Name: preparation of mouse retinal cryo-sections for immunohistochemistry
Uploaded: 2019-07-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry at JoVE.com

Detta arbete stöddes av medel från NIH (RO1-GMO97327) och University Research Foundation (UPenn). Vi tackar särskilt Svetlana Savina för hennes hjälp att utveckla immunhistokemi protokoll, Gordon ruthel (University of Pennsylvania) och Penn vet Imaging Core för hjälp med Mikroskopi och Leslie King, pH.D. för kritisk läsning Detta manuskript .

Alla metoder som beskrivs här utfördes i strikt överensstämmelse med rekommendationerna i de nationella hälso-och sjukvårds instituten för skötsel och användning av försöks djur som tillhandahölls av Institutet för laboratorie djurs resurser och godkändes av Institutionell djur vård och användning kommittén vid University of Pennsylvania.
Alla verktyg och all utrustning för metoderna visas i figur 1 och listas i material tabellen...

<ol>
	<li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labelled+antigens+and+antibodies.">Labelled antigens and antibodies.</a> Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).</li><li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+antibodies+as+histochemical+tools.">Fluorescent antibodies as histochemical tools.</a> Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).</li><li>Coons, A. H., Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+antigen+in+tissue+cells;+improvements+in+a+method+for+the+detection+of+antigen+by+means+of+fluorescent+antibody.">Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody.</a> Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).</li><li>Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artefacts+in+histopathology.">Artefacts in histopathology.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).</li><li>Hartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+sections+from+Bouin-fixed+material+in+histopathology.">Frozen sections from Bouin-fixed material in histopathology.</a> Stain Technology. 20, 113 (1945).</li><li>Benerini Gatta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+alternative+fixatives+to+formalin+in+diagnostic+pathology.">Application of alternative fixatives to formalin in diagnostic pathology.</a> European Journal of Histochemistry. 56 (2), e12 (2012).</li><li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+cryoultramicrotomy+to+immunocytochemistry.">Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry.</a> Journal of Microscopy. 143 (Pt 2), 139-149 (1986).</li><li>Imai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+properties+of+rhodopsin+and+rod+function.">Molecular properties of rhodopsin and rod function.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6677-6684 (2007).</li><li>Lee, J. W., Lim, M. Y., Park, Y. S., Park, S. J., Kim, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reexamination+of+Dopaminergic+Amacrine+Cells+in+the+Rabbit+Retina:+Confocal+Analysis+with+Double-+and+Triple-labeling+Immunohistochemistry.">Reexamination of Dopaminergic Amacrine Cells in the Rabbit Retina: Confocal Analysis with Double- and Triple-labeling Immunohistochemistry.</a> Experimental Neurobiology. 26 (6), 329-338 (2017).</li><li>Bringmann, A., Grosche, A., Pannicke, T., Reichenbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+and+Glutamate+Uptake+and+Metabolism+in+Retinal+Glial+(Muller)+Cells.">GABA and Glutamate Uptake and Metabolism in Retinal Glial (Muller) Cells.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 4, 48 (2013).</li><li>Nakhai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ptf1a+is+essential+for+the+differentiation+of+GABAergic+and+glycinergic+amacrine+cells+and+horizontal+cells+in+the+mouse+retina.">Ptf1a is essential for the differentiation of GABAergic and glycinergic amacrine cells and horizontal cells in the mouse retina.</a> Development. 134 (6), 1151-1160 (2007).</li><li>Applebury, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+cone+photoreceptor:+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning.">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).</li></ol>

Mus näthinnan dissektion är en delikat process på grund av den lilla storleken och formen av mus ögon och bräcklighet av näthinnans vävnad. Även om att utföra hög kvalitet dissektion är en fråga om praxis, med ett detaljerat protokoll, som ger effektiva metoder och tips är en nödvändighet för att få retinala avsnitt och IHC. Förutom de protokoll som beskrivs här, det finns flera tips som möjliggör konsekvent högkvalitativa retinala sektioner som är lämpliga för reproducerbara IHC.
<p class="j...

Immunhistokemi (IHC) är en kraftfull teknik för lokalisering av specifika proteiner och cellulära strukturer i vävnader på situ1,2,3. Olämpliga fixeringsmetoder och suboptimala snittning av komplexa vävnader kan störa vävnads strukturen, generera hög bakgrunds färgning eller minska antikroppskoncentrationen, vilket resulterar i infärgning artefakter och därav felaktig tolkning av IHC-data4. Eftersom ryggradsdjur näthinnan är en komplex och mycket organiserad neurala organ som består av skikt av sammankopplade foto receptorer, interneuroner och ganglion celler, det är mycket bräcklig och kan lätt störas under dissektion och snittning. En detaljerad, standardiserad, och validerade protokoll från mus öga dissektion och orientering till immunofärgning kommer att bidra avsevärt minska IHC artefakter, därmed öka tillförlitligheten av resultaten och möjliggör mer exakta jämför ande data Analys.
Det finns många protokoll för vävnads beredning för IHC, emellertid, inte alla är lämpliga för näthinne vävnad. Starka fixativ som 10% formalin eller Bouin lösning bevara näthinnans struktur under dissektion och snittning5. Tyvärr, starka fixativ leder ofta till den förbättrade bakgrunden fluorescens och epitop maskering på grund av kemisk modifiering av epitoper6. Å andra sidan, mildare fixativ, som 4% paraformaldehyd (PFA) kan lindra några av dessa artefakter men kräver noggrann dissektion och snittning för att bevara den optimala näthinnans struktur. PFA penetrerar snabbt vävnad, men tvär länkar proteiner mycket långsamt, vilket minskar risken för epitop maskering. Eftersom kort tid PFA inkubation är en relativt mild fixering, vävnader kräver ofta snabb frysning för att bevara antigener. Det är viktigt att undvika is kristall formation under vävnads frysning eftersom de snedvrider och skadar integriteten hos celler och vävnader7.
Här beskriver vi detaljerade och standardiserade protokoll för dissektion, fixering, och Cryo-skydd av mus okulär bakre koppar som ger konsekventa och pålitliga IHC-data.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1128px;" width="1129">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm)</td>
			<td style="width:209px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#MA-48</td>
			<td style="width:365px;">For liquid nitrogen (Figure 1E)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Aluminum foil&#160;</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Cauterizer&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Bovie</td>
			<td style="width:236px;">#AA01</td>
			<td style="width:365px;">To mark eye orientation (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:236px;">#72703-D</td>
			<td style="width:365px;">For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#15002-08</td>
			<td style="width:365px;">To circumferentially cut the cornea (Figure 1B)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Dental wax-coated 35mm dissection dish</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">For eye cup dissection (Figure 1C)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Dissecting microscope&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Leica, Houston, USA&#160;</td>
			<td style="width:236px;">MZ12.5 High-performance stereomicroscope</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Micro Knives - Plastic Handle&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#10315-12</td>
			<td style="width:365px;">To make a small incision at the burn mark (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Pink dental wax&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#72660</td>
			<td style="width:365px;">For coating dissection dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Slide Rack and Coverplate</td>
			<td style="width:209px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:236px;">#36107</td>
			<td style="width:365px;">For retinal IHC (Figure 1G)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Stainless Steel Beaker (89 x 114mm)</td>
			<td style="width:209px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#MA-40</td>
			<td style="width:365px;">For isopentane bath (Figure 1E)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Styrofoam box</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">For insulated cooler</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Thin forceps Dumont #5&#160;&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#11254-20</td>
			<td style="width:365px;">To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Tissue-Tek cryomold&#160; (10mm x 10mm x 5mm)</td>
			<td style="width:209px;">Electron Miscroscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#62534-10</td>
			<td style="width:365px;">Mold for OCT embedding</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Buffers and Reagents</td>
			<td style="width:209px;">Company</td>
			<td style="width:236px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:365px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Blocking solution</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="77">
			<td height="77" style="height:77px;width:317px;">Gelvatol (anti-fading mounting media)</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).&#160; Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops).&#160; Store in amber drop bottle at 4&#176;C&#160; (8).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Hoechst 33342 1000x Stock</td>
			<td style="width:209px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:236px;">#62249</td>
			<td style="width:365px;">1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4&#176;C for up to 1 year or at -20&#176;C for long term storage. Prepare fresh&#160; at 1 ug/mL (1x)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Isopentane, 99%&#160;</td>
			<td style="width:209px;">GFS Chemicals</td>
			<td style="width:236px;">#2961</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:317px;">Paraformaldehyde (PFA) in PBS</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#15710</td>
			<td style="width:365px;">Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4&#176;C in the dark.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:317px;">Permeabilization solution</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.&#160; Prepare fresh.</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:317px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:209px;">Bioworld&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#41620015-20</td>
			<td style="width:365px;">0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.&#160; Prepared from 10x stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Sucrose solutions</td>
			<td style="width:209px;">Fisher Scientific&#160;&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#S-5-500</td>
			<td style="width:365px;">Dissolve the appropriate amount of sucrose in&#160; 37&#176;C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4&#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Tissue-Tek OCT-compound&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Sakura</td>
			<td style="width:236px;">&#160;#4583</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Antibodies</td>
			<td style="width:209px;">Company</td>
			<td style="width:236px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:365px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-calbindin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8666</td>
			<td>To label horinzotal cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-GAD65</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB5082</td>
			<td>To label GABAergic amacrine cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-GS</td>
			<td>BD Transduction</td>
			<td>610517</td>
			<td>To label M&#252;ller cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-rhodopsin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5316</td>
			<td>To label rods</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of mouse retinal cryo-sections for immunohistochemistry

Beredning av högkvalitativa mus ögat sektioner för immunhistokemi (IHC) är avgörande för att bedöma näthinnans struktur och funktion och för att fastställa mekanismerna bakom retinala sjukdomar. Upprätthålla strukturell integritet hela vävnads beredningen är avgörande för att få reproducerbara retinal IHC data men kan vara utmanande på grund av bräcklighet och komplexitet retinal cytoarchitecture. Starka fixativ som 10% formalin eller Bouin lösning optimalt bevara näthinnans struktur, de ofta hämma IHC analys genom att förbättra bakgrunden fluorescens och/eller minskande anti kroppar-epitop interaktioner, en process som kallas epitop maskering. Mildare fixativ, å andra sidan, som 4% paraformaldehyd, minskar bakgrundsfluorescens och Epitope-maskering, noggrann dissektion tekniker måste användas för att bevara näthinnans struktur. I denna artikel presenterar vi en omfattande metod för att förbereda mus okulär bakre koppar för IHC som är tillräcklig för att bevara de flesta anti kroppar-epitop interaktioner utan förlust av näthinnans strukturella integritet. Vi inkluderar representativa IHC med anti kroppar mot olika retinal cell typ markörer för att illustrera vävnads bevarande och orientering under optimala och suboptimala förhållanden. Vårt mål är att optimera IHC studier av näthinnan genom att tillhandahålla ett komplett protokoll från okulär bakre kopp dissektion till IHC.

För att illustrera hur dessa protokoll, säkerställa optimal näthinne bevarande för IHC, vi probed retinal sektioner från P28 WT möss (C57BL/6N) med anti kroppar mot rhodopsin (en foto receptor markör)8, glutaminsyra dekarboxylas 65 (Gad65, en amakrina cell markör)9, glutaminsynthetas (GS, en Müller-cellmarkör)10, och calbindin (en horisontell cell markör)11 (fig...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry at JoVE.com

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Denna rapport beskriver omfattande metoder för beredning av frysta musens näthinnan sektioner för immunhistokemi (IHC). Metoder som beskrivs inkluderar dissektion av okulär bakre kopp, paraformaldehyd fixering, inbäddning i optimal skär temperatur (ULT) media och vävnads orientering, snittning och immunofärgning.

Beredning av Mouse retinal Cryo-sektioner för immunhistokemi

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Mus näthinnans dissekering är en riktigt känslig process på grund av storleken och formen på ögonen och skörheten i näthinnan avsnitt. Absolut nödvändigt att öva, med ett detaljerat protokoll som ger effektiv metod och tips är nyckeln till hög kvalitet retinal dissekering och avsnitt. Vi ger tips och råd för att hjälpa forskare undvika vanliga fallgropen och få några högkvalitativa retinal sektioner som lämpar sig för immunohistokemi.Markera den tidsmässiga delen av ögat av en avlivad mus med hjälp av en svans cauterizer genom att röra hornhinnan mycket lätt och för inte mer än en bråkdels sekund att något bränna hornhinnan och undvika att göra ett hål. Omedelbart efter att används böjda Dumont 545 tlyktor för att enucleate mus ögon. Placera ögonen i en 1,5 milliliter cryotube med en milliliter på 4%PFA och PBS och inkubera i 15 minuter på is.Överför sedan de fasta ögonen med hjälp av den böjda Dumont 545-forceps till en modifierad 35 millimeters dissektionsskål fylld med PBS och placera under dissekerande mikroskop. Använd en mikrokniv för att göra ett litet snitt vid brännmärket vinkelrätt mot och strax ovanför hornhinnans limbusgräns. Sätt in böjda saxar i snittet och utför en omskuren snitt av hornhinnan efter limbus.Sedan, med hjälp av tunna Dumont 5-tlyktor, ta bort hornhinnan, extrahera linsen, och lyft den försiktigt bort från den bakre delen av ögat. Den glaskropp kommer att komma ut med linsen och näthinnan kommer att vara synlig som en vit yta som täcker insidan av den bakre ögonbägaren. Tvätta de isolerade ögonkopparna två gånger i en milliliter PBS i 10 minuter i rumstemperatur.För att cryo-skydda ögat koppar, jämvikt dem i 15%sackaros och PBS över natten vid fyra grader Celsius tills de sjunker. Överför sedan ögonkopparna till 30%sackaros och PBS i två till tre timmar tills de sjunker. Placera ögat koppar i OKT i 10 av 10 millimeter kryo-formar för ingjutning.Under en dissekerande mikroskop, orientera ögat i kryo-mögel längs dess dorsala ventrala axeln genom att rotera ögat tills brännmärket är på toppen. Synnerven är en vänster och den utskurna delen av formen vetter mot höger. För att knäppa frysa näthinnevävnaden, sänk ner kryo-mögel i minst fem minuter i en metallbägare som innehåller isopentan och sedan placera bägaren i flytande kväve upp till en tredjedel av höjden på bägaren.Ta bort det frusna blocket, linda in det i aluminiumfolie och förvara på minus 80 grader Celsius. Använd en penna eller Sharpie för att markera det frusna blocket för att registrera dess orientering. Efter justering av kryostattemperaturen mellan minus 20 och minus 25 grader Celsius, placera formar som innehåller inbäddade ögonkoppar inuti och låt dem ekviloleda till kryostattemperaturen i en timme.Installera blocket i kryostaten med den dorsala ventrala orienteringen och börja skära 10 mikrometer tjocka seriesektioner. Placera noggrant näthinnesektionerna på kommenterade och numrerade mikroskopsglas och förvara sedan i glidlådor på minus 20 grader Celsius eller minus 80 grader Celsius tills de är redo för immunfärgning. Immunohistokemi med antikroppar mot rhodopsin, en fotoreceptor markör, glutamic syra decarboxylase 65 och amacrine cell markör, glutamin synthetase och Muller cell markör och calbindin, en horisontell cell markör utfördes på retinal sektioner.Resultaten visar att detta protokoll ger hög kvalitet och väl bevarade retinal sektioner till skillnad från i dålig kvalitet retinal sektioner som erhållits från ett annat protokoll. Rhodopsin rika inre och yttre segment förblir vertikala och intakt med liten eller ingen separation från överlyra näthinnan pigmenterad epitel. Interneurons, såsom Gad65 positiva amacrine celler, förblir ordentligt stratifierade inom det inre kärnskiktet och inre plexiform lagret.Också, Muller celler förblir väl bevarade med soma korrekt anpassade i cytoplasmatiska processer som sträcker sig från ganglion cellskiktet till det yttre nukleära lagret. Vidare är väldefinierade horisontella celler detekterbara vid det inre kärnskiktet och yttre plexiformskiktets gräns. Det är viktigt att markera topper regionen i ögonen och hålla orienteringen under inbäddning.Förbered alltid paraformaldehyd under huven med lämplig personlig skyddsutrustning.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Beredning av Mouse hjärnvävnad för Immunoelectron mikroskopi

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Patch Clamp Inspelningar från mus näthinnan nervceller i en anpassad Dark-Slice Förberedelser

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

En isolerad näthinnan förberedelse till Record Ljus Svar från Genetiskt Märkta Retinal ganglion celler

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Dissekering av en mus Eye för en hel berget av pigmentepitelet

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Framställning av icke-mänskliga primater hjärnvävnad för Pre-inbäddning Immunohistokemi och elektronmikroskopi

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optisk koherenstomografi: Imaging mus Retinal Ganglion celler In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Optimization of the Retinal Vein Occlusion Mouse Model to Limit Variability

Optimering av retinal venocklusionsmusmodell för att begränsa variabilitet

Mouse models of retinal vein occlusion (RVO) are often used in ophthalmology to study hypoxic-ischemic injury in the neural retina. In this report, a ...

Mouse Retina Isolation and Methanol Treatment for Studying Retinal Ganglion Cells

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells (Video) | JoVE 

Metanolbaserad helmonteringsberedning för undersökning av retinala ganglieceller

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...

Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry

Detektion av onormalt prionprotein genom immunhistokemi

Abnormal prion proteins (PrPSc) are the disease-associated isoform of cellular prion protein and diagnostic markers of transmissible spongiform ...

Mouse Retina OCT Fibergram Alignment with Confocal Images

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

Advancements in In Vivo and Ex Vivo Retinal Imaging for Improved Glaucoma Diagnosis and Treatment (Video) | JoVE

Justering av optisk koherenstomografi i synligt ljus med konfokala bilder av samma musnäthinna

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...