Name: generation of induced neural stem cells from peripheral mononuclear cells and differentiation toward dopaminergic neuron precursors for transplantation studies
Uploaded: 2019-07-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studie

이 사업은 줄기세포 및 번역 국가핵심프로젝트(2016YFA0101403), 중국국립자연과학재단(81661130160, 81422014, 81561138004), 베이징시 자연과학재단(5142005), 베이징 인재재단(2017000021223TD03), 제13차 5개년 계획(CIT 및 TCD20180333), 베이징 의료시스템 고급인재상(2015-3-063), 베이징시 립대학 고위교사 지원사업 시 보건위원회 기금(PXM 2018_026283_000002), 베이징 백, 천, 만 인재 기금 (2018A03), 베이징 시 립 행정 특별 기금 지원 (ZYLX201706), 및 로얄 소사이어티-뉴턴 고급 펠로우십 (NA150482).

모든 절차는 제도적 인간연구윤리위원회의 지침을 따라야 한다. 통보된 동의는 혈액 수집 전에 환자 또는 건강한 지원자로부터 얻어야 합니다. 이 프로토콜은 기관의 인간 연구 윤리위원회의 승인을 받았으며 동물의 관리 및 사용에 대한 기관의 지침에 따라 수행되었습니다.
1. PBMC의 수집, 격리 및 확장
<ol><li>PBMC의 컬렉션
	<ol>
<li>헤파린 방부제 바이알을 사용?...

<ol>
	<li>Williams-Gray, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+cognitive+syndromes+of+Parkinson's+disease:+5+year+follow-up+of+the+CamPaIGN+cohort.">The distinct cognitive syndromes of Parkinson's disease: 5 year follow-up of the CamPaIGN cohort.</a> Brain. 132, 2958-2969 (2009).</li><li>Dexter, D. T., Jenner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson+disease:+from+pathology+to+molecular+disease+mechanisms.">Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms.</a> Free Radical Biology and Medicine. 62, 132-144 (2013).</li><li>Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Therapy+for+Parkinson's+Disease:+New+Hope+from+Reprogramming+Technologies.">Cell Therapy for Parkinson's Disease: New Hope from Reprogramming Technologies.</a> Aging and Disease. 6 (6), 499-503 (2015).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Mouse+Embryonic+and+Adult+Fibroblast+Cultures+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Doi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+dopaminergic+progenitors+by+cell+sorting+for+successful+transplantation.">Isolation of human induced pluripotent stem cell-derived dopaminergic progenitors by cell sorting for successful transplantation.</a> Stem Cell Reports. 2 (3), 337-350 (2014).</li><li>Kriks, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+neurons+derived+from+human+ES+cells+efficiently+engraft+in+animal+models+of+Parkinson's+disease.">Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease.</a> Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).</li><li>Perrier, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+midbrain+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12543-12548 (2004).</li><li>Kikuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPS+cell-derived+dopaminergic+neurons+function+in+a+primate+Parkinson's+disease+model.">Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model.</a> Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).</li><li>Ma, T., Xie, M., Laurent, T., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+the+reprogramming+of+somatic+cells.">Progress in the reprogramming of somatic cells.</a> Circulation Research. 112 (3), 562-574 (2013).</li><li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+adult+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+into+induced+neural+stem+cell+by+using+episomal+vectors.">Conversion of adult human peripheral blood mononuclear cells into induced neural stem cell by using episomal vectors.</a> Stem Cell Research. 16 (2), 236-242 (2016).</li><li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+precursors+differentiated+from+human+blood-derived+induced+neural+stem+cells+improve+symptoms+of+a+mouse+Parkinson's+disease+model.">Dopaminergic precursors differentiated from human blood-derived induced neural stem cells improve symptoms of a mouse Parkinson's disease model.</a> Theranostics. 8 (17), 4679-4694 (2018).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Fibroblasts+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes.">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).</li><li>Thier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+fibroblasts+into+stably+expandable+neural+stem+cells.">Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).</li><li>Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures.">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).</li><li>Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+a+small+amount+of+human+peripheral+blood+using+a+combination+of+activated+T+cells+and+Sendai+virus.">Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus.</a> Nature Protocols. 7 (4), 718-728 (2012).</li><li>Bazley, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Reprogramming+of+Human+Primordial+Germ+Cells+into+Induced+Pluripotent+Stem+Cells:+Efficient+Generation+of+Genetically+Engineered+Germ+Cells.">Direct Reprogramming of Human Primordial Germ Cells into Induced Pluripotent Stem Cells: Efficient Generation of Genetically Engineered Germ Cells.</a> Stem Cells and Development. 24 (22), 2634-2648 (2015).</li><li>Li, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytoplasmic+RNA+vector+derived+from+nontransmissible+Sendai+virus+with+efficient+gene+transfer+and+expression.">A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression.</a> Journal of Virology. 74 (14), 6564-6569 (2000).</li><li>Sochacki, J., Devalle, S., Reis, M., Mattos, P., Rehen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+urine+iPS+cell+lines+from+patients+with+Attention+Deficit+Hyperactivity+Disorder+(ADHD)+using+a+non-integrative+method.">Generation of urine iPS cell lines from patients with Attention Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD) using a non-integrative method.</a> Stem Cell Research. 17 (1), 102-106 (2016).</li><li>Ban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+(iPSCs)+by+temperature-sensitive+Sendai+virus+vectors.">Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14234-14239 (2011).</li><li>Cho, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+and+large-scale+generation+of+functional+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (9), 3392-3397 (2008).</li><li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. -. K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression.">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nature Protocols. 7 (11), 2013-2021 (2012).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+primary+somatic+cells+by+OCT4+and+chemical+compounds.">Reprogramming of human primary somatic cells by OCT4 and chemical compounds.</a> Cell Stem Cell. 7 (6), 651-655 (2010).</li><li>Ono, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+neurogenic+potential+in+floor+plate+cells+along+an+anteroposterior+location:+midbrain+dopaminergic+neurons+originate+from+mesencephalic+floor+plate+cells.">Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells.</a> Development. 134 (17), 3213-3225 (2007).</li><li>Kirkeby, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+regionally+specified+neural+progenitors+and+functional+neurons+from+human+embryonic+stem+cells+under+defined+conditions.">Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions.</a> Cell Reports. 1 (6), 703-714 (2012).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling.">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li><li>Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+derivation+of+functional+floor+plate+tissue+from+human+embryonic+stem+cells.">Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 6 (4), 336-347 (2010).</li><li>Harvey, B. K., Wang, Y., Hoffer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+rodent+models+of+Parkinson's+disease.">Transgenic rodent models of Parkinson's disease.</a> Acta Neurochirurgica Supplements. 101, 89-92 (2008).</li><li>Sheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+dopaminergic+neurons+directly+from+mouse+fibroblasts+and+fibroblast-derived+neural+progenitors.">Generation of dopaminergic neurons directly from mouse fibroblasts and fibroblast-derived neural progenitors.</a> Cell Research. 22 (4), 769-772 (2012).</li><li>Prasad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+induced+pluripotent+stem+cell,+direct+conversion+by+trans-differentiation,+direct+reprogramming+and+oligodendrocyte+differentiation.">A review of induced pluripotent stem cell, direct conversion by trans-differentiation, direct reprogramming and oligodendrocyte differentiation.</a> Regenerative Medicine. 11 (2), 181-191 (2016).</li></ol>

여기에서 우리는 PD 모형을 위한 iNSC-DA 세포 치료의 다른 단계를 포함하는 프로토콜을 제출했습니다. 이 프로토콜의 중요한 양상은 다음과 같습니다: (1) SEV 감염에 의한 PBMC의 분리 및 확장 및 INCCs로의 재프로그래밍, (2) DA 뉴런에 대한 iNCCs의 분화, (3) 일방적인 6-OHDA 병변 PD 마우스 모델 및 행동 평가, (4) DA 전구체 및 행동 평가의 세포 이식.
이 프로토콜에서 첫 번째 부분은 우?...

파킨슨 병 (PD)은 복부 메센셀론 (VM)에서 실질적인 니그라 파스 콤팩트 (SNpc)에서 도파민성 (DA) 뉴런의 퇴화로 인한 일반적인 신경 퇴행성 질환으로, 60 세 이상의 인구에서 1 % 이상의 유병률을 가지고 있습니다. 1개 , 2. 지난 10 년 동안 퇴행성 또는 손상된 세포를 대체하거나 퇴행성 뉴런 주변의 미세 환경을 영양화하기위한 세포치료는 PD 3의 치료에 잠재력을 보여주었습니다. 한편, 리프로그래밍 기술은 대체요법을 위한 유망한 세포 공급원을 제공하는 4. 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSCs) 및 배아 줄기 세포(ESCs)는 쥐및 비인간 영장류 PD 모델로 이식할 때 생존, 교화 및 모터 기능을 개선할 수 있는 DA 신경 세포로 분화할 수 있는 것으로 입증되었습니다5 ,6,7,8. iPSCs는 세포 재프로그래밍 기술의 이정표를 나타내며 세포 이식에 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 그러나, 불완전하게 분화된 세포에서 종양 대형의 리스크에 관하여 아직도 우려가 있습니다. 세포 이식을 위한 대체 세포 공급원은 불안정한 중간체에서 파생될 수 있는 유도된 신경 줄기 세포 (iNSCs)와 같은 직접적인 재프로그래밍을 통해 얻은 혈통-커밋된 성인 줄기 세포, 다능성을 우회하는 것입니다 단계9,10,11.
iPSCs와 iNSCs는 섬유아세포, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMcCs) 및 다양한 다른 유형의 세포12,13,14와같은 자가 세포 공급원에서 다시 프로그래밍 할 수 있으므로 이식 된 세포의 면역 원성은 큰 정도입니다. 더욱이, iPSCs에 비해, iNSCs는 종양 형성 및 계보 커밋된 가소성의 감소된 리스크에 내재되어 있으며, 단지 뉴런과 글리아11로분화할 수 있다. 초기 연구에서, 인간 또는 마우스 iPSCs 및 iNSCs는 피부 생검으로부터 얻은 섬유아세포로부터 생성되었고, 이는 침습적 절차14,15이다. 이와 관련하여, PBMCCS는 덜 침습적 샘플링 과정때문에 매력적인 스타터 셀 소스이며, 확장 시간16의짧은 기간 내에 많은 수의 세포를 얻을 수 있다. 초기 리프로그래밍 연구는 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터와 같은 통합 전달 시스템을 사용했으며, 이는 많은유형의 세포에서 효율적이고 구현하기 쉬운 17; 그러나, 이들 전달 시스템은 잔류 트랜스유전자의 돌연변이 및 재활성화를 유발할 수 있으며, 이는 임상 치료 목적으로 안전성 문제를 제시한다12. 센다이 바이러스(SeV)는 숙주 게놈에 통합되지 않고 감염된 세포의 세포질에서만 복제되는 부정적인 감각의 단일 가닥 게놈을 가진 비통합 RNA 바이러스로, 18을 다시 프로그래밍하기 위한 효율적이고 안전한 차량을 제공합니다. ,19. 재조합 SeV 벡터는 그들의 개방 판독 프레임에서 인간 OCT3/4, SOX2, KLF4 및 c-MYC를 포함하는 재프로그래밍 인자를 포함하는 것을 사용할 수 있다. 또한, SeV 바이러스 벡터는 온도에 민감한 돌연변이를 도입함으로써 더욱 개선될 수 있으며, 배양 온도가 20°C로 상승될 때 이를 빠르게 제거할 수 있다. 이 문서에서는 SeV 시스템을 사용하여 PBMC를 iNSC로 다시 프로그래밍하는 프로토콜을 설명합니다.
많은 연구는 다양한 방법을 사용하여 인간 ESCs 또는 iPSCs에서 DA 뉴런의 유도를보고했다6,8,21. 그러나, 세부 사항에 iNSC에서 DA 뉴런의 분화를 설명 하는 프로토콜의 부족. 이 프로토콜에서는 2단계 방법을 사용하여 iNSC에서 DA 뉴런의 효율적인 생성을 설명합니다. DA 뉴런 전구체는 안전성 및 효능 평가를 위해 PD 마우스 모델의 줄무늬로 이식될 수 있다. 본 기사는 센다이 바이러스에 의한 유도 신경 줄기 세포의 생성, DA 뉴런으로의 iNSC 분화, 마우스 PD 모델 의 확립, DA 전구체의 이식에 이르기까지 다양한 단계를 포괄하는 상세한 프로토콜을 제시합니다. PD 모델의. 이 프로토콜을 사용하여 환자와 건강한 기증자로부터 iNSC를 생성하고 세포 이식 목적으로 안전하고 표준화 가능하며 확장 가능하며 균질한 DA 뉴런을 도출하거나 접시에서 PD를 모델링하고 메커니즘을 조사할 수 있습니다. 근본적인 질병 개시 및 발달.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:828px;" width="827">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">15-ml conical tube</td>
			<td style="width:183px;">Corning</td>
			<td style="width:153px;">430052</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">1-Thioglycerol</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">M6145</td>
			<td>Toxic for inhalation and skin contact</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">24-well plate</td>
			<td style="width:183px;">Corning</td>
			<td style="width:153px;">3337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">50-ml conical tube&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Corning</td>
			<td style="width:153px;">430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">6-OHDA</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">H4381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">6-well plate</td>
			<td style="width:183px;">Corning</td>
			<td style="width:153px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Accutase</td>
			<td style="width:183px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">A11105-01</td>
			<td>Cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Apomorphine</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">A4393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">A92902</td>
			<td>Toxic with skin contact&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">B27 supplement&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">BDNF</td>
			<td style="width:183px;">Peprotech</td>
			<td style="width:153px;">450-02</td>
			<td>Brain derived neurotrophic factor</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:277px;">Blood collection tubes containing sodium heparin</td>
			<td style="width:183px;">BD</td>
			<td style="width:153px;">367871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">BSA</td>
			<td style="width:183px;">yisheng</td>
			<td style="width:153px;">36106es60</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">cAMP</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">D0627</td>
			<td>Dibutyryladenosine cyclic monophosphate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">CellBanker 2</td>
			<td style="width:183px;">ZENOAQ</td>
			<td style="width:153px;">100ml</td>
			<td>Used as freezing medium for PBMNCs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Chemically defined lipid concentrate</td>
			<td style="width:183px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">11905031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">CHIR99021</td>
			<td style="width:183px;">Gene Operation</td>
			<td style="width:153px;">04-0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Coverslip</td>
			<td style="width:183px;">Fisher</td>
			<td style="width:153px;">25*25-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">DAPI</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">D8417-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">DAPT</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">D5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">D2915-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">DMEM-F12</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:153px;">11330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">DMEM-F12</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:153px;">11320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Donkey serum</td>
			<td style="width:183px;">Jackson</td>
			<td style="width:153px;">017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">EPO</td>
			<td style="width:183px;">Peprotech</td>
			<td style="width:153px;">100-64-50UG</td>
			<td>Human Erythropoietin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">FGF8b</td>
			<td style="width:183px;">Peprotech</td>
			<td style="width:153px;">100-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Ficoll-Paque Premium</td>
			<td style="width:183px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:153px;">17-5442-02</td>
			<td>P=1.077, density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">GDNF</td>
			<td style="width:183px;">Peprotech</td>
			<td style="width:153px;">450-10</td>
			<td>Glial derived neurotrophic factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">GlutaMAX</td>
			<td style="width:183px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">21051024</td>
			<td>100 &#215; Glutamine stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Ham&#39;s-F12</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:153px;">11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">HBSS</td>
			<td style="width:183px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">14175079</td>
			<td>Balanced salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Human leukemia inhibitory factor</td>
			<td style="width:183px;">Millpore</td>
			<td style="width:153px;">LIF1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Human recombinant SCF</td>
			<td style="width:183px;">Peprotech</td>
			<td style="width:153px;">300-07-100UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">IGF-1</td>
			<td style="width:183px;">Peprotech</td>
			<td style="width:153px;">100-11-100UG</td>
			<td>Human insulin-like growth factor&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">IL-3</td>
			<td style="width:183px;">Peprotech</td>
			<td style="width:153px;">200-03-10UG</td>
			<td>Human interleukin 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">IMDM</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:153px;">215056-023</td>
			<td>Iscove&#39;s modified Dulbecco&#39;s medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Insulin</td>
			<td style="width:183px;">Roche&#160;</td>
			<td style="width:153px;">12585014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">ITS-X</td>
			<td style="width:183px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">51500-056</td>
			<td>Insulin-transferrin-selenium-X supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Knockout serum replacement</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:153px;">10828028</td>
			<td>Serum free basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Laminin</td>
			<td style="width:183px;">Roche&#160;</td>
			<td style="width:153px;">11243217001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Microsyringe</td>
			<td style="width:183px;">Hamilton</td>
			<td style="width:153px;">7653-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">N2 supplement&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">NEAA</td>
			<td style="width:183px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">11140050</td>
			<td>Non-essential amino acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Neurobasal</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:153px;">10888</td>
			<td>Basic medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">PDL</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">P7280</td>
			<td>Poly-D-lysine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">SAG1</td>
			<td style="width:183px;">Enzo</td>
			<td style="width:153px;">ALX-270-426-M01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">SB431542</td>
			<td style="width:183px;">Gene Operation</td>
			<td style="width:153px;">04-0010-10mg</td>
			<td>Store from light at -20&#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Sendai virus</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:153px;">MAN0009378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Sucrose</td>
			<td style="width:183px;">baiaoshengke</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">TGF&#946;&#8546;</td>
			<td style="width:183px;">Peprotech</td>
			<td style="width:153px;">100-36E</td>
			<td>Transforming growth factor&#160; &#946;&#8546;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Transferrin</td>
			<td style="width:183px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:153px;">2914-HT-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Triton X 100</td>
			<td style="width:183px;">baiaoshengke</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td>Nonionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:153px;">T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Xylazine</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">X1126</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of induced neural stem cells from peripheral mononuclear cells and differentiation toward dopaminergic neuron precursors for transplantation studies

파킨슨병(PD)은 복부 메센팔론(VM)에서 실질적인 니그라 파스 콤팩트카(SNpc)에서 도파민성(DA) 뉴런의 변성에 의해 유발된다. 세포 대체 요법은 PD의 치료에 대한 큰 약속을 보유하고 있습니다. 최근, 유도 신경 줄기 세포 (iNSCs)는 종양 형성의 감소 위험과 가소성으로 인해 세포 대체 요법의 잠재적 인 후보로 부상했다. 지역별 뉴런및 신경교세포. iNSCs는 섬유아세포, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMNCs) 및 세포의 각종 그밖 모형과 같은 자가 체세포 근원에서 재프로그래밍될 수 있습니다. 체세포의 다른 유형과 비교하여, PBMCMC는 배양에서 접근하고 확장하기 쉽기 때문에 매력적인 스타터 세포 유형입니다. 센다이 바이러스(SeV)는 RNA 비통합 바이러스로, 인간 OCT3/4, SOX2, KLF4 및 c-MYC를 포함한 재프로그래밍 인자를 인코딩하여, 통합되지 않는 부정적인 감각, 단일 가닥, 비분별 게놈을 가지고 있습니다. 호스트 게놈, 그러나 감염된 세포의 세포질에서만 복제, 재프로그래밍을 위한 효율적이고 안전한 차량을 제안하. 이 연구에서는, 우리는 iNSC가 PBMNCs를 다시 프로그래밍하여 얻어지고, 2단계 방법에 의해 전문화된 VM DA 뉴런으로 분화되는 프로토콜을 기술한다. 이어서 DA 전구체는 PD의 치료에 대한 안전성 및 효능을 평가하기 위해 일방적으로 6-히록시도파민(6-OHDA) 병변형 PD 마우스 모델로 이식된다. 이 방법은 생체외 및 생체 내에서 환자 특이적 DA 신경 세포의 기능 및 치료 효과를 조사하는 플랫폼을 제공한다.

여기에서, 우리는 PD 모형을 취급하기 위하여 iNSC-DA 세포 치료의 다른 단계를 포함하는 프로토콜을 보고합니다. 첫째, PBMC는 분리되고 확장되었고, SeV 감염에 의해 iNSC로 다시 프로그래밍하였다. PBMNC 확장 및 iNSC 유도를 가진 절차의 개략적 표현은 그림1에 나와 있습니다. 14일째에, PBMMC는 밀도 그라데이션 배지(재료표)를 이용하여 단리되었다. 원심분리 전에, PBS?...

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Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies

말초 단핵 세포에서 유도 된 신경 줄기 세포의 생성 및 이식 연구에 대 한 도파민성 신경 전구체로 분화

이 프로토콜은 센다이 바이러스 감염에 의해 신경 줄기 세포를 유도하는 말초 혈액 단핵 세포의 재프로그래밍을 제시, 도파민성 뉴런으로 iNC의 분화, 일방적으로 병변에 DA 전구체의 이식 파킨슨병 마우스 모델, PD 치료를 위한 iNSC 유래 DA 전구체의 안전성 및 효능에 대한 평가.

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral ...

이 프로토콜은 파킨슨 병과 같은 신경 퇴행성 질환을 치료하는 데 사용할 수있는 신경 줄기 세포로 혈액 및 단일 핵 세포를 재프로그래밍하는 방법을 설명합니다. 그것은 신경 퇴행성 질병을 취급하기 위하여 자기 세포 근원을 제공합니다. 또한, 유도된 신경줄기 세포로 의 전환에 필요한 시간 프레임과 원하는 세포 유형으로분화하는 것은 유도된 다능성 줄기 세포보다 짧다.유도된 신경 줄기 세포는 좋은 증식 능력을 가지고 있으며 적용 전에 확장 될 수 있습니다. iNSC는 척수 뉴런 이나 운동 뉴런과 같은 다른 지역 별 신경 세포로 지정될 수 있기 때문에, 이 방법은 그밖 신경학상 질병의 처리를 위해 확장될 수 있습니다. 전체 절차는 모든 단계와 관련된 중요한 시간이 오래 걸리므로 시각적 데모는 세포가 어떻게 생겼는지에 대한 아이디어를 제공하고 원하는 세포의 성공적인 생성을 보장하기위한 몇 가지 팁을 제공합니다.시작하려면 이전에 분리된 말초 정맥 혈액을 50밀리리터 원내 튜브로 옮기고, 동일한 양의 멸균 덜벡코의 PBS로 희석합니다. 또 다른 50 밀리리터 원내 튜브에서는 멸균 밀도 그라데이션 배지 15밀리리터를 준비합니다. 튜브를 45도 각도로 기울이고 희석된 말초 혈액 30밀리리터를 밀도 그라데이션 배지에 천천히 조심스럽게 놓습니다.원심분리기는 실온에서 15분 동안 800배 g의 원심분리기를 하고 원심분리기 브레이크가 꺼져 있습니다. 노란색, 상부 플라즈마 층을 흡인하고 폐기하십시오. 10밀리리터 파이펫을 사용하여 단핵 세포를 포함하는 흰색의 흐린 얇은 필름 층을 새로운 50밀리리터 원내 튜브로 옮느라 한다.MMC와 튜브에 D-PBS30 밀리리터를 추가하고, 원심분리기는 섭씨 4도에서 10분 동안 600배 g로 추가합니다. 상체를 폐기한 후 D-PBS 의 45 밀리리터를 추가하고 세포를 다시 중단합니다. 4섭씨에서 10분 동안 400배g의 원심분리후, 상퍼를 폐기하십시오.D-PBS의 5 밀리리터로 세포를 다시 중단하고, trypan 블루 제외 방법으로 라이브 셀을 계산하고, 확장에 필요한 MC를 따로 설정하고, 향후 사용을 위해 나머지 셀을 동결합니다. 14일 영하 14일, 종자 MC들은 6웰 플레이트당 밀리리터당 2~300만 개의 세포밀도로 37도, 미리 따뜻워진 MNC 배지의 1.5밀리리터를 갖는다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 이틀 간 배양합니다.11일 영하 11일에는 살균된 파이펫을 사용하여 배지로 세포를 수집하고 새로운 15밀리리터 원추형 튜브로 이송한다. 원심분리기는 실온에서 5분 동안 250배 g로, 상체를 폐기하고, 전침이 도는 MNC 배지의 1밀리리터로 세포를 재연한다. 트라이팬 블루로 실행 가능한 세포를 계산한 후, 6웰 플레이트에서 미리 데운 MNC 배지에서 밀리리터당 100만 개의 세포밀도로 MC를 시드한다.섭씨 37도, 이산화탄소 5% 3일 동안 배양하고, MNC 배지에서 세포 수집, 원심분리 및 도금을 영하 8도및 4일 동안 반복한다. 센다이 바이러스는 이 절차에서 위험하며 센다이 바이러스와 관련된 모든 절차는 안전 캐비닛에서 수행해야 합니다. 그리고 센다이 바이러스에 노출된 모든 팁과 튜브는 폐기 전에 에탄올 또는 표백제로 처리되어야 합니다.0일째에 MNC 배지에서 세포를 수집하고 15밀리리터 원추형 튜브로 이송합니다. 5 분 동안 200 배 g에서 세포를 원심 분리 한 후, 슈퍼 나탄을 흡인하고 미리 따뜻하게 된 MNC 배지의 1 밀리리터로 세포를 다시 중단합니다. trypan blue로 실행 가능한 세포를 계산한 다음 24웰 플레이트에서 웰당 200, 000 세포의 농도로 미리 데운 MNC 배지로 다시 보냅니다.37도 섭씨 수조에서 센다이 바이러스를 함유한 영하 80도 저장에서 제거된 튜브를 5~10초 동안 해동한 다음 실온에서 해동하도록 둡니다. 해동하면 즉시 얼음 위에 놓습니다. 해동된 센다이 바이러스를 MMC와 함께 24웰 플레이트의 우물에 첨가하여 10의 감염의 다발성에서 추가합니다.세포의 부착을 용이하게 하기 위해 플레이트를 1, 000배 g에서 30분 동안 원심분리하고 그 후에는 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 인큐베이터에 배치합니다. 첫날에는 배지로 세포를 15밀리리터 원심분리기 튜브로 이송합니다. 남은 세포를 더 분리하려면 우물당 MNC 배지 1밀리리터로 헹구고 배지가 있는 세포를 튜브에 추가합니다.셀 서스펜션을 5분 동안 200배 g로 원심분리한 후, 수퍼네티드를 흡인하고, 500마이크로리터의 신선한 사전 데운 MNC 배지로 세포를 재연하고, 24웰 플레이트의 웰에 첨가한다. 둘째 날, D-PBS의 마이크로리터 폴리-D-리신당 이전에 희석된 50마이크로그램당 1밀리리터를 사용하여 실온에서 최소 2시간 동안 6웰 플레이트를 코팅합니다. 6웰 플레이트에서 폴리-D-리신을 흡인하고 수직 깨끗한 벤치에서 약 10분 동안 건조시합니다.그런 다음 이전에 희석 된 밀리리터 라미닌 당 1 밀리리터를 6 웰 플레이트에 넣고 37도에서 4 ~ 6 시간 동안 배양하십시오. 사용하기 전에 D-PBS로 접시를 씻으시면 됩니다. 셋째 날, 폴리-D-리신/라미닌 코팅 6웰 플레이트상에 유도된 신경줄기 세포 배지에서 모든 센다이 바이러스 변환 된 MC를 플레이트.5일과 7일에는 37도의 밀리리터 1밀리리터를 6웰 플레이트의 각 웰에 미리 데워진 iNSC 배지를 부드럽게 추가합니다. 9일부터 28일까지, 매체를 매일 신선한 미리 데워진 iNSC 매체로 교체하십시오. iNSC 식민지의 출현을 모니터링하고, 약 2~3주 동안 불에 탄 유리 파이펫을 사용하여 적절한 형태로 식민지를 선택하고 확장을 위해 6웰 플레이트의 별도의 우물로 각 식민지를 옮기다.일방적인 6-hyroxydopamine 병변 마우스 모형을 설치하기 위하여는, 마취, 성인, 남성, SCID 베이지 마우스의 머리를 면도하고, 에리스로마이신 눈 연고를 적용합니다. 입체 장치에 마우스를 놓고 절개 막대로 마우스를 고정합니다. 이어 컵을 올바르게 삽입하여 마우스 헤드를 고정하고 적절하게 배치합니다.포비도요오드와 이소프로필 알코올로 머리를 살균한 다음 메스 블레이드를 사용하여 머리 피부에 약 1.5센티미터 의 처진 절개를 하여 두개골을 노출시합니다. 절개 막대와 이어 바를 조정하여 브레그마와 람다의 높이 차이를 0.1밀리미터 미만으로 줄입니다. 천천히 이동하고 bregma를 향해 현미경 주사 바늘의 끝을 낮추고, 제로 포인트로 bregma를 치료.팁을 앞면 0.5밀리미터및 브레그마대비 측면 2.1밀리미터의 좌표로 위치로 이동합니다. 팁을 철회하고 마커 펜으로 점을 표시하고 전자 드릴로 두개골에 약간의 구멍을 버링합니다. 밀리리터 당 5 마이크로 그램의 두 마이크로 리터를 추출 6-hyroxydopamine 용액 마이크로 시링에.바늘을 표시된 지점으로 되돌리고 바늘을 등쪽/복부 3.2밀리미터에 삽입합니다. 분당 1 마이크로 리터의 속도로 주사기에서 6-hyroxydopamine 용액을 주입, 또 다른 5 분 동안 장소에 주입 바늘을 두고, 다음 천천히 철회. 봉합사로 절개를 닫은 후, 다시 눈에 에리스로 마이신 눈 연고를 적용합니다.스테레오탁스 장치에서 마우스를 제거하고 복구 케이지에 넣고 의식을 되찾을 때까지 음식과 물에 접근할 수 있도록 하십시오. PBMC가 SeV에 감염된 후, 그들의 형태는 변화하고 세포는 5 일째까지 급격한 죽음을 겪었습니다. INSC 식민지는 12일째에 나타났다.여러 구절에 대한 확장을 위해 iNSC 클론을 골라낸 후, 그들은 좋은 형태를 보였고 iNSC 배지에서 단층 형태나 구체로서 안정적으로 자체 갱신할 수 있었습니다. 24일 간의 분화 후, iNSC는 티로신 하이드록실라제, 포크헤드 박스 A2 및 뉴런 특이적 등급 III 베타 튜룰린 마커를 표현한 다수로 도파민성 뉴런으로 확인되었다. 일방적인 6-hyroxydopamine 병병 마우스 모형의 설치 후에, 행동 평가는 파킨슨 병 현상을 추정하기 위하여 실시되었습니다.세포 이식을 받은 마우스는 운동 기능에 있는 유의한 개선을 보여주었습니다. 6-hyroxydopamine 유도병변의 정도는 striatum에서 TH에 대한 사후 면역 형광 염색, 내측 전뇌 번들 및 실질적인 니그라 파스 콤팩트에 의해 확인되었다. TH 양성 신호는 세포가 이식되고 또한 SN에서 약간 복구된 striatum에서 크게 복구되었습니다. 이식 후 3개월, 생존 세포 중 약 13.84%가 TH 양성 도파민성 뉴런이었다.TH 양성 세포의 약 91.72%가 고아 핵 수용체를 표현했으며, 약 86.76%가 FOXA2를 발현했으며, 약 98.77%가 G 단백질 결합 내정류 칼륨과 공동 표지되었다. 밀도 그라데이션 매체에 희석 된 말초 혈액 30 마일을 놓을 때, 그라데이션 인터페이스를 방해하지 않고 천천히 조심스럽게하십시오. 높은 바이러스 활동을 보장하기 위해 센다이 바이러스의 반복 해동 및 동결을 피하기 위해주의해야한다.말초 혈액 단핵 세포를 유도신경 줄기 세포로 재프로그래밍할 때는 매일 세포의 형태를 면밀히 관찰하십시오. 또한, 6-하이드록시도파민은 빛과 온도에 민감하다. 용액을 빛으로부터 보호하고 사용하기 전에 얼음에 보관하십시오.이 절차에 따라, 하나는 문화권에서 가족 PD 환자 유래 도파민성 뉴런을 사용하여 질병 메커니즘을 연구할 수 있습니다. 하나는 또한 이식된 세포가 손상된 신경 회로에 어떻게 영향을 미치는지 조사하는 것을 계속할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

말초 혈액 조혈 전구 세포에서 인간 신경 줄기 세포의 직접 유도

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

연구

발생학

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

피더가없는 조건에 센다이 바이러스를 사용하여 인간 말초 T 세포로부터 유도 된 다 능성 줄기 세포의 생성

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

에피 솜 벡터를 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터의 통합없이 유도 다 능성 줄기 세포의 생성

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

말초 혈액 유래 인간 유래 다 능성 줄기 세포에서 연골 세포 분화

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

수평 한 전체적인 거치 : 피부의 두껍고, 3 차원 조직 단면도를위한 비발 한 가공 그리고 화상 진찰 의정서

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

생활 그대로 Zebrafish에 단일 셀 Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

파생 및 개 난소 중간 엽 줄기 세포의 분화

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

코드 혈액 파생에서 3D 피부 Organoid의 생성 유도 만능 줄기 세포

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...