Name: preparation of mouse retinal cryo-sections for immunohistochemistry
Uploaded: 2019-07-01T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por fondos de NIH (RO1-GMO97327) y la University Research Foundation (UPenn). Agradecemos especialmente a Svetlana Savina por su ayuda en el desarrollo del protocolo de inmunohistoquímica, Gordon Ruthel (Universidad de Pensilvania) y Penn Vet Imaging Core por su ayuda con la microscopía y Leslie King, Ph.D. por la lectura crítica de este manuscrito .

Todos los métodos descritos aquí se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones de la Guía de Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio proporcionada por el Instituto de Recursos Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pensilvania.
Todas las herramientas y equipos para los métodos se muestran en la Figura 1 y se enumeran en la Tabla de...

<ol>
	<li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labelled+antigens+and+antibodies.">Labelled antigens and antibodies.</a> Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).</li><li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+antibodies+as+histochemical+tools.">Fluorescent antibodies as histochemical tools.</a> Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).</li><li>Coons, A. H., Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+antigen+in+tissue+cells;+improvements+in+a+method+for+the+detection+of+antigen+by+means+of+fluorescent+antibody.">Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody.</a> Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).</li><li>Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artefacts+in+histopathology.">Artefacts in histopathology.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).</li><li>Hartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+sections+from+Bouin-fixed+material+in+histopathology.">Frozen sections from Bouin-fixed material in histopathology.</a> Stain Technology. 20, 113 (1945).</li><li>Benerini Gatta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+alternative+fixatives+to+formalin+in+diagnostic+pathology.">Application of alternative fixatives to formalin in diagnostic pathology.</a> European Journal of Histochemistry. 56 (2), e12 (2012).</li><li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+cryoultramicrotomy+to+immunocytochemistry.">Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry.</a> Journal of Microscopy. 143 (Pt 2), 139-149 (1986).</li><li>Imai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+properties+of+rhodopsin+and+rod+function.">Molecular properties of rhodopsin and rod function.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6677-6684 (2007).</li><li>Lee, J. W., Lim, M. Y., Park, Y. S., Park, S. J., Kim, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reexamination+of+Dopaminergic+Amacrine+Cells+in+the+Rabbit+Retina:+Confocal+Analysis+with+Double-+and+Triple-labeling+Immunohistochemistry.">Reexamination of Dopaminergic Amacrine Cells in the Rabbit Retina: Confocal Analysis with Double- and Triple-labeling Immunohistochemistry.</a> Experimental Neurobiology. 26 (6), 329-338 (2017).</li><li>Bringmann, A., Grosche, A., Pannicke, T., Reichenbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+and+Glutamate+Uptake+and+Metabolism+in+Retinal+Glial+(Muller)+Cells.">GABA and Glutamate Uptake and Metabolism in Retinal Glial (Muller) Cells.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 4, 48 (2013).</li><li>Nakhai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ptf1a+is+essential+for+the+differentiation+of+GABAergic+and+glycinergic+amacrine+cells+and+horizontal+cells+in+the+mouse+retina.">Ptf1a is essential for the differentiation of GABAergic and glycinergic amacrine cells and horizontal cells in the mouse retina.</a> Development. 134 (6), 1151-1160 (2007).</li><li>Applebury, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+cone+photoreceptor:+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning.">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).</li></ol>

La disección de la retina del ratón es un proceso delicado debido al pequeño tamaño y forma de los ojos del ratón y la fragilidad del tejido de la retina. A pesar de que realizar disección de alta calidad es una cuestión de práctica, tener un protocolo detallado, proporcionar métodos y consejos eficientes es una necesidad para obtener secciones de retina e IHC. Además de los protocolos descritos aquí, hay varios consejos que permiten secciones de retina consistentes de alta calidad que son adecuadas para IHC r...

La inmunohistoquímica (IHC) es una poderosa técnica para localizar proteínasespecíficas y estructuras celulares en tejidos in situ 1,2,3. Los métodos de fijación inapropiados y la sección subóptima de tejidos complejos pueden alterar la estructura tisular, generar manchas de fondo alto o disminuir las interacciones entre anticuerpos y epítopos, lo que resulta en artefactos de tinción y la consiguiente interpretación errónea de Datos IHC4. Como la retina vertebrada es un órgano neural complejo y altamente organizado compuesto por estratos de fotorreceptores interconectados, interneuronas y células ganglionares, es muy frágil y puede ser fácilmente interrumpida durante la disección y seccionamiento. Un protocolo detallado, estandarizado y validado desde la disección de ojos del ratón y la orientación hasta la inmunomancha ayudará a reducir significativamente los artefactos IHC, aumentando así la fiabilidad de los resultados y permitiendo datos comparativos más precisos Análisis.
Hay muchos protocolos para la preparación de tejidos para IHC, sin embargo, no todos son adecuados para el tejido de la retina. Fijadores fuertes como 10% de formalina o solución de Bouin preservan la estructura de la retina durante la disección y seccionamiento5. Desafortunadamente, los fijadores fuertes a menudo conducen a la fluorescencia de fondo mejoraday el enmascaramiento de epítopos debido a la modificación química de los epítopos 6. Por otro lado, fijadores más suaves, como 4% paraformaldehído (PFA) pueden aliviar algunos de estos artefactos, pero requieren disección meticulosa y seccionamiento para preservar la estructura óptima de la retina. La PFA penetra rápidamente en el tejido, pero relatifica las proteínas muy lentamente, reduciendo el riesgo de enmascaramiento de epítopos. Dado que la incubación de PFA de poco tiempo es una fijación relativamente leve, los tejidos a menudo requieren una congelación rápida para preservar los antígenos. Es importante evitar la formación de cristales de hielo durante la congelación de tejidos, ya que distorsionan y dañan la integridad de las células y tejidos7.
Aquí describimos protocolos detallados y estandarizados para la disección, fijación y crioprotección de copas posteriores oculares de ratón que producen datos De IHC consistentes y confiables.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1128px;" width="1129">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm)</td>
			<td style="width:209px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#MA-48</td>
			<td style="width:365px;">For liquid nitrogen (Figure 1E)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Aluminum foil&#160;</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Cauterizer&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Bovie</td>
			<td style="width:236px;">#AA01</td>
			<td style="width:365px;">To mark eye orientation (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:236px;">#72703-D</td>
			<td style="width:365px;">For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#15002-08</td>
			<td style="width:365px;">To circumferentially cut the cornea (Figure 1B)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Dental wax-coated 35mm dissection dish</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">For eye cup dissection (Figure 1C)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Dissecting microscope&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Leica, Houston, USA&#160;</td>
			<td style="width:236px;">MZ12.5 High-performance stereomicroscope</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Micro Knives - Plastic Handle&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#10315-12</td>
			<td style="width:365px;">To make a small incision at the burn mark (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Pink dental wax&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#72660</td>
			<td style="width:365px;">For coating dissection dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Slide Rack and Coverplate</td>
			<td style="width:209px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:236px;">#36107</td>
			<td style="width:365px;">For retinal IHC (Figure 1G)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Stainless Steel Beaker (89 x 114mm)</td>
			<td style="width:209px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#MA-40</td>
			<td style="width:365px;">For isopentane bath (Figure 1E)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Styrofoam box</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">For insulated cooler</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Thin forceps Dumont #5&#160;&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#11254-20</td>
			<td style="width:365px;">To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Tissue-Tek cryomold&#160; (10mm x 10mm x 5mm)</td>
			<td style="width:209px;">Electron Miscroscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#62534-10</td>
			<td style="width:365px;">Mold for OCT embedding</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Buffers and Reagents</td>
			<td style="width:209px;">Company</td>
			<td style="width:236px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:365px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Blocking solution</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="77">
			<td height="77" style="height:77px;width:317px;">Gelvatol (anti-fading mounting media)</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).&#160; Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops).&#160; Store in amber drop bottle at 4&#176;C&#160; (8).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Hoechst 33342 1000x Stock</td>
			<td style="width:209px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:236px;">#62249</td>
			<td style="width:365px;">1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4&#176;C for up to 1 year or at -20&#176;C for long term storage. Prepare fresh&#160; at 1 ug/mL (1x)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Isopentane, 99%&#160;</td>
			<td style="width:209px;">GFS Chemicals</td>
			<td style="width:236px;">#2961</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:317px;">Paraformaldehyde (PFA) in PBS</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#15710</td>
			<td style="width:365px;">Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4&#176;C in the dark.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:317px;">Permeabilization solution</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.&#160; Prepare fresh.</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:317px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:209px;">Bioworld&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#41620015-20</td>
			<td style="width:365px;">0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.&#160; Prepared from 10x stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Sucrose solutions</td>
			<td style="width:209px;">Fisher Scientific&#160;&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#S-5-500</td>
			<td style="width:365px;">Dissolve the appropriate amount of sucrose in&#160; 37&#176;C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4&#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Tissue-Tek OCT-compound&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Sakura</td>
			<td style="width:236px;">&#160;#4583</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Antibodies</td>
			<td style="width:209px;">Company</td>
			<td style="width:236px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:365px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-calbindin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8666</td>
			<td>To label horinzotal cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-GAD65</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB5082</td>
			<td>To label GABAergic amacrine cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-GS</td>
			<td>BD Transduction</td>
			<td>610517</td>
			<td>To label M&#252;ller cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-rhodopsin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5316</td>
			<td>To label rods</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of mouse retinal cryo-sections for immunohistochemistry

La preparación de secciones oculares de ratón de alta calidad para la inmunohistoquímica (IHC) es fundamental para evaluar la estructura y la función de la retina y para determinar los mecanismos subyacentes a las enfermedades de la retina. Mantener la integridad estructural en toda la preparación del tejido es vital para obtener datos reproducibles de IHC de la retina, pero puede ser difícil debido a la fragilidad y complejidad de la citoarquitectura de la retina. Los fijadores fuertes como el 10% de la formalina o la solución de Bouin preservan de manera óptima la estructura de la retina, a menudo impiden el análisis de IHC al mejorar la fluorescencia de fondo y/o disminuir las interacciones entre anticuerpos y epítopos, un proceso conocido como enmascaramiento de epítopos. Los fijadores más leves, por otro lado, como el 4% de paraformaldehído, reducen la fluorescencia de fondo y el enmascaramiento de epítopos, se deben utilizar técnicas de disección meticulosas para preservar la estructura de la retina. En este artículo, presentamos un método integral para preparar vasos posteriores oculares de ratón para IHC que es suficiente para preservar la mayoría de las interacciones entre anticuerpos y epítopos sin pérdida de integridad estructural de la retina. Incluimos IHC representativo con anticuerpos a varios marcadores de tipo célula de la retina para ilustrar la preservación y orientación del tejido en condiciones óptimas y subóptimas. Nuestro objetivo es optimizar los estudios IHC de la retina proporcionando un protocolo completo de la disección ocular posterior de la copa a IHC.

Para ilustrar cómo estos protocolos, aseguran una preservación óptima de la retina para IHC, sondeamos secciones de retina de ratones P28 WT (C57BL/6N) con anticuerpos contra la rodopesina (un marcador de fotorreceptor)8, ácido glutámico descarboxilasa 65 (Gad65, una célula de amacrina 9, glutamina sintetasa (GS, un marcador de célula de M'ller)10, y calbindina (un marcador de celda horizontal)<sup class="xref"...

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Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Este informe describe métodos completos para preparar secciones de retina de ratón congeladas para inmunohistoquímica (IHC). Los métodos descritos incluyen disección de la copa ocular posterior, fijación de paraformaldehído, incrustación en la temperatura de corte óptima (OCT) orientación de medios y tejidos, seccionamiento e inmunomancha.

Preparación de criosecciones retinianas de ratón para inmunohistoquímica

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

La disección de la retina del ratón es un proceso muy delicado debido al tamaño y la forma de los ojos y la fragilidad de la sección de la retina. Imperativo para la práctica, tener un protocolo detallado que proporcione un método y consejos eficientes es la clave para la disección y sección de la retina de alta calidad. Proporcionamos consejos y consejos para ayudar a los investigadores a evitar escollos comunes y obtener algunas secciones de retina de alta calidad adecuadas para la inmunohistoquímica.Marque la parte temporal del ojo de un ratón eutanizado usando un cauterizador de cola tocando la córnea muy ligeramente y durante no más de una fracción de segundo para quemar ligeramente la córnea y evitar hacer un agujero. Inmediatamente después se utilizó púas curvadas Dumont 545 para enuclear los ojos del ratón. Coloque los ojos en un criotubo de 1,5 mililitros con un mililitro de 4%PFA y PBS e incubar durante 15 minutos sobre hielo.Luego, transfiera los ojos fijos usando los fórceps curvos Dumont 545 a una placa de disección de 35 milímetros modificada llena de PBS y colóquelas bajo microscopio de disección. Utilice una microknife para hacer una pequeña incisión en la marca de quemadura perpendicular y justo por encima del borde del limbo de la córnea. Inserte tijeras curvas en la incisión y realice un corte circunferencial de la córnea después del limbo.Luego, usando fórceps delgados de Dumont 5, retire la córnea, extraiga la lente y levántela delicadamente lejos de la parte posterior del ojo. El cuerpo vítreo saldrá con la lente y la retina será visible como una superficie blanca que cubre el interior de la copa del ojo posterior. Lave las copas de los ojos aisladas dos veces en un mililitro de PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente.Para proteger las copas de los ojos, equilibrelas en 15% de sacarosa y PBS durante la noche a cuatro grados centígrados hasta que se hundan. Luego transfiera las copas de los ojos a 30%sucrose y PBS durante dos a tres horas hasta que se hundan. Coloque las copas de los ojos en OCT en criomoldeos de 10 por 10 milímetros para incrustar.Bajo un microscopio diseccionador, oriente el ojo en el criomodo a lo largo de su eje ventral dorsal girando el ojo hasta que la marca de quemadura esté en la parte superior. El nervio óptico es uno a la izquierda y la parte cortada del molde mira hacia la derecha. Para congelar el tejido de la retina, sumerja el criomodo durante al menos cinco minutos en un vaso de precipitados metálicos que contenga isopentano y luego coloque el vaso de precipitados en nitrógeno líquido hasta un tercio de la altura del vaso de precipitados.Retire el bloque congelado, envuélvalo en papel de aluminio y guárdelo a menos 80 grados Centígrados. Utilice un bolígrafo o Sharpie para marcar el bloque congelado para registrar su orientación. Después de ajustar la temperatura del criostato entre menos 20 y menos 25 grados Celsius, coloque los moldes que contienen las copas de los ojos incrustadas en el interior y permita que se equilibren a la temperatura del criostato durante una hora.Instale el bloque en el criostato con la orientación ventral dorsal y comience a cortar secciones seriales de 10 micrómetros de espesor. Coloque cuidadosamente las secciones de la retina en diapositivas de microscopio anotadas y numeradas y luego guárdelas a menos 20 grados Celsius o menos 80 grados Celsius hasta que estén listas para la inmunosudera. Inmunohistoquímica con anticuerpos contra la rodopsina, un marcador de fotorreceptor, descarboxilasa 65 de ácido glutámico y marcador de células de amacrina, sintetasa de glutamina y marcador celular Muller, y calbindina, un marcador celular horizontal en secciones de la retina.Los resultados indican que este protocolo produce secciones de retina de alta calidad y bien conservadas a diferencia de las secciones de retina de mala calidad obtenidas de un protocolo diferente. Los segmentos internos y externos ricos de Rhodopsin permanecen verticales e intactos con poca o ninguna separación del epitelio pigmentado de la retina. Las interneuriones, como las células de amacrina positivas Gad65, permanecen correctamente estratificadas dentro de la capa nuclear interna y la capa plexiforme interna.Además, las células De Muller permanecen bien conservadas con soma correctamente alineado en procesos citoplasmáticos que abarcan desde la capa celular ganglionar hasta la capa nuclear externa. Además, las células horizontales bien definidas son detectables en la capa nuclear interna y el borde exterior de la capa plexiforme. Es importante marcar la región topper de los ojos y mantener la orientación durante la incrustación.Prepare siempre el paraformaldehído bajo el capó con el equipo de protección personal adecuado.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Investigación

Neurociencias

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Disección de un ojo del ratón de un monte entero del epitelio pigmentario de la retina

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Preparación de tejido cerebral de primates no humanos para Pre-incrustación de inmunohistoquímica y la microscopía electrónica de

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Tomografía de coherencia óptica: Proyección de imagen de ratón ganglionares de la retina las células In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Optimization of the Retinal Vein Occlusion Mouse Model to Limit Variability

Optimización del modelo de ratón de oclusión de venas retinianas para limitar la variabilidad

Mouse models of retinal vein occlusion (RVO) are often used in ophthalmology to study hypoxic-ischemic injury in the neural retina. In this report, a ...

Mouse Retina Isolation and Methanol Treatment for Studying Retinal Ganglion Cells

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells (Video) | JoVE 

Preparación de montaje completo a base de metanol para la investigación de células ganglionares de la retina

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...

Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry

Detección de proteína priónica anormal por inmunohistoquímica

Abnormal prion proteins (PrPSc) are the disease-associated isoform of cellular prion protein and diagnostic markers of transmissible spongiform ...

Mouse Retina OCT Fibergram Alignment with Confocal Images

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

Advancements in In Vivo and Ex Vivo Retinal Imaging for Improved Glaucoma Diagnosis and Treatment (Video) | JoVE

Alineación de figramas de tomografía de coherencia óptica en luz visible con imágenes confocales de la misma retina de ratón

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...