Name: preparation of mouse retinal cryo-sections for immunohistochemistry
Uploaded: 2019-07-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av midler fra NIH (RO1-GMO97327) og University Research Foundation (UPenn). Vi takker spesielt Svetlana Savina for hennes hjelp til å utvikle immunhistokjemi protokollen, Gordon Ruthel (University of Pennsylvania) og penn vet Imaging Core for å få hjelp med mikroskopi og Leslie King, Ph.D. for kritisk lesing dette manuskriptet .

Alle metodene som er beskrevet her ble utført i nøye samsvar med anbefalingene i National Institutes of Health guide for omsorg og bruk av Laboratoriedyr levert av Institutt for laboratorium Animal Resources og ble godkjent av Institusjonelle Animal Care og bruk komité ved University of Pennsylvania.
Alle verktøy og utstyr for metodene er vist i figur 1 og listet i materialfortegnelsen.
1. Mus øye utskraping, Eye Cup...

<ol>
	<li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labelled+antigens+and+antibodies.">Labelled antigens and antibodies.</a> Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).</li><li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+antibodies+as+histochemical+tools.">Fluorescent antibodies as histochemical tools.</a> Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).</li><li>Coons, A. H., Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+antigen+in+tissue+cells;+improvements+in+a+method+for+the+detection+of+antigen+by+means+of+fluorescent+antibody.">Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody.</a> Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).</li><li>Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artefacts+in+histopathology.">Artefacts in histopathology.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).</li><li>Hartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+sections+from+Bouin-fixed+material+in+histopathology.">Frozen sections from Bouin-fixed material in histopathology.</a> Stain Technology. 20, 113 (1945).</li><li>Benerini Gatta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+alternative+fixatives+to+formalin+in+diagnostic+pathology.">Application of alternative fixatives to formalin in diagnostic pathology.</a> European Journal of Histochemistry. 56 (2), e12 (2012).</li><li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+cryoultramicrotomy+to+immunocytochemistry.">Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry.</a> Journal of Microscopy. 143 (Pt 2), 139-149 (1986).</li><li>Imai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+properties+of+rhodopsin+and+rod+function.">Molecular properties of rhodopsin and rod function.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6677-6684 (2007).</li><li>Lee, J. W., Lim, M. Y., Park, Y. S., Park, S. J., Kim, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reexamination+of+Dopaminergic+Amacrine+Cells+in+the+Rabbit+Retina:+Confocal+Analysis+with+Double-+and+Triple-labeling+Immunohistochemistry.">Reexamination of Dopaminergic Amacrine Cells in the Rabbit Retina: Confocal Analysis with Double- and Triple-labeling Immunohistochemistry.</a> Experimental Neurobiology. 26 (6), 329-338 (2017).</li><li>Bringmann, A., Grosche, A., Pannicke, T., Reichenbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+and+Glutamate+Uptake+and+Metabolism+in+Retinal+Glial+(Muller)+Cells.">GABA and Glutamate Uptake and Metabolism in Retinal Glial (Muller) Cells.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 4, 48 (2013).</li><li>Nakhai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ptf1a+is+essential+for+the+differentiation+of+GABAergic+and+glycinergic+amacrine+cells+and+horizontal+cells+in+the+mouse+retina.">Ptf1a is essential for the differentiation of GABAergic and glycinergic amacrine cells and horizontal cells in the mouse retina.</a> Development. 134 (6), 1151-1160 (2007).</li><li>Applebury, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+cone+photoreceptor:+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning.">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).</li></ol>

Mouse Retina disseksjon er en delikat prosess på grunn av den lille størrelsen og formen på musen øyne og skjørhet av retinal vev. Selv om utføring av høy kvalitet disseksjon er et spørsmål om praksis, har en detaljert protokoll, som gir effektive metoder og tips er en nødvendighet for å få tak i Netthinne seksjoner og IHC. I tillegg til protokollene beskrevet her, er det flere tips som gir konsistent høy kvalitet retinal seksjoner som er egnet for reproduserbar IHC.
Før starter ...

Immunhistokjemi (IHC) er en kraftig teknikk for lokalisere av spesifikke proteiner og cellulære strukturer i vev i situ1,2,3. Upassende fiksering metoder og sub-optimal snitting av komplekse vev kan forstyrre vev struktur, generere høy bakgrunn farging eller redusere antistoff-epitope interaksjoner, noe som resulterer i flekker gjenstander og påfølgende feil tolkning av IHC data4. Som virveldyr Retina er et komplekst og svært organisert neural organ bestående av lag av sammenkoblede fotoreseptorene, interneurons og Ganglion celler, er det svært skjøre og kan lett forstyrres under disseksjon og snitting. En detaljert, standardisert og validert protokoll fra mus øye disseksjon og orientering til immunostaining vil bidra til å redusere IHC-artefakter betraktelig, og dermed øke påliteligheten til resultatene og gi mer nøyaktige sammenlignings data Analyse.
Det er mange protokoller for vev forberedelse for IHC, men ikke alle er egnet for retinal vev. Sterk fiksativene som 10% formalin eller Bouin ' s løsning bevare retinal struktur under disseksjon og skjæring5. Beklageligvis, kraftig fiksativene ofte føre til det forsterket miljøet fluorescens og epitope maske på grunn av det kjemikalie modifisering av epitopes6. På den annen side, mildere fiksativene, som 4% paraformaldehyde (PFA) kan lindre noen av disse gjenstandene, men krever grundige disseksjon og snitting for å bevare den optimale retinal struktur. PFA penetrerer raskt vev, men kryss-koblinger proteiner svært langsomt, redusere risikoen for epitope maskering. Siden kort tid PFA inkubasjons er en relativt mild fiksering, vev ofte krever rask frysing å bevare antigener. Det er viktig å unngå iskrystall formasjon under vev frysing som de forvrenge og skade integriteten av celler og vev7.
Her beskriver vi detaljerte og standardiserte protokoller for disseksjon, fiksering, og fryse beskyttelse av musen øye bakre kopper som gir konsistente og pålitelige IHC data.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1128px;" width="1129">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm)</td>
			<td style="width:209px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#MA-48</td>
			<td style="width:365px;">For liquid nitrogen (Figure 1E)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Aluminum foil&#160;</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Cauterizer&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Bovie</td>
			<td style="width:236px;">#AA01</td>
			<td style="width:365px;">To mark eye orientation (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:236px;">#72703-D</td>
			<td style="width:365px;">For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#15002-08</td>
			<td style="width:365px;">To circumferentially cut the cornea (Figure 1B)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Dental wax-coated 35mm dissection dish</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">For eye cup dissection (Figure 1C)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Dissecting microscope&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Leica, Houston, USA&#160;</td>
			<td style="width:236px;">MZ12.5 High-performance stereomicroscope</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Micro Knives - Plastic Handle&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#10315-12</td>
			<td style="width:365px;">To make a small incision at the burn mark (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Pink dental wax&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#72660</td>
			<td style="width:365px;">For coating dissection dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Slide Rack and Coverplate</td>
			<td style="width:209px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:236px;">#36107</td>
			<td style="width:365px;">For retinal IHC (Figure 1G)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Stainless Steel Beaker (89 x 114mm)</td>
			<td style="width:209px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#MA-40</td>
			<td style="width:365px;">For isopentane bath (Figure 1E)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Styrofoam box</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">For insulated cooler</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Thin forceps Dumont #5&#160;&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#11254-20</td>
			<td style="width:365px;">To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Tissue-Tek cryomold&#160; (10mm x 10mm x 5mm)</td>
			<td style="width:209px;">Electron Miscroscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#62534-10</td>
			<td style="width:365px;">Mold for OCT embedding</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Buffers and Reagents</td>
			<td style="width:209px;">Company</td>
			<td style="width:236px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:365px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Blocking solution</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="77">
			<td height="77" style="height:77px;width:317px;">Gelvatol (anti-fading mounting media)</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).&#160; Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops).&#160; Store in amber drop bottle at 4&#176;C&#160; (8).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Hoechst 33342 1000x Stock</td>
			<td style="width:209px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:236px;">#62249</td>
			<td style="width:365px;">1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4&#176;C for up to 1 year or at -20&#176;C for long term storage. Prepare fresh&#160; at 1 ug/mL (1x)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Isopentane, 99%&#160;</td>
			<td style="width:209px;">GFS Chemicals</td>
			<td style="width:236px;">#2961</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:317px;">Paraformaldehyde (PFA) in PBS</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#15710</td>
			<td style="width:365px;">Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4&#176;C in the dark.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:317px;">Permeabilization solution</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.&#160; Prepare fresh.</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:317px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:209px;">Bioworld&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#41620015-20</td>
			<td style="width:365px;">0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.&#160; Prepared from 10x stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Sucrose solutions</td>
			<td style="width:209px;">Fisher Scientific&#160;&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#S-5-500</td>
			<td style="width:365px;">Dissolve the appropriate amount of sucrose in&#160; 37&#176;C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4&#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Tissue-Tek OCT-compound&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Sakura</td>
			<td style="width:236px;">&#160;#4583</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Antibodies</td>
			<td style="width:209px;">Company</td>
			<td style="width:236px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:365px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-calbindin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8666</td>
			<td>To label horinzotal cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-GAD65</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB5082</td>
			<td>To label GABAergic amacrine cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-GS</td>
			<td>BD Transduction</td>
			<td>610517</td>
			<td>To label M&#252;ller cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-rhodopsin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5316</td>
			<td>To label rods</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of mouse retinal cryo-sections for immunohistochemistry

Utarbeidelse av høy kvalitet muse øye seksjoner for immunhistokjemi (IHC) er avgjørende for å vurdere retinal struktur og funksjon og for å bestemme mekanismene underliggende retinal sykdommer. Opprettholde strukturelle integritet gjennom hele vevet forberedelse er avgjørende for å oppnå reproduserbar retinal IHC data, men kan være utfordrende på grunn av skjørhet og kompleksiteten i retinal cytoarchitecture. Sterk fiksativene som 10% formalin eller Bouin løsning optimalt bevare retinal struktur, de ofte hemme IHC analyse ved å forbedre bakgrunnen fluorescens og/eller avtagende antistoff-epitope interaksjoner, en prosess som kalles epitope maskering. Mildere fiksativene, på den annen side, som 4% paraformaldehyde, reduserer bakgrunnen fluorescens og epitope-maskering, grundige disseksjon teknikker må benyttes for å bevare retinal struktur. I denne artikkelen presenterer vi en omfattende metode for å forberede musen øye bakre kopper for IHC som er tilstrekkelig til å bevare de fleste antistoff-epitope interaksjoner uten tap av retinal strukturelle integritet. Vi inkluderer representative IHC med antistoffer mot ulike typer Netthinne celle markører for å illustrere vevs bevaring og-orientering under optimale og under optimale forhold. Vårt mål er å optimalisere IHC studier av netthinnen ved å tilby en komplett protokoll fra disseksjon til IHC.

For å illustrere hvordan disse protokollene, sikre optimal Netthinne bevaring for IHC, analysert vi Netthinne seksjoner fra P28 WT mus (C57BL/6N) med antistoffer mot rhodopsin (en foto reseptoren markør)8, Glutaminsyre acid decarboksilaza 65 (Gad65, en amacrine celle merke)9, glutamin SYNTETASE (GS, en Müller celle markør)10, og calbindin (en horisontal celle markør)11 (<strong class="xfig...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry at JoVE.com

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Denne rapporten beskriver omfattende metoder for å forberede frosne mus Retina seksjoner for immunhistokjemi (IHC). Metodene som er beskrevet inkluderer Disseksjon av øye bakre kopp, paraformaldehyde fiksering, innebygging i optimal skjæring temperatur (OCT) Media og vev orientering, snitting og immunostaining.

Utarbeidelse av Mouse retinal fryse-seksjoner for immunhistokjemi

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Mus retinal disseksjon er en veldig delikat prosess på grunn av størrelsen og formen på øynene og skjørhet av netthinnen delen. Viktig å øve, å ha en detaljert protokoll som gir effektiv metode og tips er nøkkelen til retinal disseksjon og seksjon av høy kvalitet. Vi gir tips og råd for å hjelpe forskeren unngå felles fallgruve og få noen høy kvalitet retinal seksjoner egnet for immunohistochemistry.Merk den timelige delen av øyet til en eutanisert mus ved hjelp av en halekauterizer ved å berøre hornhinnen veldig lett og for ikke mer enn et brøkdels sekund for å brenne hornhinnen litt og unngå å lage et hull. Umiddelbart etter det brukte buet Dumont 545 tang for å enucleate museøyne. Plasser øynene i et 1,5 milliliter kryorør med en milliliter 4% PFA og PBS og inkuber i 15 minutter på is.Deretter overfører du de faste øynene ved hjelp av de buede Dumont 545-tangene til en modifisert 35 millimeter disseksjonsrett fylt med PBS og plasser under dissekering av mikroskop. Bruk en mikrokniv for å gjøre et lite snitt ved brennmerket vinkelrett på og like over limbusgrensen til hornhinnen. Sett buet saks inn i snittet og utfør et omkretskutt av hornhinnen etter limbus.Deretter, ved hjelp av tynne Dumont 5 tang, fjern hornhinnen, trekk ut linsen og løft den delikat bort fra den bakre delen av øyet. Den glasslegemet kroppen vil komme ut med linsen og netthinnen vil være synlig som en hvit overflate som dekker innsiden av bakre øyekopp. Vask de isolerte øyekoppene to ganger i en milliliter PBS i 10 minutter ved romtemperatur.For å kryo-beskytte øyekoppene, likevekt dem i 15% sukrose og PBS over natten på fire grader Celsius til de synker. Deretter overfører øyekoppene til 30% sukrose og PBS i to til tre timer til de synker. Plasser øyekoppene i OCT i 10 med 10 millimeter kryoformer for innebygging.Under et dissekerende mikroskop orienterer du øyet i kryoformen langs den dorsale ventralaksen ved å rotere øyet til brennmerket er på toppen. Optisk nerve er en venstre og den kuttede delen av formen vender mot høyre. For å smekker fryse retinal vev, dypp kryo-mold i minst fem minutter i et metallbeger som inneholder isopentan og deretter plassere begeret i flytende nitrogen opp til en tredjedel av høyden på begeret.Fjern den frosne blokken, pakk den i aluminiumsfolie, og lagre på minus 80 grader Celsius. Bruk en penn eller Sharpie til å merke den frosne blokken for å registrere retningen. Etter justering av kryostattemperaturen mellom minus 20 og minus 25 grader Celsius, legg formene som inneholder de innebygde øyekoppene inne og la dem likevekte til kryostattemperaturen i en time.Monter blokken i kryostaten med den dorsale ventrale orienteringen og begynn å kutte 10 mikrometer tykke serielle seksjoner. Plasser forsiktig retinale seksjoner på kommenterte og nummererte mikroskoplyser og oppbevar deretter i lysbildebokser på minus 20 grader Celsius eller minus 80 grader Celsius til klar for immunstaining. Immunohistochemistry med antistoffer mot rhodopsin, en fotoreseptormarkør, glutaminsyre dekarboksylase 65, og amacrine cellemarkør, glutaminsyntetase og Muller cellemarkør, og calbindin, en horisontal cellemarkør ble utført på retinale seksjoner.Resultatene indikerer at denne protokollen gir høy kvalitet og godt bevart retinal seksjoner i motsetning til i dårlig kvalitet retinal seksjoner hentet fra en annen protokoll. Rhodopsin rike indre og ytre segmenter forblir vertikale og intakte med liten eller ingen separasjon fra overliggende retinal pigmentert epitel. Interneurons, som Gad65 positive amacrine celler, forblir riktig stratifisert i det indre kjernefysiske laget og indre plexiform lag.Muller-cellene forblir også godt bevart med soma riktig justert i cytoplasmatiske prosesser som spenner fra ganglioncellelaget til det ytre kjernefysiske laget. Videre er veldefinerte horisontale celler påviselige på det indre kjernefysiske laget og ytre plexiform lagkanten. Det er viktig å markere topperområdet av øynene og holde orienteringen under innebygging.Lag alltid paraformaldehyd under panseret med riktig personlig verneutstyr.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Utarbeidelse av ikke-menneskelige primater hjernevev for Pre-embedding Immunohistokjemi og elektronmikroskopi

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence tomografi: Bildebehandling musen Retinal Ganglion celler i Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Optimization of the Retinal Vein Occlusion Mouse Model to Limit Variability

Optimalisering av musemodellen for retinal veneokklusjon for å begrense variabiliteten

Mouse models of retinal vein occlusion (RVO) are often used in ophthalmology to study hypoxic-ischemic injury in the neural retina. In this report, a ...

Mouse Retina Isolation and Methanol Treatment for Studying Retinal Ganglion Cells

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells (Video) | JoVE 

Metanolbasert helmonteringspreparat for undersøkelse av retinale ganglionceller

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...

Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry

Påvisning av unormalt prionprotein ved immunhistokjemi

Abnormal prion proteins (PrPSc) are the disease-associated isoform of cellular prion protein and diagnostic markers of transmissible spongiform ...

Mouse Retina OCT Fibergram Alignment with Confocal Images

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

Advancements in In Vivo and Ex Vivo Retinal Imaging for Improved Glaucoma Diagnosis and Treatment (Video) | JoVE

Justering av synlig lys optisk koherens tomografi fibergrammer med konfokale bilder av samme mus netthinnen

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...