | JoVE

Allineamento di fibrogrammi per tomografia a coerenza ottica a luce visibile con immagini confocali della stessa retina murina

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...