Name: application of biolayer interferometry (bli) for studying protein-protein interactions in transcription
Uploaded: 2019-07-26T13:00:00
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Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (Grants - AI122034 et AI140167) et la New Jersey Health Foundation (Grant - PC 20-18).

1. Préparation des protéines
<ol><li>Utilisez un sac de dialyse (avec une taille de coupure appropriée) pour dialyser chaque protéine à utiliser pour les essais BLI (y compris le ligand his-marqué et l'analyte) contre 1 000 volumes du tampon BLI (25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 10 mM MgCl2 , 0,1 mM DTT, pH 8,0, pré-réfrigéré à 4 oC) à 4 oC pour 4 h. REMARQUE : Les essais BLI exigent que le ligand soit présent à des concentrations qui saturent les sites de liaison sur le biocapteur ...

<ol>
	<li>Vvedenskaya, I. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+RNA+polymerase+and+the+core+recognition+element+are+a+determinant+of+transcription+start+site+selection.">Interactions between RNA polymerase and the core recognition element are a determinant of transcription start site selection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 113 (21), E2899-E2905 (2016).</li><li>Feklistov, A., Sharon, B. D., Darst, S. A., Gross, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+sigma+factors:+a+historical,+structural,+and+genomic+perspective.">Bacterial sigma factors: a historical, structural, and genomic perspective.</a> Annual Review of Microbiology. 68, 357-376 (2014).</li><li>Visweswariah, S. S., Busby, S. 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W., Krone, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+surface+plasmon+resonance+biomolecular+interaction+analysis+mass+spectrometry+(BIA/MS).">Advances in surface plasmon resonance biomolecular interaction analysis mass spectrometry (BIA/MS).</a> Journal of Molecular Recognition. 12 (2), 77-93 (1999).</li><li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+biosensor+platforms+in+the+evaluation+of+high+affinity+antibody-antigen+binding+kinetics.">Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics.</a> Analytical Biochemistry. 508, 78-96 (2016).</li><li>Visentin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+non-specific+binding+to+measure+the+active+concentration+and+kinetics+of+serum+anti-HLA+antibodies+by+surface+plasmon+resonance.">Overcoming non-specific binding to measure the active concentration and kinetics of serum anti-HLA antibodies by surface plasmon resonance.</a> Biosensors and Bioelectronics. 117, 191-200 (2018).</li><li>Baba, A., Taranekar, P., Ponnapati, R. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Surface+Plasmon+Resonance+Sensors:+From+Principles+to+Point-of-Care+Applications.">Microfluidic Surface Plasmon Resonance Sensors: From Principles to Point-of-Care Applications.</a> Sensors (Basel, Switzerland). 16 (8), 1175 (2016).</li><li>Shah, N. B., Duncan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-layer+interferometry+for+measuring+kinetics+of+protein-protein+interactions+and+allosteric+ligand+effects.">Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (84), e51383 (2014).</li><li>Wartchow, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensor-based+small+molecule+fragment+screening+with+biolayer+interferometry.">Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 25 (7), 669-676 (2011).</li></ol>

Les interactions protéines-protéines sont cruciales pour la régulation de la transcription et d'autres processus biologiques. Ils sont le plus souvent étudiés par des essais de retrait. Bien que les essais de retrait soient relativement faciles à effectuer, ils sont peu quantitatifs et peuvent ne pas détecter les interactions faibles mais biologiquement significatives. En comparaison, en détectant l'association et la dissociation en temps réel entre un ligand et un analyte, BLI fournit des constantes de taux d'a...

La transcription, qui produit des molécules d'ARN en utilisant l'ADN comme modèle, est la toute première étape de l'expression des gènes. La synthèse bactérienne de l'ARN commence après la liaison de l'holoenzyme de polymérase d'ARN (RNAP) à un promoteur cible1,2. L'holoenzyme RNAP (RNAPholo) est composé d'un noyau catalytique multi-subunit (RNAPcore) et d'un facteur de ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' Les activateurs et répresseurs de transcription, collectivement appelés TFs, règlent l'expression de gène par les composants de liaison du RNAPcore, des facteurs de ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' Selon l'organisme, une partie importante de son génome peut être consacrée aux TF qui régulent la transcription en réponse aux besoins physiologiques et aux indices environnementaux3.
La chlamydia est une bactérie intracellulaire obligatoire responsable d'une variété de maladies chez les humains et les animaux4,5,6,7,8. Par exemple, Chlamydia trachomatis est sans doute le principal agent pathogène transmis sexuellement chez l'homme dans le monde entier, et l'une des principales causes de cécité dans certains pays sous-développés4,5. La chlamydia a un cycle de développement unique caractérisé par deux formes cellulaires alternées appelées le corps élémentaire (EB) et le corps réticulé (RB)9. Alors que les EB sont capables de survivre dans un environnement extracellulaire, ils sont incapables de prolifération. Les EB pénètrent dans les cellules hôtes par endocytose et se différencient en rBs plus grands dans un vacuole dans le cytoplasme hôte dans les heures suivant l'inoculation. N'infectieux plus, les RB prolifèrent par fission binaire. Autour de 20 h, ils commencent à se différencier de nouveau aux EB, qui sortent des cellules d'hôte autour de 30-70 h.
La progression du cycle de développement chlamydiale est réglée par transcription. Alors qu'une supermajorité des près de 1 000 gènes chlamydiales s'expriment au cours du cycle intermédiaire au cours duquel les RB se reproduisent activement, seul un petit nombre de gènes sont transcrits immédiatement après l'entrée des EB dans les cellules hôtes pour initier la conversion de Les EB dans les RB, et un autre petit ensemble de gènes sont transcrits ou de plus en plus transcrits pour permettre la différenciation des RB en IS10,11.
Le génome chlamydial code trois facteurs, à savoir66,28 et54. 66, ce qui équivaut à l'entretien ménager de70 de E. coli et d'autres bactéries, est responsable de la reconnaissance des promoteurs des gènes du début et du milieu du cycle ainsi que de certains gènes en retard, alors que28 et54 sont nécessaires pour la transcription de certains gènes tardifs. Plusieurs gènes sont connus pour porter à la fois un promoteur de66-dépendants et un promoteur de28-dépendants12.
Malgré un cycle de développement compliqué, seul un petit nombre de TF ont été trouvés dans le chlamydiae13. GrgA (précédemment annoté comme une protéine hypothétique CT504 dans C. trachomatis serovar D et CTL0766 dans C. trachomatis L2) est une Chlamydia-spécifique TF initialement reconnu comme un activateur de66gènes dépendants14. Les essais d'affinité ont démontré que GrgA active leur transcription en liant à la fois l'ADN66 et l'ADN. Fait intéressant, il a été trouvé plus tard avec que GrgA co-précipite également avec28, et active la transcription à partir de28-promoteurs dépendants in vitro15. Pour déterminer si GrgA a des affinités similaires ou différentes pour66 et28euros, nous avons eu recours à bli. Les essais DE BLI ont montré que GrgA interagit avec66 à une affinité 30 fois plus élevée qu'avec28, suggérant que GrgA peut jouer des rôles différentiels dans la transcription de'66-dépendant et '28 -transcription dépendante 15.
BLI détecte le modèle d'interférence de la lumière blanche qui se reflète à partir d'une couche de protéine immobilisée à l'extrémité d'un biocapteur et la compare à celle d'une couche de référence interne16. Grâce à l'analyse de ces deux modèles d'interférence, BLI peut fournir des informations précieuses et en temps réel sur la quantité de protéines liées à la pointe du biocapteur. La protéine immobilisée à l'extrémité du biocapteur est appelée ligand, et est généralement immobilisée à l'aide d'un anticorps ou d'une étiquette épitope commune (p. ex., un poly-his- ou biotine-tag) qui a une affinité pour une particule associée (comme ntA ou Streptavidin) sur la pointe du biocapteur. La liaison d'une protéine secondaire, appelée analyte, avec le ligand à l'extrémité du biocapteur crée des changements dans l'opacité du biocapteur et entraîne donc des changements dans les modèles d'interférence. Lorsqu'il est répété sur différentes concentrations de l'analyte, BLI peut fournir non seulement des informations qualitatives mais aussi quantitatives sur l'affinité entre le ligand et l'analyte16.
Au meilleur de notre connaissance, nous avons été les premiers à employer BLI pour caractériser les interactions protéine-protéine dans la transcription15. Dans cette publication, nous démontrons qu'un fragment de GrgA, qui était auparavant démontré comme étant nécessaire pour28-contraignant, en effet médiatise la liaison. Ce manuscrit se concentre sur les étapes des essais BLI, et la génération de graphiques BLI et les paramètres de la cinétique de liaison. Les méthodes de production (et de purification) de ligands et d'analytes ne sont pas couvertes ici.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BLItz machine</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>45-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing cellulose membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D9652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dip and Read Ni-NTA biosensor tray</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18-5101</td>
			<td>Ready-to-use Ni-NTA biosensors for poly-His-tagged Proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drop holder</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>45-5004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes (0.2 mL)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>CLS6571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (black)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>03-391-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>T095100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of biolayer interferometry (bli) for studying protein-protein interactions in transcription

Un facteur de transcription (TF) est une protéine qui régule l'expression des gènes en interagissant avec la polymérase d'ARN, un autre TF, et/ou l'ADN de modèle. GrgA est un nouvel activateur de transcription trouvé spécifiquement dans l'agent pathogène bactérien intracellulaire obligatoire Chlamydia. Les essais de retrait de protéines utilisant des perles d'affinité ont révélé que GrgA lie deux facteurs de ', à savoir'66 et'28, qui reconnaissent différents ensembles de promoteurs pour les gènes dont les produits sont différemment requis aux stades de développement. Nous avons utilisé BLI pour confirmer et caractériser davantage les interactions. BLI démontre plusieurs avantages par rapport au retrait : 1) Il révèle l'association et la dissociation en temps réel entre les partenaires liants, 2) Il génère des paramètres cinétiques quantitatifs, et 3) Il peut détecter les liaisons que les essais de retrait ne détectent souvent pas. Ces caractéristiques nous ont permis de déduire les rôles physiologiques de GrgA dans la régulation de l'expression génique en Chlamydia, et les mécanismes d'interaction détaillés possibles. Nous envisageons que cette technologie relativement abordable peut être extrêmement utile pour étudier la transcription et d'autres processus biologiques.

Grâce à des essais BLI, nous avons déjà établi que la liaison de GrgA à28 dépend d'une région moyenne de 28 acides aminés (résidus 138-165) de GrgA15. En conséquence, par rapport à N-terminally Sa pleine longueur GrgA (NH-GrgA), une construction de suppression GrgA manquant de cette région (NH-GrgA-138-165) avait un taux d'association diminué et un taux de dissociation accrue, conduisant à une perte de 3 millions de fois affinité (tableau 1). Ici, nous d...

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Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Les interactions des facteurs de transcription (TF) avec la polymérase d'ARN sont habituellement étudiées utilisant des essais de retrait. Nous appliquons une technologie d'interférométrie biocouche (BLI) pour caractériser l'interaction de GrgA avec la polymérase d'ARN chlamydial. Par rapport aux essais de retrait, BLI détecte l'association et la dissociation en temps réel, offre une sensibilité plus élevée et est très quantitatif.

Application de biocouches interferométrie (BLI) pour étudier les interactions protéines-protéines dans la transcription

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

L’interaction protéine-protéine dans la transcription a été traditionnellement étudiée à l’aide de la dialyse por. Cependant, la dialyse por est purement quantitative. Nous utilisons l’interférométrie biocouche, ou BLI, pour surmonter ce problème.Par rapport à Por dan, BLI détecte l’association en temps réel et la dissociation entre partenaires de liaison. Il génère également des paramètres cinétiques quantitatifs, qui sont indicatifs des mécanismes d’interaction. La technologie BLI peut sembler intimidante, mais il n’est pas difficile d’apprendre À utiliser cette technologie, il faut avoir accès à un instrument BLI et au logiciel associé.Cette vidéo vous permettra de vous adapter facilement à la technologie BLI. Environ 10 minutes avant le début d’un essai, pipette 200 microlitres du tampon BLI dans un tube PCR. Retirez un biocapteur NTA nickel de l’emballage d’origine en tenant la grande partie du biocapteur à l’aide d’une main gantée.Placez le biocapteur sur le tube PCR de telle sorte que seule la pointe en verre du biocapteur soit immergée dans le tampon BLI. Gardez la pointe du biocapteur immergée pendant au moins 10 minutes pour assurer une hydratation complète. Allumez la machine Blitz.Assurez-vous que la machine est connectée à l’ordinateur via un port de sortie de données USB à l’arrière de la machine. Sur l’ordinateur, ouvrez le logiciel associé et cliquez sur Advanced Kinetics sur le côté gauche de l’écran. Dans le logiciel, tapez toutes les informations appropriées sur l’expérience sous chaque rubrique respective.Cliquez sur Biosensor Type et choisissez Nickel NTA dans le menu dropdown. La durée de chaque étape peut être modifiée par défaut au besoin. Pour des résultats optimaux, utilisez un minimum de 30 secondes pour la ligne de base initiale et la ligne de base et 120 secondes pour l’association et la dissociation.Retirez le biocapteur NTA de nickel hydraté du tube PCR et fixez-le sur la monture du biocapteur sur la machine en glissant la grande partie du biocapteur sur la monture. Placez un tube de microcentrifugeuse noire de 0,5 millilitre dans le support de tube de la machine et pipette 400 microlitres de tampon BLI en elle. Fermez le couvercle de la machine de telle sorte que la pointe du biocapteur soit immergée dans le tampon dans le tube de microcentrifugeuse.Cliquez ensuite sur le logiciel pour commencer à enregistrer la ligne de base initiale. Une fois l’étape de base initiale terminée, ouvrez la couverture de la machine. Déplacez le curseur vers la droite, de sorte que le porte-gouttes est situé devant la flèche noire.Pipette quatre microlitres d’un ligand dialysé son marqué sur le porte-gouttes et fermer le couvercle de la machine, qui va automatiquement commencer à enregistrer l’étape de chargement. Une fois l’étape de chargement terminée, ouvrez le couvercle de la machine. Déplacez le curseur vers la gauche, de sorte que le support du tube est une fois de plus situé en face de la flèche noire.Fermez le couvercle de la machine et assurez-vous que la pointe du biocapteur est immergée dans le tampon BLI du tube dans le support du tube. La machine et le logiciel commenceront automatiquement à enregistrer l’étape de base. Une fois l’étape de base terminée, ouvrez le couvercle de la machine.Retirez le porte-gouttes et nettoyez-le en arrosant n’importe quelle protéine et rincez-la avec de l’eau doublement déionisée pour un total de cinq fois. Utilisez un lingette de tissu pour nettoyer la surface du porte-gouttes après le dernier lavage. Replacez le porte-gouttes sur la machine.Déplacez le curseur sur la machine vers la droite, de sorte que le porte-chute est une fois de plus situé en face de la flèche noire. Pipette quatre microlitres d’un analyte dialysé sur le porte-gouttes et fermer le couvercle de la machine, qui va automatiquement commencer à enregistrer l’étape de l’association. Une fois l’étape de l’association terminée, ouvrez la couverture de la machine.Déplacez le curseur sur la machine vers la droite, de sorte que le support du tube est une fois de plus situé en face de la flèche noire et fermer le couvercle de la machine, qui va automatiquement commencer à enregistrer l’étape de dissociation. Une fois l’étape de dissociation terminée, ouvrez le couvercle de la machine et retirez le porte-gouttes et le support du tube. Rincer soigneusement les deux à l’eau double déionisée pour laver toute protéine.Retirez le biocapteur et jetez-le en toute sécurité. Répétez ces étapes pour la même paire d’analyte ligand en utilisant différentes concentrations d’analyte. Une fois toutes les courses terminées, enregistrez les données sur le logiciel en cliquant sur Fichier et Enregistrer l’expérience comme sur le côté gauche de l’écran.Sous le titre Exécuter les données, sélectionnez Correction d’étape et ajustement un à un et cliquez sur Analyser pour générer des données cinétiques. Pour extraire les données quantitatives dans une feuille de travail et générer des graphiques, cliquez sur Export to CSV et enregistrez les données enregistrées sous forme de fichier CSV. Ouvrez le fichier CSV à l’aide d’un logiciel de feuille de calcul.GrgA pleine longueur est faite de 288 acides aminés. Comme indiqué ici, une région moyenne de 28 acides aminés lie Sigma 28 directement. Ici, la région moyenne marquée avec un terminal final His-tag a été utilisé comme ligand, qui a d’abord été immobilisé à la pointe d’un biocapteur nickel NTA.Les enregistrements d’expériences avec trois concentrations différentes d’analyte commençant chacun 30 secondes avant la liaison ligand et se terminant deux minutes après le début du dernier lavage sont montrés. La visualisation améliorée de l’association et de la dissociation d’analyte de ligand est montrée après suppression des valeurs dans les deux premières étapes et réinitialisation de la ligne de base. Après le lavage non lié et terminal His-marqué GrgA 138 à 165 hors du biocapteur, l’association en temps réel avec l’analyte a été enregistrée suite à l’ajout de Sigma 28.Enfin, la dissociation en temps réel a été enregistrée après le lavage. Avant les analyses BLI, le glycérol est retiré des ligands et des analytes. Nous recommandons que BLI soit effectué peu de temps après la dialyse comme discuté dans le texte.Après avoir caractérisé les interactions protéine-protéine dans la transcription avec BLI, on peut étudier comment l’interaction affecte l’initiation de transcription, l’allongement, et ou la terminaison.

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