Name: preparation of mouse retinal cryo-sections for immunohistochemistry
Uploaded: 2019-07-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry at JoVE.com

Bu çalışma NıH (RO1-GMO97327) ve Üniversite Araştırma Vakfı (UPenn) ' den gelen fonlar tarafından destekleniyordu. Özellikle, immunohistokimya protokolü, Gordon Ruthel (Pennsylvania Üniversitesi) ve Penn VET Imaging Core ile ilgili yardım için mikroskopi ve Leslie King, PhD. .

Burada tarif edilen tüm yöntemler, laboratuar hayvan kaynakları Enstitüsü tarafından sağlanan Laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için Ulusal Sağlık Rehberi 'nin önerileri ile sıkı bir şekilde yürütülmüştür ve Pennsylvania Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi.
Yöntem için tüm araç ve ekipmanlar Şekil 1 ' de gösterilir ve malzeme tablosundalistelenir.
1. Far...

<ol>
	<li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labelled+antigens+and+antibodies.">Labelled antigens and antibodies.</a> Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).</li><li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+antibodies+as+histochemical+tools.">Fluorescent antibodies as histochemical tools.</a> Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).</li><li>Coons, A. H., Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+antigen+in+tissue+cells;+improvements+in+a+method+for+the+detection+of+antigen+by+means+of+fluorescent+antibody.">Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody.</a> Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).</li><li>Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artefacts+in+histopathology.">Artefacts in histopathology.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).</li><li>Hartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+sections+from+Bouin-fixed+material+in+histopathology.">Frozen sections from Bouin-fixed material in histopathology.</a> Stain Technology. 20, 113 (1945).</li><li>Benerini Gatta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+alternative+fixatives+to+formalin+in+diagnostic+pathology.">Application of alternative fixatives to formalin in diagnostic pathology.</a> European Journal of Histochemistry. 56 (2), e12 (2012).</li><li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+cryoultramicrotomy+to+immunocytochemistry.">Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry.</a> Journal of Microscopy. 143 (Pt 2), 139-149 (1986).</li><li>Imai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+properties+of+rhodopsin+and+rod+function.">Molecular properties of rhodopsin and rod function.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6677-6684 (2007).</li><li>Lee, J. W., Lim, M. Y., Park, Y. S., Park, S. J., Kim, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reexamination+of+Dopaminergic+Amacrine+Cells+in+the+Rabbit+Retina:+Confocal+Analysis+with+Double-+and+Triple-labeling+Immunohistochemistry.">Reexamination of Dopaminergic Amacrine Cells in the Rabbit Retina: Confocal Analysis with Double- and Triple-labeling Immunohistochemistry.</a> Experimental Neurobiology. 26 (6), 329-338 (2017).</li><li>Bringmann, A., Grosche, A., Pannicke, T., Reichenbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+and+Glutamate+Uptake+and+Metabolism+in+Retinal+Glial+(Muller)+Cells.">GABA and Glutamate Uptake and Metabolism in Retinal Glial (Muller) Cells.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 4, 48 (2013).</li><li>Nakhai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ptf1a+is+essential+for+the+differentiation+of+GABAergic+and+glycinergic+amacrine+cells+and+horizontal+cells+in+the+mouse+retina.">Ptf1a is essential for the differentiation of GABAergic and glycinergic amacrine cells and horizontal cells in the mouse retina.</a> Development. 134 (6), 1151-1160 (2007).</li><li>Applebury, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+cone+photoreceptor:+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning.">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).</li></ol>

Fare Retina diseksiyon küçük boyutu ve fare gözleri şekli ve Retina doku kırılganlık nedeniyle hassas bir süreçtir. Yüksek kaliteli diseksiyon yapmak bir uygulama meselesi olsa da, ayrıntılı bir protokole sahip olmak, verimli yöntemler ve ipuçları sağlamak Retina bölümler ve IHC elde etmek için bir zorunluluktur. Burada açıklanan protokollere ek olarak, tekrarlanabilir IHC için uygun olan tutarlı yüksek kaliteli Retina bölümler için izin çeşitli ipuçları vardır.
<p class="jove_conten...

İmmünhistokimya (IHC), situ1,2,3' te dokularda spesifik proteinleri ve hücresel yapıları yerelleştirme için güçlü bir tekniktir. Uygunsuz fiksasyon yöntemleri ve kompleks dokuların alt-optimum kesmesi doku yapısını bozabilir, yüksek arka plan boyama veya antikor-epitope etkileşimlerini azaltır, boyama eserler ve sonuç olarak yanlış yorumlama sonucu IFC veri4. Vertebrat retinası, birbirine bağlı fotoreceptörler, internöronlar ve ganglion hücrelerinin tabaklarından oluşan kompleks ve son derece organize nöral organdır, çok kırılgan ve diseksiyon ve sekleme sırasında kolayca bozulabilir. Fare göz diseksiyonu ve immünostasyon oryantasyonlarından ayrıntılı, standartlaştırılmış ve onaylanmış bir protokol, ıHC yapılarını önemli ölçüde azaltmaya yardımcı olur, böylece sonuçların güvenilirliğini arttırır ve daha doğru karşılaştırmalı veri sağlar Analysis.
IHC için doku hazırlama için birçok protokol vardır, ancak, tüm Retina doku için uygun değildir. % 10 formalin veya Bouin çözeltisi gibi güçlü fiksatörler, diseksiyon ve sekleme sırasında retina yapısını korur5. Ne yazık ki, güçlü fiksasyonlar genellikle Gelişmiş arka plan floresans ve epitopu maskeleme nedeniyle epitoplar kimyasal modifikasyon6yol açar. Öte yandan,% 4 paraformaldehit (PFA) gibi daha hafif fiksatörler, bu yapıtlardan bazılarını hafifletebilir ancak optimum retina yapısını korumak için titiz diseksiyon ve sekürleme gerektirir. PFA hızla dokuya nüfuz eder, ancak proteinleri çok yavaş çapraz bağlar, epitopu maskeleme riskini azaltır. Kısa süre içinde PFA inkübasyon nispeten hafif bir fikfasyon olduğundan, dokularda genellikle antijenleri korumak için hızlı donma gerektirir. Doku donma sırasında buz kristali oluşumunun önlenmemesi ve hücrelerin ve dokularının bütünlüğünü bozması önemlidir7.
Burada, tutarlı ve güvenilir ıFC verilerini sağlayan fare oküler posterior bardakların diseksiyon, sabitleme ve Cryo koruması için ayrıntılı ve standartlaştırılmış protokoller açıklanmaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1128px;" width="1129">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm)</td>
			<td style="width:209px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#MA-48</td>
			<td style="width:365px;">For liquid nitrogen (Figure 1E)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Aluminum foil&#160;</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Cauterizer&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Bovie</td>
			<td style="width:236px;">#AA01</td>
			<td style="width:365px;">To mark eye orientation (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:236px;">#72703-D</td>
			<td style="width:365px;">For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#15002-08</td>
			<td style="width:365px;">To circumferentially cut the cornea (Figure 1B)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Dental wax-coated 35mm dissection dish</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">For eye cup dissection (Figure 1C)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Dissecting microscope&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Leica, Houston, USA&#160;</td>
			<td style="width:236px;">MZ12.5 High-performance stereomicroscope</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Micro Knives - Plastic Handle&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#10315-12</td>
			<td style="width:365px;">To make a small incision at the burn mark (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Pink dental wax&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#72660</td>
			<td style="width:365px;">For coating dissection dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Slide Rack and Coverplate</td>
			<td style="width:209px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:236px;">#36107</td>
			<td style="width:365px;">For retinal IHC (Figure 1G)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Stainless Steel Beaker (89 x 114mm)</td>
			<td style="width:209px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#MA-40</td>
			<td style="width:365px;">For isopentane bath (Figure 1E)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Styrofoam box</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">For insulated cooler</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Thin forceps Dumont #5&#160;&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#11254-20</td>
			<td style="width:365px;">To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Tissue-Tek cryomold&#160; (10mm x 10mm x 5mm)</td>
			<td style="width:209px;">Electron Miscroscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#62534-10</td>
			<td style="width:365px;">Mold for OCT embedding</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Buffers and Reagents</td>
			<td style="width:209px;">Company</td>
			<td style="width:236px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:365px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Blocking solution</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="77">
			<td height="77" style="height:77px;width:317px;">Gelvatol (anti-fading mounting media)</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).&#160; Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops).&#160; Store in amber drop bottle at 4&#176;C&#160; (8).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Hoechst 33342 1000x Stock</td>
			<td style="width:209px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:236px;">#62249</td>
			<td style="width:365px;">1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4&#176;C for up to 1 year or at -20&#176;C for long term storage. Prepare fresh&#160; at 1 ug/mL (1x)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Isopentane, 99%&#160;</td>
			<td style="width:209px;">GFS Chemicals</td>
			<td style="width:236px;">#2961</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:317px;">Paraformaldehyde (PFA) in PBS</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#15710</td>
			<td style="width:365px;">Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4&#176;C in the dark.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:317px;">Permeabilization solution</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:365px;">PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.&#160; Prepare fresh.</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:317px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:209px;">Bioworld&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#41620015-20</td>
			<td style="width:365px;">0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.&#160; Prepared from 10x stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:317px;">Sucrose solutions</td>
			<td style="width:209px;">Fisher Scientific&#160;&#160;</td>
			<td style="width:236px;">#S-5-500</td>
			<td style="width:365px;">Dissolve the appropriate amount of sucrose in&#160; 37&#176;C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4&#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Tissue-Tek OCT-compound&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Sakura</td>
			<td style="width:236px;">&#160;#4583</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Antibodies</td>
			<td style="width:209px;">Company</td>
			<td style="width:236px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:365px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-calbindin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8666</td>
			<td>To label horinzotal cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-GAD65</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB5082</td>
			<td>To label GABAergic amacrine cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-GS</td>
			<td>BD Transduction</td>
			<td>610517</td>
			<td>To label M&#252;ller cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:317px;">anti-rhodopsin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5316</td>
			<td>To label rods</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of mouse retinal cryo-sections for immunohistochemistry

İmmünhistokimya (ıHC) için yüksek kaliteli fare göz bölümlerinin hazırlanması, Retina yapısının ve fonksiyonunun değerlendirilmesi ve Retina hastalıklarının temelindeki mekanizmaların belirlenmesi için önemlidir. Doku hazırlığı boyunca yapısal bütünlüğünü sürdürmek, tekrarlanabilir Retina IFC verilerini elde etmek için hayati önem taşımaktadır, ancak Retina sitilinin kırılganlık ve karmaşıklığı nedeniyle zor olabilir. % 10 formalin veya Bouin çözeltisi gibi güçlü fiksatörler Retina yapıyı optimum şekilde korur, genellikle arka plan floresan ve/veya azalan antikor-epitopu etkileşimleri, epitopu maskeleme olarak bilinen bir süreci artırarak IFC analizini azaltır. Diğer taraftan,% 4 paraformaldehit gibi daha hafif fiksatörler, retina yapısını korumak için arka plan floresan ve epitope-maskeleme, titiz diseksiyon tekniklerini azaltmıştır. Bu yazıda, Retina yapısal bütünlük kaybı olmadan en antikor-epitope etkileşimlerini korumak için yeterli olan IFC için fare oküler posterior bardakları hazırlamak için kapsamlı bir yöntem sunuyoruz. En uygun ve en uygun koşullarda doku koruma ve oryantasyonunu göstermek için çeşitli Retina hücre tipi belirteçleri için antikor ile temsilci ıHC içerir. Amacımız ihc 'de oküler posterior fincan diseksiyon tam bir protokol sağlayarak retinada ıFC çalışmalarını optimize etmektir.

Nasıl bu protokoller, IFC için optimum Retina koruma sağlamak göstermek için, biz P28 WT fareler (C57BL/6N) rodopsin (bir fotoreceptor Marker) antikorlar ile retina bölümler probed8, glutamik asit decarboksilaz 65 (Gad65, bir amacrine hücre Marker)9, glutamin sentetaz (GS, bir Müller hücre Marker)10, ve calbindin (yatay hücre işaretleyicisi)11 (Şekil 4...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry at JoVE.com

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Bu raporda, immünhistokimya (ıHC) için dondurulmuş fare Retina bölümlerini hazırlamak için kapsamlı yöntemler açıklanmaktadır. Tanımlanan yöntemlerle oküler posterior bardak diseksiyonu, paraformaldehit fikstasyon, optimum kesme sıcaklığı (OCT) medya ve doku oryantasyonu, seksiyonlama ve immünostasyonu katıştırma bulunmaktadır.

Immünhistokimya için fare retinal Cryo-bölümler hazırlanması

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Fare retinal diseksiyonu, gözlerin büyüklüğü ve şekli ve retina bölümünün kırılganlığı nedeniyle gerçekten hassas bir süreçtir. Uygulama zorunluluğu, verimli yöntem ve ipuçları sağlayan ayrıntılı bir protokole sahip yüksek kaliteli retinadisemi ve kesitanahtarıdır. Araştırmacının ortak tuzaklardan kaçınmasına ve immünohistokimyaya uygun yüksek kaliteli retina kesitleri elde etmelerine yardımcı olacak ipuçları ve öneriler sayılmaktayız.Çok hafifçe kornea dokunarak bir kuyruk küretterizer kullanarak bir ötenazi farenin gözünün zamansal kısmını işaretleyin ve korneayı hafifçe yakmak ve delik açmaktan kaçınmak için bir saniyeden fazla bir süre için. Bundan hemen sonra fare gözleri enucleate kavisli Dumont 545 forceps kullanılır. Gözleri 1,5 mililitrelik kriyotube'a yerleştirin ve %4'lük bir mililitre PFA ve PBS ile 15 dakika boyunca buzüzerinde kuluçkaya yatırın.Daha sonra, kavisli Dumont 545 çömleci kullanarak sabit gözleri PBS ile doldurulmuş modifiye edilmiş 35 milimetrelik bir diseksiyon kabına aktarın ve diseksiyon mikroskobun altına yerleştirin. Korneanın limbus sınırının hemen üzerinde ve dik yanık işareti küçük bir kesi yapmak için bir mikrobıçak kullanın. Kesiiçine kavisli makas yerleştirin ve limbus aşağıdaki kornea bir circumferential kesim gerçekleştirin.Daha sonra, ince Dumont 5 forseps kullanarak, kornea kaldırmak, lens ayıklamak, ve ince göz arka kısmından kaldırın. Vitreus vücut lens ile çıkacak ve retina arka göz fincan içinde kapsayan beyaz bir yüzey olarak görünür olacaktır. İzole göz kaplarını bir mililitre PBS'de iki kez oda sıcaklığında 10 dakika yıkayın.Göz kaplarını kriyo-korumak için, batışına kadar bir gecede %15 sakaroz ve PBS ile dört derece santigrat dereceye kadar dengeleyin. Daha sonra göz kaplarını batana kadar 2-3 saat boyunca %30 sakaroz ve PBS'ye aktarın. Katıştırma için 10 tarafından 10 milimetre kriyo-kalıplar EKIM göz bardak yerleştirin.Bir diseksiyon mikroskobu altında, yanık izi üstte olana kadar gözü döndürerek dorsal ventral ekseni boyunca kriyo-kalıp takik gözü yönlendirin. Optik sinir bir sol ve kalıp kesilmiş kısmı sağ yüzleri. Retina dokusunu dondurmak için kriyo-kalıbı isopentane içeren metal bir kabın içine en az beş dakika batırın ve kabıkabın yüksekliğinin üçte birine kadar sıvı nitrojene yerleştirin.Dondurulmuş blok çıkarın, alüminyum folyo sarın ve eksi 80 santigrat derece saklayın. Yönünü kaydetmek için dondurulmuş bloğu işaretlemek için bir kalem veya Sharpie kullanın. Eksi 20 ile eksi 25 santigrat derece arasındaki kriyostat sıcaklığını ayarladıktan sonra, gömülü göz bardaklarını içeren kalıpları içine yerleştirin ve bir saat boyunca kriyostat sıcaklığına dengede vermelerini bekleyin.Dorsal ventral oryantasyon ile kriyostat blok yükleyin ve 10 mikrometre kalınlığında seri bölümleri kesmeye başlayın. Retina kesitlerini açıklamalı ve numaralanmış mikroskop slaytlarına dikkatlice yerleştirin ve ardından immünboyamaya hazır olana kadar eksi 20 santigrat derece veya eksi 80 santigrat derece lik slayt kutularında saklayın. Retina kesitlerinde rodopsin antikorları olan immünohistokimya, fotoreseptör belirteci, glutamik asit dekarboksilaz 65, amakrin hücre belirteci, glutamin synthetase ve Muller hücre belirteci ve kalbindin yapıldı.Sonuçlar, bu protokolün farklı bir protokolden elde edilen düşük kaliteli retina kesitlerinin aksine yüksek kaliteli ve iyi korunmuş retina kesitleri verdiğini göstermektedir. Rodopsin açısından zengin iç ve dış segmentleri retina pigmentli epitel in üzerini örten çok az ve hiç ayrım ile dikey ve bozulmamış kalır. İnternöronlar, Gad65 pozitif amakrin hücreleri gibi, düzgün iç nükleer tabaka ve iç pleksiform tabakası içinde tabakalaşmış kalır.Ayrıca, Muller hücreleri iyi soma düzgün ganglion hücre tabakası dış nükleer tabaka yayılan sitoplazmik süreçler hizalanmış ile korunmuş kalır. Ayrıca, iyi tanımlanmış yatay hücreler iç nükleer tabaka ve dış pleksiform tabaka sınırında tespit edilebilir. Gözün üst bölgesini işaretlemek ve katıştırma sırasında yönünü korumak önemlidir.Her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman ile kaputun altında paraformaldehit hazırlamak.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Fare Beyin Dokusu Immunoelectron Mikroskopi için hazırlanması

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Patch Kelepçe bir Karanlık adapte Dilim Hazırlık Fare Retina Nöronlar Kayıtlar

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

Genetik Etiketli Retina Ganglion Hücreleri Işık Tepkisi Record İzole Retina Hazırlık

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Retina pigment epiteli Tüm Mount Fare Göz Diseksiyon

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

İmmünohistokimya ve elektron mikroskobu Ön gömme için İnsan Olmayan Primat Beyin Dokusu Hazırlanması

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optik Koherens tomografi: Fare retina Ganglion hücreleri Vivo içinde görüntüleme

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Optimization of the Retinal Vein Occlusion Mouse Model to Limit Variability

Değişkenliği Sınırlamak için Retinal Ven Tıkanıklığı Fare Modelinin Optimizasyonu

Mouse models of retinal vein occlusion (RVO) are often used in ophthalmology to study hypoxic-ischemic injury in the neural retina. In this report, a ...

Mouse Retina Isolation and Methanol Treatment for Studying Retinal Ganglion Cells

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells (Video) | JoVE 

Retinal ganglion hücrelerinin araştırılması için metanol bazlı tam montajlı preparat

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...

Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry

İmmünohistokimya ile Anormal Prion Proteininin Saptanması

Abnormal prion proteins (PrPSc) are the disease-associated isoform of cellular prion protein and diagnostic markers of transmissible spongiform ...

Mouse Retina OCT Fibergram Alignment with Confocal Images

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

Advancements in In Vivo and Ex Vivo Retinal Imaging for Improved Glaucoma Diagnosis and Treatment (Video) | JoVE

Görünür Işık Optik Koherens Tomografi Fibergramlarının Aynı Fare Retinasının Konfokal Görüntüleri ile Hizalanması

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...