Name: preparation of mouse retinal cryo-sections for immunohistochemistry
Uploaded: 2019-07-01T14:00:00
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Este trabalho foi apoiado por fundos da NIH (RO1-GMO97327) e da Fundação de pesquisa universitária (UPenn). Agradecemos especialmente Svetlana Savina por sua ajuda no desenvolvimento do protocolo de imuno-histoquímica, Gordon Ruthel (Universidade da Pensilvânia) e do Penn vet Imaging Core para assistência com microscopia e Leslie King, Ph.D. para leitura crítica deste manuscrito .

Todos os métodos aqui descritos foram realizados em estrita conformidade com as recomendações do guia nacional de saúde para o cuidado e uso de animais de laboratório fornecidos pelo Instituto de recursos animais de laboratório e foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade da Pensilvânia.
Todas as ferramentas e equipamentos para os métodos são mostrados na Figura 1 e listados na tabela de materiais</stro...

<ol>
	<li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labelled+antigens+and+antibodies.">Labelled antigens and antibodies.</a> Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).</li><li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+antibodies+as+histochemical+tools.">Fluorescent antibodies as histochemical tools.</a> Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).</li><li>Coons, A. H., Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+antigen+in+tissue+cells;+improvements+in+a+method+for+the+detection+of+antigen+by+means+of+fluorescent+antibody.">Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody.</a> Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).</li><li>Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artefacts+in+histopathology.">Artefacts in histopathology.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).</li><li>Hartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+sections+from+Bouin-fixed+material+in+histopathology.">Frozen sections from Bouin-fixed material in histopathology.</a> Stain Technology. 20, 113 (1945).</li><li>Benerini Gatta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+alternative+fixatives+to+formalin+in+diagnostic+pathology.">Application of alternative fixatives to formalin in diagnostic pathology.</a> European Journal of Histochemistry. 56 (2), e12 (2012).</li><li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+cryoultramicrotomy+to+immunocytochemistry.">Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry.</a> Journal of Microscopy. 143 (Pt 2), 139-149 (1986).</li><li>Imai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+properties+of+rhodopsin+and+rod+function.">Molecular properties of rhodopsin and rod function.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6677-6684 (2007).</li><li>Lee, J. W., Lim, M. Y., Park, Y. S., Park, S. J., Kim, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reexamination+of+Dopaminergic+Amacrine+Cells+in+the+Rabbit+Retina:+Confocal+Analysis+with+Double-+and+Triple-labeling+Immunohistochemistry.">Reexamination of Dopaminergic Amacrine Cells in the Rabbit Retina: Confocal Analysis with Double- and Triple-labeling Immunohistochemistry.</a> Experimental Neurobiology. 26 (6), 329-338 (2017).</li><li>Bringmann, A., Grosche, A., Pannicke, T., Reichenbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+and+Glutamate+Uptake+and+Metabolism+in+Retinal+Glial+(Muller)+Cells.">GABA and Glutamate Uptake and Metabolism in Retinal Glial (Muller) Cells.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 4, 48 (2013).</li><li>Nakhai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ptf1a+is+essential+for+the+differentiation+of+GABAergic+and+glycinergic+amacrine+cells+and+horizontal+cells+in+the+mouse+retina.">Ptf1a is essential for the differentiation of GABAergic and glycinergic amacrine cells and horizontal cells in the mouse retina.</a> Development. 134 (6), 1151-1160 (2007).</li><li>Applebury, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+cone+photoreceptor:+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning.">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).</li></ol>

A dissecção do retina do rato é um processo delicado devido ao tamanho e à forma pequenos de olhos do rato e à fragilidade do tecido retinal. Mesmo que a realização de dissecção de alta qualidade é uma questão de prática, tendo um protocolo detalhado, fornecendo métodos eficientes e dicas é uma necessidade para obter seções retinianas e IHC. Além do que os protocolos descritos aqui, há diversas pontas que permitem as seções retinal de alta qualidade consistentes que são apropriadas para o IHC reprodu...

Immunohistochemistry (IHC) é uma técnica poderosa para localizar proteínas e estruturas celulares específicas nos tecidos in situ1,2,3. Os métodos inadequados da fixação e o seccionamento secundário-optimal de tecidos complexos podem interromper a estrutura do tecido, gerar a mancha elevada do fundo ou diminuir interações do anticorpo-epítopo, tendo por resultado artefatos de coloração e conseqüente interpretação errónea de Dados IHC4. Como a retina de vertebrados é um órgão neural complexo e altamente organizado composto por estratos de fotorreceptores interligados, interneurônios e células ganglionares, é muito frágil e pode ser facilmente interrompido durante a dissecção e o corte. Um protocolo detalhado, padronizado, e validado da dissecção do olho do rato e a orientação à imunomarcação ajudarão significativamente a reduzir artefatos de IHC, desse modo, aumentando a confiabilidade dos resultados e permitindo dados comparativos mais precisos Análise.
Há muitos protocolos para a preparação do tecido para o IHC, entretanto, não todos são apropriados para o tecido retinal. Os fixadores fortes como o formalina de 10% ou a solução de Bouin preservam a estrutura retinal durante a dissecção e o corte5. Infelizmente, os fixadores fortes conduzem frequentemente à fluorescência aumentada do fundo e ao mascaramento do epítopo devido à modificação química dos resumos6. Por outro lado, os fixadores mais leves, como o paraformaldeído a 4% (PFA) podem aliviar alguns desses artefatos, mas necessitam de dissecção meticulosa e seccionamento para preservar a estrutura retiniana ideal. PFA penetra ràpida o tecido, mas as proteínas Cross-links muito lentamente, reduzindo o risco de mascarar do epítopo. Desde que a incubação do PFA do tempo curto é uma fixação relativamente suave, os tecidos exigem frequentemente o congelamento rápido preservar antígenos. É importante evitar a formação de cristais de gelo durante o congelamento tecidual, pois eles distorcem e danificam a integridade das células e dos tecidos7.
Aqui nós descrevemos protocolos detalhados e estandardizados para a dissecção, a fixação, e a Cryo-proteção de copos do posterior da ocular do rato que produzem dados consistentes e de confiança de IHC.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1128px;" width="1129">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm)</td>
			<td style="width:209px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#MA-48</td>
			<td style="width:365px;">For liquid nitrogen (Figure 1E)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Aluminum foil&#160;</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Cauterizer&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Bovie</td>
			<td style="width:236px;">#AA01</td>
			<td style="width:365px;">To mark eye orientation (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:236px;">#72703-D</td>
			<td style="width:365px;">For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#15002-08</td>
			<td style="width:365px;">To circumferentially cut the cornea (Figure 1B)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Dental wax-coated 35mm dissection dish</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">For eye cup dissection (Figure 1C)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Dissecting microscope&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Leica, Houston, USA&#160;</td>
			<td style="width:236px;">MZ12.5 High-performance stereomicroscope</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Micro Knives - Plastic Handle&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#10315-12</td>
			<td style="width:365px;">To make a small incision at the burn mark (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Pink dental wax&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#72660</td>
			<td style="width:365px;">For coating dissection dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Slide Rack and Coverplate</td>
			<td style="width:209px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:236px;">#36107</td>
			<td style="width:365px;">For retinal IHC (Figure 1G)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Stainless Steel Beaker (89 x 114mm)</td>
			<td style="width:209px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#MA-40</td>
			<td style="width:365px;">For isopentane bath (Figure 1E)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Styrofoam box</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">For insulated cooler</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Thin forceps Dumont #5&#160;&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#11254-20</td>
			<td style="width:365px;">To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Tissue-Tek cryomold&#160; (10mm x 10mm x 5mm)</td>
			<td style="width:209px;">Electron Miscroscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#62534-10</td>
			<td style="width:365px;">Mold for OCT embedding</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Buffers and Reagents</td>
			<td style="width:209px;">Company</td>
			<td style="width:236px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:365px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Blocking solution</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="77">
			<td height="77" style="height:77px;width:317px;">Gelvatol (anti-fading mounting media)</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).&#160; Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops).&#160; Store in amber drop bottle at 4&#176;C&#160; (8).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Hoechst 33342 1000x Stock</td>
			<td style="width:209px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:236px;">#62249</td>
			<td style="width:365px;">1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4&#176;C for up to 1 year or at -20&#176;C for long term storage. Prepare fresh&#160; at 1 ug/mL (1x)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Isopentane, 99%&#160;</td>
			<td style="width:209px;">GFS Chemicals</td>
			<td style="width:236px;">#2961</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:317px;">Paraformaldehyde (PFA) in PBS</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#15710</td>
			<td style="width:365px;">Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4&#176;C in the dark.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:317px;">Permeabilization solution</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.&#160; Prepare fresh.</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:317px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:209px;">Bioworld&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#41620015-20</td>
			<td style="width:365px;">0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.&#160; Prepared from 10x stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Sucrose solutions</td>
			<td style="width:209px;">Fisher Scientific&#160;&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#S-5-500</td>
			<td style="width:365px;">Dissolve the appropriate amount of sucrose in&#160; 37&#176;C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4&#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Tissue-Tek OCT-compound&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Sakura</td>
			<td style="width:236px;">&#160;#4583</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Antibodies</td>
			<td style="width:209px;">Company</td>
			<td style="width:236px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:365px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-calbindin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8666</td>
			<td>To label horinzotal cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-GAD65</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB5082</td>
			<td>To label GABAergic amacrine cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-GS</td>
			<td>BD Transduction</td>
			<td>610517</td>
			<td>To label M&#252;ller cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-rhodopsin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5316</td>
			<td>To label rods</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of mouse retinal cryo-sections for immunohistochemistry

A preparação de seções de alta qualidade do olho do rato para immunohistochemistry (IHC) é crítica para avaliar a estrutura e a função retinal e para determinar os mecanismos que subjacentes doenças retinal. Manter a integridade estrutural durante toda a preparação do tecido é vital para obter dados reprodutíveis de IHC retinal mas pode ser desafiante devido à fragilidade e à complexidade da Citoarquitetura retinal. Os fixadores fortes como o formalina de 10% ou a solução de Bouin preservam otimamente a estrutura retinal, impedem frequentemente a análise de IHC realçando a fluorescência do fundo e/ou as interações dediminuição do anticorpo-epítopo, um processo sabido como o mascaramento do epítopo. Os fixatives mais leves, por outro lado, como o paraformaldeído a 4%, reduzem a fluorescência de fundo e o epitope-mascaramento, técnicas de dissecção meticulosa devem ser utilizadas para preservar a estrutura retiniana. Neste artigo, nós apresentamos um método detalhado para preparar copos do posterior da ocular do rato para o IHC que é suficiente preservar a maioria de interações do anticorpo-epítopo sem perda de integridade estrutural retinal. Nós incluímos IHC representativo com os anticorpos aos vários marcadores retinal do tipo da pilha para ilustrar a preservação e a orientação do tecido circunstâncias óptimas e suboptimal. Nosso objetivo é aperfeiçoar estudos de IHC do retina fornecendo um protocolo completo da dissecção do copo do posterior da ocular ao IHC.

Para ilustrar como estes protocolos, asseguram a preservação retinal óptima para IHC, nós sondado seções retinal dos ratos de P28 WT (C57Bl/6N) com os anticorpos ao rodopsina (um marcador do fotorreceptor)8, descarboxilase ácido glutâmico 65 (Gad65, uma pilha amacrina marcador)9, glutamina sintetase (GS, marcador de célula Müller)10, e calbindin (marcador de célula horizontal)11 (<st...

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Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Este relatório descreve métodos detalhados para preparar seções congeladas do retina do rato para immunohistochemistry (IHC). Os métodos descritos incluem dissecção do copo posterior ocular, fixação paraformaldeído, incorporação em meios de temperatura de corte ideal (OCT) e orientação tecidual, corte e imunocoloração.

Preparação de Cryo-seções retinal do rato para immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

A dissecção da retina do rato é um processo realmente delicado devido ao tamanho e forma dos olhos e à fragilidade da seção de retina. Imperativo para a prática, ter um protocolo detalhado que forneça método e dicas eficientes é a chave para dissecção e seção de retina de alta qualidade. Fornecemos dicas e conselhos para ajudar o pesquisador a evitar armadilhas comuns e obter algumas seções de retina de alta qualidade adequadas para a imunohistoquímica.Marque a parte temporal do olho de um rato eutanizado usando um cauterizador de cauda tocando a córnea muito levemente e por não mais do que uma fração de segundo para queimar ligeiramente a córnea e evitar fazer um buraco. Logo depois, usou fórceps Dumont 545 curvas para enuclear os olhos do rato. Coloque os olhos em um criobote de 1,5 mililitro com um mililitro de 4%PFA e PBS e incubar por 15 minutos no gelo.Em seguida, transfira os olhos fixos usando os fórceps Dumont 545 curvos para um prato de dissecção modificado de 35 milímetros cheio de PBS e coloque sob microscópio dissecado. Use um microknife para fazer uma pequena incisão na marca de queimadura perpendicular para e logo acima da borda do limbus da córnea. Insira tesouras curvas na incisão e realize um corte circunferencial da córnea após o limbus.Em seguida, usando finas fórceps Dumont 5, remova a córnea, extraia a lente e levante-a delicadamente para longe da porção posterior do olho. O corpo vítreo sairá com a lente e a retina será visível como uma superfície branca cobrindo o interior do copo ocular posterior. Lave os copos de olho isolados duas vezes em um mililitro de PBS por 10 minutos em temperatura ambiente.Para proteger crio-proteger os copos oculares, equilibre-os em 15% de sacarose e PBS durante a noite a quatro graus Celsius até afundarem. Em seguida, transfira os copos oculares para 30% de sacarose e PBS por duas a três horas até afundarem. Coloque os copos oculares em OUTUBRO em 10 por 10 milímetros crio-moldes para incorporar.Sob um microscópio dissecando, oriente o olho no crio-mold ao longo de seu eixo ventral dorsal girando o olho até que a marca de queimadura esteja em cima. O nervo óptico é um da esquerda e a parte cortada do molde fica de frente para a direita. Para quebrar o tecido da retina, mergulhe o crio-mold por pelo menos cinco minutos em um béquer de metal contendo isopéne e, em seguida, coloque o béquer em nitrogênio líquido até um terço da altura do béquer.Remova o bloco congelado, enrole-o em papel alumínio e armazene a menos 80 graus Celsius. Use uma caneta ou Sharpie para marcar o bloco congelado para registrar sua orientação. Depois de ajustar a temperatura criostat entre menos 20 e menos 25 graus Celsius, coloque os moldes contendo os copos oculares incorporados dentro e permita que eles se equilibrem à temperatura criostat por uma hora.Instale o bloco no criostat com a orientação ventral dorsal e comece a cortar seções de série de 10 micrômetros de espessura. Coloque cuidadosamente as seções de retina em slides de microscópio anotados e numerados e, em seguida, armazene em caixas de slides a menos 20 graus Celsius ou menos 80 graus Celsius até estar pronto para a imunossaturação. Imunohistoquímica com anticorpos para rhodopsina, um marcador fotorreceptor, descarboxilase de ácido glutamico 65, e marcador de células amacrinas, sintetizador de glutamina e marcador celular Muller, e calbinino, um marcador celular horizontal foi realizado em seções de retina.Os resultados indicam que este protocolo produz seções de retina de alta qualidade e bem preservadas, ao contrário de seções de retina de baixa qualidade obtidas a partir de um protocolo diferente. Os segmentos internos e externos ricos em rodopsina permanecem verticais e intactos com pouca ou nenhuma separação do epitélio pigmentado da retina. Os interneurônios, como as células amacrinas positivas Gad65, permanecem devidamente estratificados dentro da camada nuclear interna e da camada plexiforme interna.Além disso, as células Muller permanecem bem preservadas com soma devidamente alinhadas em processos citoplasmicos que se estendem desde a camada de células de gânglio até a camada nuclear externa. Além disso, células horizontais bem definidas são detectáveis na camada nuclear interna e na borda da camada plexiforme externa. É importante marcar a região do topper dos olhos e manter a orientação durante a incorporação.Prepare sempre paraformaldeído sob o capô com o equipamento de proteção individual adequado.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Neurociência

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The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Preparação do Tecido Cerebral primata não humano para Pré-incorporação de imuno-histoquímica e Microscopia Electrónica

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Tomografia de coerência óptica: Imagens Mouse ganglionares da retina células In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Optimization of the Retinal Vein Occlusion Mouse Model to Limit Variability

Otimização do Modelo de Oclusão de Veia da Retina em Camundongo para Limitar a Variabilidade

Mouse models of retinal vein occlusion (RVO) are often used in ophthalmology to study hypoxic-ischemic injury in the neural retina. In this report, a ...

Mouse Retina Isolation and Methanol Treatment for Studying Retinal Ganglion Cells

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells (Video) | JoVE 

Preparação de montagem inteira à base de metanol para a investigação de células ganglionares da retina

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...

Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry

Detecção de Proteína Priônica Anormal por Imunohistoquímica

Abnormal prion proteins (PrPSc) are the disease-associated isoform of cellular prion protein and diagnostic markers of transmissible spongiform ...

Mouse Retina OCT Fibergram Alignment with Confocal Images

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

Advancements in In Vivo and Ex Vivo Retinal Imaging for Improved Glaucoma Diagnosis and Treatment (Video) | JoVE

Alinhamento de Fibrogramas de Tomografia de Coerência Óptica com Luz Visível com Imagens Confocais da Mesma Retina de Camundongo

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...