Name: preparation of mouse retinal cryo-sections for immunohistochemistry
Uploaded: 2019-07-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry at JoVE.com

Эта работа была поддержана средствами NIH (RO1-GMO97327) и Университетского исследовательского фонда (UPenn). Мы особенно благодарим Светлану Савину за помощь в разработке протокола иммуногистохимии, Гордона Рутеля (Университет Пенсильвании) и Ядро визуализации ветеринаров Пенна за помощь в микроскопии и Лесли Кинг, доктор философии, за критическое чтение этой рукописи .

Все описанные здесь методы были выполнены в строгом соответствии с рекомендациями Национального руководства по охране здоровья по уходу и использованию лабораторных животных, предоставленными Институтом лабораторных ресурсов животных, и были одобрены Институциональный комитет по ?...

<ol>
	<li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labelled+antigens+and+antibodies.">Labelled antigens and antibodies.</a> Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).</li><li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+antibodies+as+histochemical+tools.">Fluorescent antibodies as histochemical tools.</a> Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).</li><li>Coons, A. H., Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+antigen+in+tissue+cells;+improvements+in+a+method+for+the+detection+of+antigen+by+means+of+fluorescent+antibody.">Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody.</a> Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).</li><li>Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artefacts+in+histopathology.">Artefacts in histopathology.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).</li><li>Hartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+sections+from+Bouin-fixed+material+in+histopathology.">Frozen sections from Bouin-fixed material in histopathology.</a> Stain Technology. 20, 113 (1945).</li><li>Benerini Gatta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+alternative+fixatives+to+formalin+in+diagnostic+pathology.">Application of alternative fixatives to formalin in diagnostic pathology.</a> European Journal of Histochemistry. 56 (2), e12 (2012).</li><li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+cryoultramicrotomy+to+immunocytochemistry.">Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry.</a> Journal of Microscopy. 143 (Pt 2), 139-149 (1986).</li><li>Imai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+properties+of+rhodopsin+and+rod+function.">Molecular properties of rhodopsin and rod function.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6677-6684 (2007).</li><li>Lee, J. W., Lim, M. Y., Park, Y. S., Park, S. J., Kim, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reexamination+of+Dopaminergic+Amacrine+Cells+in+the+Rabbit+Retina:+Confocal+Analysis+with+Double-+and+Triple-labeling+Immunohistochemistry.">Reexamination of Dopaminergic Amacrine Cells in the Rabbit Retina: Confocal Analysis with Double- and Triple-labeling Immunohistochemistry.</a> Experimental Neurobiology. 26 (6), 329-338 (2017).</li><li>Bringmann, A., Grosche, A., Pannicke, T., Reichenbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+and+Glutamate+Uptake+and+Metabolism+in+Retinal+Glial+(Muller)+Cells.">GABA and Glutamate Uptake and Metabolism in Retinal Glial (Muller) Cells.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 4, 48 (2013).</li><li>Nakhai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ptf1a+is+essential+for+the+differentiation+of+GABAergic+and+glycinergic+amacrine+cells+and+horizontal+cells+in+the+mouse+retina.">Ptf1a is essential for the differentiation of GABAergic and glycinergic amacrine cells and horizontal cells in the mouse retina.</a> Development. 134 (6), 1151-1160 (2007).</li><li>Applebury, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+cone+photoreceptor:+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning.">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).</li></ol>

Рассечение сетчатки мыши является деликатным процессом из-за небольшого размера и формы мыжеток и хрупкости ткани сетчатки. Несмотря на то, что выполнение высококачественного вскрытия является вопросом практики, наличие детального протокола, предоставление эффективных методов и сов...

Иммуногистохимия (IHC) является мощным методом для локализации конкретныхбелков и клеточных структур в тканях на месте 1,2,3. Неуместные методы фиксации и субоптимальное сечение сложных тканей могут нарушить структуру тканей, генерировать высокие фоновые окрашивания или уменьшать антитела-эпитопные взаимодействия, что приводит к окрашиванию артефактов и последующему неправильному толкованию Данные IHC4. Поскольку позвоночную сетчатку является сложным и высокоорганизованным нервным органом, состоящим из слоев взаимосвязанных фоторецепторов, интернейронов и ганглия-клеток, она очень хрупкая и может быть легко нарушена во время вскрытия и секции. Подробный, стандартизированный и проверенный протокол от вскрытия глаз мыши и ориентации на иммуно-стоикирование поможет значительно уменьшить iHC артефакты, тем самым повышая надежность результатов и позволяя более точные сравнительные данные Анализа.
Есть много протоколов для подготовки тканей для IHC, однако, не все подходят для ткани сетчатины. Сильные фиксаторы, такие как 10% формалин или решение Bouin сохранить структуру сытины во время вскрытия и секции5. К сожалению, сильные фиксаторы часто приводят к усиленной фоновой флуоресценции и маскировке эпитопов из-за химической модификации эпитопов6. С другой стороны, более мягкие фиксаторы, как 4% параформальдегида (PFA) может облегчить некоторые из этих артефактов, но требуют тщательного вскрытия и сечения, чтобы сохранить оптимальную структуру сетчатого глаза. ПФА быстро проникает в ткани, но перекрестные белки очень медленно, снижая риск маскировки эпитопа. Поскольку короткое время инкубации ПФА является относительно мягкой фиксации, ткани часто требуют быстрого замораживания для сохранения антигенов. Важно, чтобы избежать образования кристалла льда во время замораживания тканей, как они искажают и повреждения целостности клеток и тканей7.
Здесь мы описываем подробные и стандартизированные протоколы для вскрытия, фиксации и криозащиты мыши глазных задних чашек, которые дают последовательные и надежные данные IHC.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1128px;" width="1129">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm)</td>
			<td style="width:209px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#MA-48</td>
			<td style="width:365px;">For liquid nitrogen (Figure 1E)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Aluminum foil&#160;</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Cauterizer&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Bovie</td>
			<td style="width:236px;">#AA01</td>
			<td style="width:365px;">To mark eye orientation (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:236px;">#72703-D</td>
			<td style="width:365px;">For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#15002-08</td>
			<td style="width:365px;">To circumferentially cut the cornea (Figure 1B)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Dental wax-coated 35mm dissection dish</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">For eye cup dissection (Figure 1C)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Dissecting microscope&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Leica, Houston, USA&#160;</td>
			<td style="width:236px;">MZ12.5 High-performance stereomicroscope</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Micro Knives - Plastic Handle&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#10315-12</td>
			<td style="width:365px;">To make a small incision at the burn mark (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Pink dental wax&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#72660</td>
			<td style="width:365px;">For coating dissection dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Slide Rack and Coverplate</td>
			<td style="width:209px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:236px;">#36107</td>
			<td style="width:365px;">For retinal IHC (Figure 1G)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Stainless Steel Beaker (89 x 114mm)</td>
			<td style="width:209px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#MA-40</td>
			<td style="width:365px;">For isopentane bath (Figure 1E)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Styrofoam box</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">For insulated cooler</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Thin forceps Dumont #5&#160;&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#11254-20</td>
			<td style="width:365px;">To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Tissue-Tek cryomold&#160; (10mm x 10mm x 5mm)</td>
			<td style="width:209px;">Electron Miscroscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#62534-10</td>
			<td style="width:365px;">Mold for OCT embedding</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Buffers and Reagents</td>
			<td style="width:209px;">Company</td>
			<td style="width:236px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:365px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Blocking solution</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="77">
			<td height="77" style="height:77px;width:317px;">Gelvatol (anti-fading mounting media)</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).&#160; Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops).&#160; Store in amber drop bottle at 4&#176;C&#160; (8).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Hoechst 33342 1000x Stock</td>
			<td style="width:209px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:236px;">#62249</td>
			<td style="width:365px;">1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4&#176;C for up to 1 year or at -20&#176;C for long term storage. Prepare fresh&#160; at 1 ug/mL (1x)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Isopentane, 99%&#160;</td>
			<td style="width:209px;">GFS Chemicals</td>
			<td style="width:236px;">#2961</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:317px;">Paraformaldehyde (PFA) in PBS</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#15710</td>
			<td style="width:365px;">Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4&#176;C in the dark.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:317px;">Permeabilization solution</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.&#160; Prepare fresh.</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:317px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:209px;">Bioworld&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#41620015-20</td>
			<td style="width:365px;">0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.&#160; Prepared from 10x stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Sucrose solutions</td>
			<td style="width:209px;">Fisher Scientific&#160;&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#S-5-500</td>
			<td style="width:365px;">Dissolve the appropriate amount of sucrose in&#160; 37&#176;C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4&#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Tissue-Tek OCT-compound&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Sakura</td>
			<td style="width:236px;">&#160;#4583</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Antibodies</td>
			<td style="width:209px;">Company</td>
			<td style="width:236px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:365px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-calbindin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8666</td>
			<td>To label horinzotal cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-GAD65</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB5082</td>
			<td>To label GABAergic amacrine cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-GS</td>
			<td>BD Transduction</td>
			<td>610517</td>
			<td>To label M&#252;ller cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-rhodopsin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5316</td>
			<td>To label rods</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of mouse retinal cryo-sections for immunohistochemistry

Подготовка высококачественных секций глаз мыши для иммуногистохимии (IHC) имеет решающее значение для оценки структуры и функции сетчаточной системы и для определения механизмов, лежащих в основе заболеваний сетчаточной железы. Поддержание структурной целостности на протяжении всей подготовки ткани имеет жизненно важное значение для получения воспроизводимых данных IHC сетчатого, но может быть сложной задачей из-за хрупкости и сложности цитоархитектуры сетчаточной системы. Сильные фиксаторы, как 10% формалин или решение Буин оптимально сохранить структуру сетчатки, они часто препятствуют анализУ IHC путем повышения фоновой флуоресценции и / или уменьшение антител-эпитопов взаимодействий, процесс, известный как эпитоп маскировки. Мягкие фиксаторы, с другой стороны, как 4% параформальдегида, снижает фоновой флуоресценции и эпитоп-маскировки, тщательные методы вскрытия должны быть использованы для сохранения структуры сыворотки. В этой статье мы представляем комплексный метод подготовки мыши глазной задней чашки для IHC, что достаточно, чтобы сохранить большинство антител-эпитоп взаимодействия без потери структурной целостности сетчатых. Мы включаем представительный IHC с антителами к различным маркерам типа сетчаточных клеток, чтобы проиллюстрировать сохранение тканей и ориентацию в оптимальных и неоптимальных условиях. Наша цель заключается в оптимизации IHC исследований сетчатки путем предоставления полного протокола от глазной задней чашки вскрытия IHC.

Чтобы проиллюстрировать, как эти протоколы, обеспечить оптимальное сохранение сетчатки для IHC, мы исследовали участки сетчатки от p28 WT мышей (C57BL/6N) с антителами к родопсину (маркер фоторецептора)8, глутаминовой кислотой decarboxylase 65 (Gad65, амакринная клетка марк?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry at JoVE.com

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

В настоящем докладе описаны комплексные методы подготовки замороженных секций сетчатки мыши для иммуногистохимии (IHC). Описанные методы включают вскрытие глазной задней чашки, параформальдегидная фиксация, встраивание в оптимальную температуру резки (OCT) носителей и ориентации тканей, секционирование и иммуностоирование.

Подготовка крио-секций мышиной подвздошной сыки для иммуногистохимии

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Вскрытие сетчатки мыши является очень деликатный процесс из-за размера и формы глаз и хрупкость сетчатки. Императив на практике, имея подробный протокол, который обеспечивает эффективный метод и советы является ключом к высокому качеству вскрытия сетчатки и раздела. Мы предоставляем советы и рекомендации, чтобы помочь исследователю избежать общей ловушки и получить некоторые высококачественные секции сетчатки подходит для иммуногистохимии.Отметите височную часть глаза усыпанной мыши с помощью хвостового прижигателя, касаясь роговицы очень легко и не более чем на долю секунды, чтобы слегка сжечь роговицу и избежать отверстия. Сразу после этого используется изогнутый Дюмон 545 типсов, чтобы окутать глаза мыши. Поместите глаза в криотрубу 1,5 миллилитров с одним миллилитром 4%PFA и PBS и инкубировать в течение 15 минут на льду.Затем перенесите фиксированные глаза с помощью изогнутых типсов Dumont 545 в модифицированное 35-миллиметровое рассечение, наполненное PBS, и поместите под рассечение микроскопа. Используйте микронойф, чтобы сделать небольшой разрез на ожог знак перпендикулярно и чуть выше границы лимбуса роговицы. Вставьте изогнутые ножницы в разрез и выполните окружной разрез роговицы после лимбуса.Затем, используя тонкие Dumont 5 типсов, удалить роговицу, извлечь объектив, и поднять его деликатно от задней части глаза. Стекловидное тело выйдет с объективом и сетчатка будет видна как белая поверхность, покрывающая внутреннюю часть задней чашки глаза. Вымойте изолированные чашки глаз дважды в одном миллилитре PBS в течение 10 минут при комнатной температуре.Для крио-защиты глаз чашки, equilibrate их в 15% сахарозы и PBS ночь на четыре градуса по Цельсию, пока они не утонут. Затем перенесите чашки глаз на 30% сахарозы и PBS в течение двух-трех часов, пока они не утонут. Поместите чашки для глаз в OCT в 10 на 10 миллиметров крио-формы для встраивания.Под рассечением микроскопа, сориентировать глаз в крио-формы вдоль спинной брюшной оси, вращая глаз, пока ожог знак находится на вершине. Зрительный нерв является одним слева и вырезать часть формы лица вправо. Чтобы заморозить ткани сетчатки, погрузите крио-плесень, по крайней мере пять минут в металлический стакан, содержащий изопентан, а затем поместите стакан в жидкий азот до одной трети высоты стакана.Снимите замороженный блок, заверните его в алюминиевую фольгу и храните при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Используйте ручку или Sharpie, чтобы отметить замороженный блок, чтобы записать его ориентацию. После корректировки температуры криостата между минус 20 и минус 25 градусов по Цельсию, поместите формы, содержащие встроенные чашки для глаз внутри и дайте им уравночные до температуры криостата в течение одного часа.Установите блок в криостате с спинной брюшной ориентацией и начните резать серийные секции толщиной 10 микрометров. Аккуратно поместите секции сетчатки на аннотированные и проумереные слайды микроскопа, а затем храните в слайд-боксах при температуре минус 20 градусов по Цельсию или минус 80 градусов по Цельсию до готовности к иммуностимулятору. Иммуногистохимия с антителами к родопсину, маркер фоторецептора, декарбоксилаза глутамной кислоты 65, маркер клеток амакрин, глутамин синтетазы и маркера клеток Мюллера, а также кальбиндин, горизонтальный маркер клеток был выполнен на секциях сетчатки.Результаты показывают, что этот протокол дает высокое качество и хорошо сохранившиеся секции сетчатки в отличие от низкого качества секций сетчатки, полученных из другого протокола. Богатые родопсином внутренние и внешние сегменты остаются вертикальными и нетронутыми практически без отделения от чрезмерного пигмента сетчатки эпителия. Интернейроны, такие как положительные амакринные клетки Gad65, остаются должным образом стратифицированными внутри внутреннего ядерного слоя и внутреннего плексиформного слоя.Кроме того, клетки Мюллера остаются хорошо сохранившимися с сомой, правильно выровненной в цитоплазмических процессах, которые охватывают от слоя ганглионных клеток до внешнего ядерного слоя. Кроме того, четко определенные горизонтальные ячейки обнаруживаются на внутреннем ядерном слое и внешней границе плексиформного слоя. Важно, чтобы отметить топпер области глаз и сохранить ориентацию во время встраивания.Всегда подготовь параформалде под капотом с соответствующим защитным оборудованием.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Подготовка ткани мозга мыши для иммуноэлектронной микроскопии

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Патч зажим Recordings от мыши нейронов сетчатки в темно-адаптированной фрагмент подготовка

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

Изолированные сетчатки Подготовка к записи Света Ответ Генетически Маркированный ганглиозных клеток сетчатки

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Препарирование Мышь Око за полного горе пигментный эпителий сетчатки

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Получение нечеловеческих приматов ткани головного мозга для предварительного внедрения иммуногистохимии и электронной микроскопии

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Оптическая когерентная томография: Визуализация мыши сетчатки ганглия клетки в естественных условиях

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Optimization of the Retinal Vein Occlusion Mouse Model to Limit Variability

Оптимизация мышиной модели окклюзии вен сетчатки для ограничения изменчивости

Mouse models of retinal vein occlusion (RVO) are often used in ophthalmology to study hypoxic-ischemic injury in the neural retina. In this report, a ...

Mouse Retina Isolation and Methanol Treatment for Studying Retinal Ganglion Cells

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells (Video) | JoVE 

Цельный препарат на основе метанола для исследования ганглиозных клеток сетчатки

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...

Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry

Обнаружение аномального прионного белка методом иммуногистохимии

Abnormal prion proteins (PrPSc) are the disease-associated isoform of cellular prion protein and diagnostic markers of transmissible spongiform ...

Mouse Retina OCT Fibergram Alignment with Confocal Images

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

Advancements in In Vivo and Ex Vivo Retinal Imaging for Improved Glaucoma Diagnosis and Treatment (Video) | JoVE

Совмещение фиброграмм оптической когерентной томографии видимого света с конфокальными изображениями той же сетчатки мыши

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...