Name: using near-infrared fluorescence and high-resolution scanning to measure protein expression in the rodent brain
Uploaded: 2019-05-23T15:00:00
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La ricerca in questo rapporto è stata finanziata da una sovvenzione bersaglio dai NIGMS (1P20GM103653) assegnato a DK.

Il seguente protocollo è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università del Delaware. Maschi Sprague Dawley ratti circa 55 – 75 giorni di età sono stati utilizzati per questo protocollo.
1. estrazione del cervello e preparazione dei tessuti
<ol><li>Anestetizzare ratto con isoflurano in anestesia camera di induzione fino a quando il ratto non presenta più una risposta al piede pizzico.</li>
	<li>Sacrifica i ratti attraverso una rapid...

<ol>
	<li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Neural Science. , (2013).</li><li>Byrne, J. H., Roberts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience. , (2009).</li><li>Salami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D2/3+binding+potential+modulates+neural+signatures+of+working+memory+in+a+load-dependent+fashion.">Dopamine D2/3 binding potential modulates neural signatures of working memory in a load-dependent fashion.</a> Journal of Neuroscience. , (2018).</li><li>Merali, Z., Khan, S., Michaud, D. S., Shippy, S. A., Anisman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+amygdaloid+corticotropin-releasing+hormone+(CRH)+mediate+anxiety-like+behaviors?+Dissociation+of+anxiogenic+effects+and+CRH+release.">Does amygdaloid corticotropin-releasing hormone (CRH) mediate anxiety-like behaviors? Dissociation of anxiogenic effects and CRH release.</a> European Journal of Neuroscience. 20 (1), 229-239 (2004).</li><li>English, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dataset+of+mouse+hippocampus+profiled+by+LC-MS/MS+for+label-free+quantitation.">Dataset of mouse hippocampus profiled by LC-MS/MS for label-free quantitation.</a> Data in Brief. 7, 341-343 (2016).</li><li>David, M. A., Tayebi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+protein+aggregates+in+brain+and+cerebrospinal+fluid+derived+from+multiple+sclerosis+patients.">Detection of protein aggregates in brain and cerebrospinal fluid derived from multiple sclerosis patients.</a> Frontiers in Neurology. 5, 251 (2014).</li><li>Oliver, C., Jamur, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+methods+and+protocols.">Immunocytochemical methods and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. , (2010).</li><li>Spitzer, N., Sammons, G. S., Price, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofluorescent+cells+in+rat+brain+can+be+convincing+impostors+in+green+fluorescent+reporter+studies.">Autofluorescent cells in rat brain can be convincing impostors in green fluorescent reporter studies.</a> Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 48-55 (2011).</li><li>Knox, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+c-Jun+to+identify+fear+extinction+learning-specific+patterns+of+neural+activity+that+are+affected+by+single+prolonged+stress.">Using c-Jun to identify fear extinction learning-specific patterns of neural activity that are affected by single prolonged stress.</a> Behavioural Brain Researach. 341, 189-197 (2018).</li><li>Knox, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuits+via+which+single+prolonged+stress+exposure+leads+to+fear+extinction+retention+deficits.">Neural circuits via which single prolonged stress exposure leads to fear extinction retention deficits.</a> Learning &amp; Memory. 23 (12), 689-698 (2016).</li><li>Malinow, R., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptor+trafficking+and+synaptic+plasticity.">AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity.</a> Annual Review of Neuroscience. 25, 103-126 (2002).</li><li>Nabavi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+memory+with+LTD+and+LTP.">Engineering a memory with LTD and LTP.</a> Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).</li><li>Kimmelmann-Shultz, B., Mohammadmirzaei, N., Della Valle, R., Knox, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+high+resolution+near+infrared+imaging+to+measure+fear-learning+induced+changes+in+AMPA/NMDA+ratios+throughout+the+fear+circuit.">Using high resolution near infrared imaging to measure fear-learning induced changes in AMPA/NMDA ratios throughout the fear circuit.</a> , (2018).</li><li>Eagle, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+prolonged+stress+enhances+hippocampal+glucocorticoid+receptor+and+phosphorylated+protein+kinase+B+levels.">Single prolonged stress enhances hippocampal glucocorticoid receptor and phosphorylated protein kinase B levels.</a> Neuroscience Research. 75 (2), 130-137 (2013).</li></ol>

I risultati presentati in questo articolo dimostrano che l'immunocitochimica vicino all'infrarosso in combinazione con la scansione ad alta risoluzione può essere utilizzata per ottenere misure semi-quantitative dell'espressione proteica nel tessuto cerebrale. Può anche essere usato per etichettare due proteine contemporaneamente nella stessa regione del cervello. In precedenza abbiamo usato immunoistochimica vicino all'infrarosso per misurare l'immediata espressione genica precoce in più regioni cerebrali<sup class="...

Lo studio della neuroscienza riguarda un'indagine su come le cellule nel cervello mediano funzioni specifiche1. Questi possono essere di natura cellulare, come ad esempio il modo in cui le cellule glia conferiscono immunità nel sistema nervoso centrale o possono coinvolgere esperimenti che mirano a spiegare come l'attività dei neuroni nell'ippocampo dorsale conduce alla navigazione spaziale. In senso ampio, la funzione cellulare è determinata dalle proteine che si esprimono in una cellula e dall'attività di queste proteine2. Di conseguenza, la misurazione dell'espressione e/o dell'attività delle proteine nelle cellule cerebrali è critica per lo studio delle neuroscienze.
Una serie di tecniche sono disponibili per misurare l'espressione proteica nel cervello. Questi includono metodi in vivo come la topografia di emissione di positroni per le densità dei recettori3 e la microdialisi per i piccoli peptidi4. Più comunemente, i metodi ex vivo vengono utilizzati per esaminare la funzione e l'espressione delle proteine. Questi includono tecniche di spettrometria di massa5, Western blot e saggio immunosorbente legato all'enzima (ELISA)6e immunocitochimica7. L'immunocitochimica è ampiamente utilizzata nel campo delle neuroscienze. Questa tecnica prevede l'uso di un anticorpo primario per rilevare una proteina (o antigene) di interesse (ad esempio, c-fos) e un anticorpo secondario coniugato per rilevare il complesso di anticorpi proteina-primario (Figura 1). Per consentire il rilevamento del complesso anticorpale-anticorpo primario-derivato di proteina-primaria, gli anticorpi secondari hanno agenti ossidanti come la perossidasi di rafano (HRP) coniugato a loro. Questo permette la formazione di precipitati in cellule che possono essere rilevati utilizzando la microscopia leggera7. Gli anticorpi secondari possono anche avere prodotti chimici fluorati coniugati (cioè fluorofori). Quando stimolato queste sostanze chimiche emettono luce, che può essere utilizzato per rilevare proteina-primario anticorpo-anticorpi secondari complessi7. Infine, a volte gli anticorpi primari hanno agenti riducenti e sostanze chimiche a fluorescenza attaccate direttamente negando la necessità di anticorpi secondari7 (Figura 1).
È interessante notare che, molti metodi di immunocitochimica consentono la visualizzazione delle proteine nelle cellule cerebrali, ma non la capacità di quantificare la quantità di proteine in una regione specifica della cellula o del cervello. Utilizzando la microscopia leggera per rilevare i precipitati dalle reazioni di riduzione consente la visualizzazione di neuroni e glia, ma questo metodo non può essere utilizzato per quantificare l'espressione proteica nelle cellule o in una specifica regione del cervello. In teoria, la microscopia a fluorescenza può essere utilizzata per questo, perché la luce emessa dall'anticorpo secondario fluorescente è una misura del complesso anticorpale-anticorpo primario-secondario proteina-primaria. Tuttavia, l'autofluorescenza nel tessuto cerebrale può rendere difficile l'uso della microscopia a fluorescenza per quantificare l'espressione proteica nel tessuto cerebrale8. Di conseguenza, la luce emessa dalle immagini fluorescenti del tessuto cerebrale è raramente utilizzata per quantificare l'espressione proteica nel cervello.
Molti di questi problemi possono essere affrontati utilizzando immunocitochimica Near-Infrared in combinazione con scansione ad alta risoluzione9,10. In questo articolo descriviamo come l'immunocitochimica accoppiata con i fluorofori negli spettri di emissione Near-Infrared può essere combinata con la scansione ad alta risoluzione (ad esempio, 10 – 21 μm) per ottenere immagini nitide che consentano la semi quantificazione delle proteine in distinte regioni cerebrali.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:658px;" width="657">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:658px;">Brain Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Anesthesia Induction Chamber</td>
			<td style="width:147px;">Kent Scientific</td>
			<td>VetFlo-0530SM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kleine Guillotine</td>
			<td style="width:147px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>73-1920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Friedman Rongeur</td>
			<td style="width:147px;">Fine Science Tools</td>
			<td>16000-14</td>
			<td>used to remove back of skull</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Delicate Dissecting Scissors</td>
			<td style="width:147px;">Fischer Scientific</td>
			<td>08-951-5</td>
			<td>used to cut upward along midline of skull</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Micro Spatula</td>
			<td style="width:147px;">Fischer Scientific</td>
			<td>21-401-5</td>
			<td>used to scoop out brain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Glass Microscope Slides</td>
			<td style="width:147px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:114px;">12-549-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:658px;">Immunohistochemical Reaction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">&#160;Triton X-100</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:114px;"></td>
			<td>Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Tween-20</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:114px;"></td>
			<td>Used as a small amount of detergent added to TBS&#160; to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Licor Odyssey scanner</td>
			<td style="width:147px;">Licor Biotechnology Inc.</td>
			<td style="width:114px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Image Studio</td>
			<td style="width:147px;">Licor Biotechnology Inc.</td>
			<td style="width:114px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using near-infrared fluorescence and high-resolution scanning to measure protein expression in the rodent brain

La neuroscienza è lo studio di come le cellule nel cervello mediare varie funzioni. Misurare l'espressione proteica nei neuroni e nella glia è fondamentale per lo studio delle neuroscienze poiché la funzione cellulare è determinata dalla composizione e dall'attività delle proteine cellulari. In questo articolo, descriviamo come l'immunocitochimica può essere combinata con la scansione ad alta risoluzione vicino infrarosso per fornire una misura semi-quantitativa di espressione proteica in regioni cerebrali distinte. Questa tecnica può essere utilizzata per un'espressione proteica singola o doppia nella stessa regione cerebrale. La misurazione delle proteine in questo modo può essere utilizzata per ottenere un cambiamento relativo nell'espressione proteica con una manipolazione sperimentale, la firma molecolare dell'apprendimento e della memoria, l'attività nei percorsi molecolari e l'attività neurale in diverse regioni cerebrali. Utilizzando le proteine corrette e l'analisi statistica, è possibile determinare anche la connettività funzionale tra le regioni cerebrali. Data la facilità di implementazione di immunocitochimica in un laboratorio, utilizzando l'immunocitochimica con scansione ad alta risoluzione vicino infrarosso può espandere la capacità del neuroscienziato per esaminare i processi neurobiologici a livello di sistemi.

Prima di utilizzare la scansione ad alta risoluzione per l'immunoistochimica, si dovrebbe verificare che il protocollo funzioni. Questo può essere realizzato utilizzando un saggio di validazione in cui le sezioni cerebrali dello stesso animale sono incubate con anticorpi primari e secondari, anticorpo secondario da solo, o nessun anticorpo primario o secondario. I risultati di tale saggio di convalida sono illustrati nella Figura 2. In questa reazione stavam...

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Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

Utilizzo della fluorescenza Near-Infrared e scansione ad alta risoluzione per misurare l'espressione proteica nel cervello del roditore

Qui, presentiamo un protocollo che utilizza coloranti Near-Infrared in combinazione con immunoistochimica e scansione ad alta risoluzione per analisi proteine nelle regioni cerebrali.

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...

Questo protocollo è significativo perché consente la quantificazione di due proteine nella stessa regione cerebrale. Questo permette allo sperimentatore di guardare l'attività nelle vie di segnalazione molecolare nelle regioni cerebrali saggiando pan e fosfoproteine. Può anche essere usato per saggiare proteine che sono marcatori di diversi fenomeni cognitivi.Stiamo usando una tecnica relativamente semplice, come l'immunoistochimica, per rispondere a domande che in genere richiedono tecniche più coinvolte. Compreso l'esame dell'attività delle vie di segnalazione molecolare, l'esame del rapporto AMPA/NMDA. Utilizzando un criostato mantenuto tra meno 9 gradi Celsius e meno 12 gradi Celsius, tagliare il cervello di ratto precedentemente isolato e congelato in regioni di interesse a 30-50 micrometri.Montare direttamente le fette su vetrini e conservare a meno 80 gradi Celsius fino all'immunocitochimica. Rimuovere i vetrini dal congelatore e consentire loro di equilibrare a temperatura ambiente per 30 minuti. Lavorando sotto una cappa aspirante, posizionare gli scivoli in paraformaldeide al 4% in PBS molare da una a due ore a temperatura ambiente per la fissazione dei tessuti.Quindi sciacquare le diapositive in 0,1 TBS molare tre volte per 10 minuti ciascuna. Per permeabilizzare le membrane cellulari, incubare le diapositive in un detergente delicato per 30-60 minuti. E risciacquare di nuovo in TBS tre volte per 15 minuti ciascuno.Diluire l'anticorpo primario per proteine di interesse per pbs nella corretta concentrazione come descritto nel manoscritto. Soluzione di anticorpi primari pipetta direttamente sul tessuto cerebrale. Posizionare gli scivolamenti di copertura sulle diapositive e incubare il tessuto cerebrale nella diluizione degli anticorpi primari per 1-2 ore a temperatura ambiente.Dopo l'incubazione, rimuovere le foglietti di copertura e lavare gli scivoli in TBS che ha una piccola quantità di detergente aggiunto, quattro volte per 15 minuti ciascuno. Diluire l'anticorpo secondario in un diluente contenente TBS, detergente e l'1,5% del siero ospite. Aggiungere anticorpi secondari alle diapositive, coprire con scivolamenti di copertura e incubare a temperatura ambiente per due ore.Dopo l'incubazione, sciacquare le diapositive in TBS-T quattro volte per 20 minuti ciascuna e quindi in TBS quattro volte per 20 minuti ciascuna. Asciugare gli scivoli a temperatura ambiente al buio, durante la notte. Posizionare le diapositive sull'interfaccia di scansione del vicino infrarosso con il tessuto rivolto verso il basso.Immagini più diapositive alla volta usando lo strumento di selezione. Immagini le diapositive utilizzando l'impostazione di altissima qualità con una risoluzione di 21 micrometri. In un offset di zero nanometri, importare immagini nel software di analisi delle immagini per visualizzare e contrassegnare per l'analisi semiquantitativa delle proteine.Dopo aver aperto il software di analisi delle immagini, selezionare l'area di lavoro in cui è stata digitalizzata l'immagine. Quindi apri l'immagine digitalizzata nel software di analisi delle immagini per visualizzare la scansione e regolare le lunghezze d'onda, il contrasto, la luminosità e l'ingrandimento mostrati senza alterare l'immagine grezza o l'emissione quantificata totale. Dopo aver identificato le aree chiave per la quantificazione, selezionare la scheda analisi nella parte superiore della pagina, quindi selezionare disegna rettangolo per disegnare un rettangolo sull'area che verrà quantificata.Per visualizzare le dimensioni del rettangolo, selezionare le forme in basso a sinistra dello schermo. Quindi selezionare le colonne in basso a destra. Aggiungere quindi colonne di altezza e larghezza per identificare le dimensioni della forma.Infine, denominare la forma e ripetere. Una volta campionare tutte le aree, procedere con la combinazione e l'analisi dei dati disponibili nella scheda colonne. Per verificare che questo protocollo funzioni, le sezioni cerebrali sono state incubate con anticorpi primari e secondari, solo anticorpi secondari o né anticorpi primari né secondari.L'espressione precoce del gene c-jun immediato è stata rilevata nell'ippocampo dorsale e nell'amigdala solo quando gli anticorpi primari e secondari sono stati applicati al tessuto cerebrale. La sotto-unità GluR1 del recettore AMPA e la sotto-unità NR2A del recettore NMDA sono state testate nel rilevamento delle proteine delle feci nei nuclei di amigdala. Ciò ha permesso di esaminare il rapporto dei recettori NMDA AMPA nei sotto-nuclei dell'amigdala che è una firma neurobiologica dell'apprendimento e della memoria.Misure media e normalizzate dell'espressione proteica sono state ottenute da scansioni ad alta risoluzione nell'ippocampo ventrale. Utilizzando il software di analisi delle immagini, un rettangolo viene posizionato nella regione di interesse e l'intensità media della luce dalla forma è stata utilizzata come misura dell'espressione del fluoroforo, che è una misura dell'espressione proteica. Per ottenere la curva normalizzata, una forma è stata posizionata attraverso una regione che esprime un segnale elevato e un segnale basso nell'area sotto la curva è stata utilizzata come misura dell'espressione proteica.La più grande lotta con questa procedura è trovare un anticorpo e assicurarsi che funzioni. L'applicazione è semplice. Il mio consiglio sarebbe quello di tentare prima una normale procedura immunoistochimica, poi provare questa tecnica.Eseguire sempre prima un test di convalida. La cosa più importante da ricordare è controllare la diluizione degli anticorpi e assicurarsi che sia applicata correttamente. Senza questi passaggi, la procedura fallirà.

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