Name: generation of induced neural stem cells from peripheral mononuclear cells and differentiation toward dopaminergic neuron precursors for transplantation studies
Uploaded: 2019-07-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studie

Çalışma aşağıdaki hibe tarafından desteklenmektedir: kök hücre ve çeviri ulusal anahtar projesi (2016YFA0101403), Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (81661130160, 81422014, 81561138004), Pekin Belediye doğal Bilim Vakfı (5142005), Pekin yetenekleri Vakfı (2017000021223TD03), destek projesi yüksek düzey öğretmenler Pekin Belediye üniversitelerinde 13 beş yıl dönemi planı (CıT & TCD20180333), Pekin tıbbi sistem yüksek seviyeli Yetenek Ödülü (2015-3-063), Pekin Belediye Sağlık Komisyonu Fonu (PXM 2018_026283_000002), Pekin 100, Thousand, ve 10000 yetenekler Fonu (2018A03), Pekin Belediye Hastanesi özel finansman desteğinin klinik tıp gelişimi (ZYLX201706) ve Royal Society-Newton gelişmiş Bursu (NA150482).

Tüm prosedürler, kurumsal insan araştırma etiği komitesinin yönergelerine uymalıdır. Kan toplama işleminden önce hastalara veya sağlıklı gönüllülerden bilgilendirilmiş onay alınmalıdır. Bu protokol, kurumun insan araştırma etiği Komitesi tarafından onaylanmıştır ve kurumun hayvanların bakımı ve kullanımı kurallarına göre gerçekleştirildi.
1. PBMNCs toplama, yalıtım ve genişleme
<ol><li>PBMNCs koleksiyonu
	<ol>
<li>Sodyum Heparin koruyuc...

<ol>
	<li>Williams-Gray, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+cognitive+syndromes+of+Parkinson's+disease:+5+year+follow-up+of+the+CamPaIGN+cohort.">The distinct cognitive syndromes of Parkinson's disease: 5 year follow-up of the CamPaIGN cohort.</a> Brain. 132, 2958-2969 (2009).</li><li>Dexter, D. T., Jenner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson+disease:+from+pathology+to+molecular+disease+mechanisms.">Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms.</a> Free Radical Biology and Medicine. 62, 132-144 (2013).</li><li>Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Therapy+for+Parkinson's+Disease:+New+Hope+from+Reprogramming+Technologies.">Cell Therapy for Parkinson's Disease: New Hope from Reprogramming Technologies.</a> Aging and Disease. 6 (6), 499-503 (2015).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Mouse+Embryonic+and+Adult+Fibroblast+Cultures+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Doi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+dopaminergic+progenitors+by+cell+sorting+for+successful+transplantation.">Isolation of human induced pluripotent stem cell-derived dopaminergic progenitors by cell sorting for successful transplantation.</a> Stem Cell Reports. 2 (3), 337-350 (2014).</li><li>Kriks, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+neurons+derived+from+human+ES+cells+efficiently+engraft+in+animal+models+of+Parkinson's+disease.">Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease.</a> Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).</li><li>Perrier, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+midbrain+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12543-12548 (2004).</li><li>Kikuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPS+cell-derived+dopaminergic+neurons+function+in+a+primate+Parkinson's+disease+model.">Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model.</a> Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).</li><li>Ma, T., Xie, M., Laurent, T., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+the+reprogramming+of+somatic+cells.">Progress in the reprogramming of somatic cells.</a> Circulation Research. 112 (3), 562-574 (2013).</li><li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+adult+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+into+induced+neural+stem+cell+by+using+episomal+vectors.">Conversion of adult human peripheral blood mononuclear cells into induced neural stem cell by using episomal vectors.</a> Stem Cell Research. 16 (2), 236-242 (2016).</li><li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+precursors+differentiated+from+human+blood-derived+induced+neural+stem+cells+improve+symptoms+of+a+mouse+Parkinson's+disease+model.">Dopaminergic precursors differentiated from human blood-derived induced neural stem cells improve symptoms of a mouse Parkinson's disease model.</a> Theranostics. 8 (17), 4679-4694 (2018).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Fibroblasts+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes.">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).</li><li>Thier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+fibroblasts+into+stably+expandable+neural+stem+cells.">Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).</li><li>Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures.">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).</li><li>Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+a+small+amount+of+human+peripheral+blood+using+a+combination+of+activated+T+cells+and+Sendai+virus.">Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus.</a> Nature Protocols. 7 (4), 718-728 (2012).</li><li>Bazley, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Reprogramming+of+Human+Primordial+Germ+Cells+into+Induced+Pluripotent+Stem+Cells:+Efficient+Generation+of+Genetically+Engineered+Germ+Cells.">Direct Reprogramming of Human Primordial Germ Cells into Induced Pluripotent Stem Cells: Efficient Generation of Genetically Engineered Germ Cells.</a> Stem Cells and Development. 24 (22), 2634-2648 (2015).</li><li>Li, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytoplasmic+RNA+vector+derived+from+nontransmissible+Sendai+virus+with+efficient+gene+transfer+and+expression.">A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression.</a> Journal of Virology. 74 (14), 6564-6569 (2000).</li><li>Sochacki, J., Devalle, S., Reis, M., Mattos, P., Rehen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+urine+iPS+cell+lines+from+patients+with+Attention+Deficit+Hyperactivity+Disorder+(ADHD)+using+a+non-integrative+method.">Generation of urine iPS cell lines from patients with Attention Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD) using a non-integrative method.</a> Stem Cell Research. 17 (1), 102-106 (2016).</li><li>Ban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+(iPSCs)+by+temperature-sensitive+Sendai+virus+vectors.">Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14234-14239 (2011).</li><li>Cho, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+and+large-scale+generation+of+functional+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (9), 3392-3397 (2008).</li><li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. -. K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression.">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nature Protocols. 7 (11), 2013-2021 (2012).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+primary+somatic+cells+by+OCT4+and+chemical+compounds.">Reprogramming of human primary somatic cells by OCT4 and chemical compounds.</a> Cell Stem Cell. 7 (6), 651-655 (2010).</li><li>Ono, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+neurogenic+potential+in+floor+plate+cells+along+an+anteroposterior+location:+midbrain+dopaminergic+neurons+originate+from+mesencephalic+floor+plate+cells.">Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells.</a> Development. 134 (17), 3213-3225 (2007).</li><li>Kirkeby, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+regionally+specified+neural+progenitors+and+functional+neurons+from+human+embryonic+stem+cells+under+defined+conditions.">Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions.</a> Cell Reports. 1 (6), 703-714 (2012).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling.">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li><li>Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+derivation+of+functional+floor+plate+tissue+from+human+embryonic+stem+cells.">Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 6 (4), 336-347 (2010).</li><li>Harvey, B. K., Wang, Y., Hoffer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+rodent+models+of+Parkinson's+disease.">Transgenic rodent models of Parkinson's disease.</a> Acta Neurochirurgica Supplements. 101, 89-92 (2008).</li><li>Sheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+dopaminergic+neurons+directly+from+mouse+fibroblasts+and+fibroblast-derived+neural+progenitors.">Generation of dopaminergic neurons directly from mouse fibroblasts and fibroblast-derived neural progenitors.</a> Cell Research. 22 (4), 769-772 (2012).</li><li>Prasad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+induced+pluripotent+stem+cell,+direct+conversion+by+trans-differentiation,+direct+reprogramming+and+oligodendrocyte+differentiation.">A review of induced pluripotent stem cell, direct conversion by trans-differentiation, direct reprogramming and oligodendrocyte differentiation.</a> Regenerative Medicine. 11 (2), 181-191 (2016).</li></ol>

Burada PD modelleri için INsc-DA hücre tedavisinin farklı aşamaları kapsanan bir protokol sundu. Bu protokolün kritik yönleri şunlardır: (1) pbmncs izolasyonu ve genişlemesi ve pbmncs 'nin ınscs 'ye yeniden programlanması, (2) ınscs 'nin da nöronlara farklılaşması, (3) tek taraflı 6-OHDA-lesioned PD fare modellerinin kurulması ve davranışsal ve (4) DA öncüleri ve davranışsal değerlendirmesinin hücre nakli.
Bu protokolde ilk bölüm, eritroblastları tercih eden ve le...

Parkinson hastalığı (PD) ortak bir nörodejeneratif hastalıktır, dopaminerjik dejenerasyon neden olur (da) nöronlar üzerinde kanıtlanmış Nigra pars Compacta (snpc) ventral mezensefalon (VM), üzerinde prevalansı ile% 1 daha fazla nüfusu 60 yaş üzerinde 1 , 2. son on yıl içinde, hücre terapisi, ya dejeneratif veya hasarlı hücrelerin değiştirilmesi ya da dejenere nöronlar etrafında mikroçevre BESLEYICI, PD3tedavisinde potansiyel göstermiştir. Bu arada, yeniden programlama teknolojisi önemli ilerleme yaptı4, hangi yedek terapi için umut verici bir hücresel kaynak sağlar. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreleri (ıpscs) ve embriyonik kök hücreler (ESCs) DA nöral hücrelere ayırt edebilmek için kanıtlanmıştır, hangi hayatta olabilir, olgunlandırmak, ve sıçan ve non-insan primat PD modelleri içine grepte motor fonksiyonları geliştirmek5 ,6,7,8. ıpscs, hücresel yeniden programlama teknolojilerinde bir kilometre taşı temsil eder ve hücre nakli konusunda büyük bir potansiyele sahiptir; Ancak, hala tamamen farklılaşmış hücrelerden tümör oluşumu riski hakkında bir endişe vardır. Hücre transplantasyonu için alternatif bir hücresel kaynak olan, kararsız ara kaynaklarından elde edilebilir olan indüklenen nöral kök hücreler (ınscs) gibi, doğrudan yeniden programlama yoluyla elde edilen kökten işlenen yetişkin kök hücrelerdir. aşama9,10,11.
Hem ipscs hem de ınscs, fibroblastlar, periferik kan mononükleer hücreler (pbmncs) ve diğer çeşitli hücre türleri12,13,14gibi otolog hücresel kaynaklardan yeniden programlanabilmektedir, böylece büyük bir dereceye kadar nakledilen hücrelerin immünogenisite. Dahası, IPhone 'lar ile karşılaştırıldığında, ınscs, tümör oluşumu ve sırtı işlenmiş plastisite riski azalmış, sadece nöronlar ve glia11farklılaştırmak mümkün. İlk çalışmalarda, invaziv bir prosedür olan cilt biyopsisinden elde edilen fibroblastlar arasında insan ya da fare ıpscs ve ınscs oluşturuldu14,15. Bu bağlamda, PBMNCs daha az invaziv örnekleme işlemi nedeniyle cazip bir başlangıç hücresi kaynağıdır ve genişleme süresi kısa bir süre içinde çok sayıda hücre elde etmek kolaylığı16. İlk yeniden programlama çalışmaları, lentiviral veya retroviral vektörler gibi İntegratif teslimat sistemlerini kullanan, birçok hücre türü içinde verimli ve kolay uygulanabilen17; Ancak bu teslimat sistemleri, klinik terapötik amaçlar için güvenlik sorunları mevcut olan kalan transgenler, mutasyonlar ve yeniden aktivasyonuna neden olabilir12. Sendai virüs (SeV) bir non-Integrative RNA virüsü bir negatif anlamda, ana genom içine entegre değildir tek telli genom, ancak virüslü hücrelerin sitoplazmasında çoğaltır, yeniden programlama için verimli ve güvenli bir araç sunan18 ,19. Rekombinant SeV vektörler, açık okuma çerçevelerinde insan OCT3/4, SOX2, KLF4 ve c-myc gibi yeniden programlama faktörleri içeren kullanılabilir. Buna ek olarak, SeV viral vektörler, sıcaklık duyarlı mutasyonlar sunarak daha da iyileştirilebilir, böylece kültür sıcaklığı 39 °C ' ye yükseltildiğinde hızla kaldırılabilirler.20. Bu yazıda, PBMNCs 'i SeV sistemini kullanarak yeniden programlamak için bir protokol açıklanmaktadır.
Birçok çalışmalar insan ESCS veya ipscs çeşitli yöntemler6,8,21kullanarak da nöronların türetme bildirdi. Bununla birlikte, ınscs 'deki DA nöronların farklılaşması ayrıntılarını açıklayan bir protokol sıkıntısı vardır. Bu protokolde, iki aşamalı bir yöntem kullanarak ınscs 'deki DA nöronların verimli oluşumunu açıklayacağız. DA nöronal öncüleri güvenlik ve etkinlik değerlendirmeleri için PD fare modellerinin striatum içine nakledilebilir. Bu makalede, Sendai virüsü tarafından indüklenen nöral kök hücrelerin nesil çeşitli aşamaları kapsayan ayrıntılı bir protokol sunacak, DA nöronlar içine ınscs farklılaşma, fare PD modellerinin kurulması, striatum içine DA öncüleri nakli için , PD modellerinin. Bu protokol kullanılarak, hastalar ve sağlıklı bağışçıların ınscs oluşturabilir ve hücre transplantasyonu amacıyla güvenli, standartlanabilir, ölçeklenebilir ve homojen olan DA nöronlar türetebilirsiniz veya PD 'yi bir tabak içinde modelleme ve mekanizmaların incelenmesi temel hastalık başlangıcı ve gelişimi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:828px;" width="827">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">15-ml conical tube</td>
			<td style="width:183px;">Corning</td>
			<td style="width:153px;">430052</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">1-Thioglycerol</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">M6145</td>
			<td>Toxic for inhalation and skin contact</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">24-well plate</td>
			<td style="width:183px;">Corning</td>
			<td style="width:153px;">3337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">50-ml conical tube&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Corning</td>
			<td style="width:153px;">430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">6-OHDA</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">H4381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">6-well plate</td>
			<td style="width:183px;">Corning</td>
			<td style="width:153px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Accutase</td>
			<td style="width:183px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">A11105-01</td>
			<td>Cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Apomorphine</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">A4393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">A92902</td>
			<td>Toxic with skin contact&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">B27 supplement&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">BDNF</td>
			<td style="width:183px;">Peprotech</td>
			<td style="width:153px;">450-02</td>
			<td>Brain derived neurotrophic factor</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:277px;">Blood collection tubes containing sodium heparin</td>
			<td style="width:183px;">BD</td>
			<td style="width:153px;">367871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">BSA</td>
			<td style="width:183px;">yisheng</td>
			<td style="width:153px;">36106es60</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">cAMP</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">D0627</td>
			<td>Dibutyryladenosine cyclic monophosphate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">CellBanker 2</td>
			<td style="width:183px;">ZENOAQ</td>
			<td style="width:153px;">100ml</td>
			<td>Used as freezing medium for PBMNCs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Chemically defined lipid concentrate</td>
			<td style="width:183px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">11905031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">CHIR99021</td>
			<td style="width:183px;">Gene Operation</td>
			<td style="width:153px;">04-0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Coverslip</td>
			<td style="width:183px;">Fisher</td>
			<td style="width:153px;">25*25-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">DAPI</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">D8417-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">DAPT</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">D5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">D2915-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">DMEM-F12</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:153px;">11330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">DMEM-F12</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:153px;">11320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Donkey serum</td>
			<td style="width:183px;">Jackson</td>
			<td style="width:153px;">017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">EPO</td>
			<td style="width:183px;">Peprotech</td>
			<td style="width:153px;">100-64-50UG</td>
			<td>Human Erythropoietin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">FGF8b</td>
			<td style="width:183px;">Peprotech</td>
			<td style="width:153px;">100-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Ficoll-Paque Premium</td>
			<td style="width:183px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:153px;">17-5442-02</td>
			<td>P=1.077, density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">GDNF</td>
			<td style="width:183px;">Peprotech</td>
			<td style="width:153px;">450-10</td>
			<td>Glial derived neurotrophic factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">GlutaMAX</td>
			<td style="width:183px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">21051024</td>
			<td>100 &#215; Glutamine stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Ham&#39;s-F12</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:153px;">11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">HBSS</td>
			<td style="width:183px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">14175079</td>
			<td>Balanced salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Human leukemia inhibitory factor</td>
			<td style="width:183px;">Millpore</td>
			<td style="width:153px;">LIF1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Human recombinant SCF</td>
			<td style="width:183px;">Peprotech</td>
			<td style="width:153px;">300-07-100UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">IGF-1</td>
			<td style="width:183px;">Peprotech</td>
			<td style="width:153px;">100-11-100UG</td>
			<td>Human insulin-like growth factor&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">IL-3</td>
			<td style="width:183px;">Peprotech</td>
			<td style="width:153px;">200-03-10UG</td>
			<td>Human interleukin 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">IMDM</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:153px;">215056-023</td>
			<td>Iscove&#39;s modified Dulbecco&#39;s medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Insulin</td>
			<td style="width:183px;">Roche&#160;</td>
			<td style="width:153px;">12585014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">ITS-X</td>
			<td style="width:183px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">51500-056</td>
			<td>Insulin-transferrin-selenium-X supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Knockout serum replacement</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:153px;">10828028</td>
			<td>Serum free basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Laminin</td>
			<td style="width:183px;">Roche&#160;</td>
			<td style="width:153px;">11243217001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Microsyringe</td>
			<td style="width:183px;">Hamilton</td>
			<td style="width:153px;">7653-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">N2 supplement&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">NEAA</td>
			<td style="width:183px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">11140050</td>
			<td>Non-essential amino acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Neurobasal</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:153px;">10888</td>
			<td>Basic medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">PDL</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">P7280</td>
			<td>Poly-D-lysine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">SAG1</td>
			<td style="width:183px;">Enzo</td>
			<td style="width:153px;">ALX-270-426-M01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">SB431542</td>
			<td style="width:183px;">Gene Operation</td>
			<td style="width:153px;">04-0010-10mg</td>
			<td>Store from light at -20&#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Sendai virus</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:153px;">MAN0009378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Sucrose</td>
			<td style="width:183px;">baiaoshengke</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">TGF&#946;&#8546;</td>
			<td style="width:183px;">Peprotech</td>
			<td style="width:153px;">100-36E</td>
			<td>Transforming growth factor&#160; &#946;&#8546;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Transferrin</td>
			<td style="width:183px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:153px;">2914-HT-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Triton X 100</td>
			<td style="width:183px;">baiaoshengke</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td>Nonionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:153px;">T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Xylazine</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">X1126</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of induced neural stem cells from peripheral mononuclear cells and differentiation toward dopaminergic neuron precursors for transplantation studies

Parkinson hastalığı (PD), ventral mezensefalon (VM) içinde kanıtlanmış bir Nigra pars Compacta (snpc) dopaminerjik (da) nöronların dejenerasyonu nedeniyle oluşur. Hücre replasman tedavisi PD tedavisi için büyük söz tutar. son zamanlarda, indüklenen nöral kök hücreler (SCS) tümör oluşumu riski azalmış ve plastisite nedeniyle hücre değiştirme tedavisi için potansiyel bir aday olarak ortaya çıkmıştır bölgeye özgü nöronlar ve glia. ınscs, fibroblastlar, periferik kan mononükleer hücreler (PBMNCs) ve diğer çeşitli hücre türleri gibi otolog somatik hücresel kaynaklardan yeniden programlanabilmektedir. Diğer somatik hücreler ile karşılaştırıldığında, PBMNCs kültür erişim ve genişletme kolaylığı nedeniyle cazip bir başlangıç hücresi türüdür. , İnsan OCT3/4, SOX2, KLF4 ve c-myc dahil olmak üzere yeniden programlama faktörleri kodlama, bir RNA olmayan Integrative virüs Sendai virüs (sev), bir negatif duygusu vardır, tek-telli, olmayan segmentli genom içine entegre değildir Ana genom, ancak virüslü hücrelerin sitoplazmasında çoğaltır, yeniden programlama için verimli ve güvenli bir araç sunuyor. Bu çalışmada, PBMNCs 'yi yeniden programlama ve iki aşamalı bir yöntemle özel VM DA nöronlara ayırt edilen ınscs 'nin elde edildiği bir protokol açıklanmaktadır. Daha sonra DA öncüleri tek taraflı 6-hyrokydopamin (6-OHDA)-lesioned PD fare modellerini PD tedavisinde güvenlik ve etkinliğini değerlendirmek için nakledilir. Bu yöntem, hasta özel DA nöral hücrelerinin in vitro ve in vivo fonksiyonlarını ve terapötik etkilerini araştırmak için bir platform sağlar.

Burada, PD modellerini tedavi etmek için INsc-DA hücre tedavisinin farklı aşamalarını kapsayan bir protokol bildiriyoruz. Öncelikle, PBMNCs yalıtılmış ve genişletilmiş ve SeV enfeksiyonu tarafından ınscs içine yeniden programlanmıştır. Şekil 1' de PBMNC genişleme ve insc indüksiyon prosedürlerinin şematik bir gösterimi gösterilir. -14 gün, PBMNCs yoğunluğu degrade Orta (malzeme tablosu) kullanılarak izole edildi. Santrifüjden önce, PBS ile sey...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studie

Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies

Periferik mononükleer hücrelerden Indüklenen nöral kök hücrelerin üretimi ve transplantasyon çalışmaları için Dopaminergic neuron precursors doğru farklılaşma

Protokol, çevresel kan mononükleer hücrelerin yeniden programlanması ile sinirsel kök hücrelerini Sendai virüs enfeksiyonu, dopaminerjik nöronlar içine inscs farklılaşma, tek taraflı-lesioned içine da öncüleri transplantasyon teşvik sunar Parkinson hastalığı fare modelleri ve PD tedavisi için iNSC-türetilen DA öncüleri güvenlik ve etkinliğini değerlendirilmesi.

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral ...

Bu protokol, parkinson hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıkların tedavisinde kullanılabilecek nöral kök hücrelere kan ve mononükleer hücreleri yeniden programlamak için bir yöntem açıklar. Bu nörodejeneratif hastalıkları tedavi etmek için bir otolog hücre kaynağı sunuyor. Ayrıca, indüklenen nöral kök hücrelere dönüşüm ve istenilen hücre tiplerine farklılaşma için gerekli zaman dilimi indüklenen pluripotent kök hücreleriçin daha kısadır.İndüklenen nöral kök hücreler iyi bir proliferatif kapasiteye sahiptir ve uygulamadan önce ölçeklendirilebilir. INSCs farklı bölgeye özgü nöral hücrelere belirtilebilir yana, spinal kord nöronlar veya motor nöronlar gibi, Bu yöntem diğer nörolojik hastalıkların tedavisi için uzatılabilir. Tüm yordam, ilgili ve kritik tüm adımlar ile uzun bir zaman alır, bu yüzden görsel gösteri hücrelerin nasıl göründüğü hakkında bir fikir verir ve istenen hücrelerin başarılı bir nesil sağlamak için bazı ipuçları sağlar.Başlamak için, 50 mililitrelik konik tüp içine daha önce izole periferik venöz kan transferi, ve steril Dulbecco PBS eşit hacimli seyreltmek. Başka bir 50 mililitrekonik tüp, sterilize yoğunluk gradyan orta 15 mililitre hazırlamak. Tüpü 45 derecelik bir açıyla yatırın ve yoğunluk gradyan ortamının üzerine 30 mililitre seyreltilmiş periferik kan yavaşça ve dikkatlice yerleştirin.Tüpü 800 kez g'de oda sıcaklığında 15 dakika boyunca santrifüj edin ve kapalı konumda ki santrifüj freni ayarlayın. Sarı, üst plazma tabakasıaspire ve atın. Mononükleer hücreler içeren beyaz, bulutlu ince film tabakasını 50 mililitrelik yeni bir konik tüpe aktarmak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın.MNC'ler ile tüpe 30 mililitre D-PBS ekleyin ve 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca 600 kez g santrifüj. Supernatant attıktan sonra, D-PBS 45 mililitre ekleyin ve hücreleri askıya. 400 kez g dört santigrat derece de 10 dakika boyunca tüp santrifüj sonra, supernatant atın.D-PBS beş mililitre ile hücreleri yeniden askıya, trypan mavi dışlama yöntemi ile canlı hücreleri saymak, genişleme için gerekli MNCs bir kenara koymak ve gelecekteki kullanım için kalan hücreleri dondurmak. Gün eksi 14, tohum MNCs mililitre başına mililitre başına 2-3 milyon hücre yoğunluğunda altı iyi plaka 1.5 mililitre ile 37 derece santigrat mililitre, önceden ısıtılmış MNC orta. 37 santigrat derecede kuluçkaya yat, iki gün boyunca %5 karbondioksit.Gün eksi 11, orta hücreleri toplamak ve yeni bir 15 mililitrekonik tüp transfer sterilize pipet kullanın. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 250 kez g'de santrifüj yapın, süpernatant'ı atın ve önceden ısıtılmış bir Mililitre MNC ortamında hücreleri yeniden askıya alın. Trypan mavisi ile canlı hücreleri sayarak sonra, altı kuyulu bir plaka içinde önceden ısıtılmış MNC ortamda mililitre başına bir milyon hücre yoğunluğunda MNC tohum.37 santigrat derece, üç gün boyunca% 5 karbondioksit, kuluçka ve gün eksi sekiz ve eksi dört MNC ortamda hücre toplama, santrifüj ve kaplama tekrarlayın. Bu işlemde Sendai virüsü tehlikelidir ve Sendai virüsü içeren tüm prosedürler bir güvenlik kabininde yapılmalıdır. Ve tüm ipuçları ve tüpler Sendai virüsü maruz kalmadan önce etanol veya çamaşır suyu ile tedavi edilmelidir.Gün sıfır, MNC orta hücreleri toplamak ve 15 mililitrelik konik tüp aktarın. Hücreleri 200 kez g'de beş dakika santrifüj ettikten sonra, süpernatantı aspire edin ve bir mililitre önceden ısıtılmış MNC ortamı ile hücreleri yeniden askıya alın. Trypan mavisi ile canlı hücreleri sayın ve daha sonra önceden ısıtılmış MNC orta ile 200, 24-iyi plakalar kuyu başına 000 hücre konsantrasyonu onları yeniden askıya.37 derecelik santigrat su banyosunda Sendai virüsü içeren eksi 80 derecelik santigrat deposundan çıkarılan tüpleri 5 ila 10 saniye eritin ve oda sıcaklığında erimeye bırakın. Çözüldükten sonra, hemen buza yerleştirin. 10 enfeksiyon çokluğu ile MNCs ile 24-iyi plaka kuyularına çözülmüş Sendai virüs ekleyin.Hücrelerin bağlanmasını kolaylaştırmak için, plakaları 1,000 kez g'de 30 dakika santrifüj edin ve bundan sonra plakaları 37 santigrat derece, %5 karbondioksit ile kuvöze yerleştirin. İlk gün, 15 mililitrelik bir santrifüj tüp orta ile hücreleri aktarın. Kalan hücreleri daha fazla ayırmak için, kuyu başına bir mililitre MNC orta ile kuyuları durulayın ve tüporta ile hücreleri ekleyin.Hücre süspansiyonuna 5 dakika boyunca 200 kez g'de santrifüj edildikten sonra, süpernatantı aspire edin, 500 mikrolitre taze önceden ısıtılmış MNC ortamı yla hücreleri yeniden askıya alın ve 24 kuyulu bir plaka kuyusuna ekleyin. İkinci gün, d-PBS'de mikrolitre poli-D-lizin başına daha önce seyreltilmiş 50 mikrogram başına bir mililitre kullanın ve oda sıcaklığında en az iki saat boyunca altı kuyulu plakaları kaplayın. Altı kuyulu plakalardan poli-D-lizin aspire edin ve dikey temiz tezgahta yaklaşık 10 dakika kurulayın.Sonra altı kuyu plakaları için mililitre laminin başına daha önce seyreltilmiş beş mikrogram kuyu başına bir mililitre ekleyin ve kat 37 derece santigrat dört ila altı saat kuluçka. Kullanmadan önce plakaları D-PBS ile yıkayın. Üçüncü gün, poli-D-lizin/laminin kaplı altı kuyulu plakalar üzerinde indüklenen nöral kök hücre orta tüm Sendai virüs transdüktülen MNCs plaka.Beş ve yedi gün, yavaşça 37 derece santigrat bir mililitre ekleyin, altı iyi plakalar her iyi için önceden ısıtılmış iNSC orta. Dokuzuncu günden 28. iNSC kolonilerinin ortaya çıkışını izleyin ve yaklaşık iki ila üç hafta içinde yanmış cam pipetler kullanarak uygun morfolojiye sahip kolonileri seçin ve her kolonu genişlemek için altı kuyulu bir plakanın ayrı bir kuyuya aktarın.Tek taraflı 6-hyroxydopamin-lezyonlu fare modelleri kurmak için, anestezi, yetişkin, erkek, SCID-bej fare başkanı tıraş ve eritromisin göz merhemi uygulamak. Fareyi stereotaksik aygıtın üzerine yerleştirin ve fareyi kesici çubuklarla düzeltin. Fare kafasını güvenli ve uygun bir şekilde konumlandırmak için kulak kaplarını doğru şekilde takın.Povito iyot ve izopropil alkol ile baş sterilize, ve sonra kafa derisi üzerinde yaklaşık 1,5 santimetre sagittal kesi yapmak için bir neşter bıçak kullanın, kafatası açığa. Kesici çubuğu ve kulak çubuklarını ayarlayarak bregma ve lambda arasındaki yükseklik farkını 0,1 milimetrenin daha azına indirin. Mikroşinga iğnesinin ucunu bregma'ya doğru yavaşça hareket ettirin ve indirin ve bregma'yı sıfır noktası olarak değerlendirin.Ucu ön koordinatları 0,5 milimetre ve lateral 2,1 milimetre bregma göre bir konuma taşıyın. Ucu geri çek, noktayı bir kalemle işaretle işaretle ve elektronik bir matkapla kafatasına küçük bir delik aç. Mikroşinga içine mililitre 6-hyroxydopamin çözeltisi başına beş mikrogram iki mikrolitre ayıklayın.İğneyi işaretli noktaya geri döndürün ve iğneyi 3,2 milimetre dorsal/ventral'a takın. Dakikada bir mikrolitre hızında şırıngadan 6-hyroxydopamin çözeltisi enjekte, başka bir beş dakika için yerinde enjeksiyon iğne bırakın, ve sonra yavaş yavaş geri çekin. Kesiyi dikişlerle kapattıktan sonra, eritromisin göz merhemini tekrar gözlere uygulayın.Fareyi stereotaksik cihazdan çıkarın, kurtarma kafesine koyun ve bilincini geri kazanana kadar yiyecek ve suya erişime izin verin. PBMNC'ler SeV ile enfekte olduktan sonra morfolojileri değişiyordu ve hücreler beşinci güne kadar şiddetli bir şekilde öldüler. INSC kolonileri 12.Bir dizi pasaj için genişleme için iNSC klonlarını seçip aktardıktan sonra, iyi bir morfoloji gösterdiler ve iNSC ortamında, ya tek katmanlı bir biçimde ya da küre olarak kendini yenileyebildiler. 24 günlük farklılaşmadan sonra, iNSC'ler dopaminerjik nöronlar olarak tanımlandı ve bunların çoğu tirozin hidroksilaz, forkhead kutusu A2 ve nörona özgü sınıf III beta-tubulin belirteçleri olarak tanımlandı. Tek taraflı 6-hyroxydopamin-lezyonlu Parkinson hastalığı fare modelleri kurulduktan sonra, Parkinson hastalığı belirtilerini tahmin etmek için davranışsal değerlendirme yapıldı.Hücre nakli yapılan fareler motor fonksiyonlarında önemli bir iyileşme gösterdi. 6-hyroxydopamin indüklenen lezyon derecesi striatum TH için post-mortem immünfloresan boyama ile doğrulandı, medial ön beyin demeti, ve substantia nigra pars compacta. TH-pozitif sinyaller büyük ölçüde hücrelerin implante edildi ve aynı zamanda hafif SN kurtarıldı striatum kurtarıldı. Transplantasyondan üç ay sonra, hayatta kalan hücreler arasında yaklaşık %13.84'ü TH-pozitif dopaminerjik nöronlardı.TH pozitif hücrelerin yaklaşık %91,72'si yetim nükleer reseptörü, yaklaşık %86,76'sı FOXA2'yi ifade etti ve yaklaşık %98,77'si G-protein-çiftleşen içe dönük düzeltici potasyum ile birlikte etiketlendi. Yoğunluk gradyan ortamının üzerine 30 mil sulandırılmış periferik kan döşeyirken, lütfen degrade arabirimini bozmamak için yavaşça ve dikkatlice yapın. Yüksek bir virüs aktivitesi sağlamak için Sendai virüsünün tekrar tekrar çözülmesini ve dondurulmasını önlemeye özen izlenmelidir.Periferik kan mononükleer hücrelerini indüklenen nöral kök hücrelere yeniden programlarken, lütfen her gün hücrelerin morfolojisini yakından gözlemleyin. Ayrıca, 6-hidroksidopamin ışığa ve ısıya duyarlıdır. Çözeltiyi ışıktan korumaya dikkat edin ve kullanmadan önce buzda tutun.Bu prosedürü takiben, bir kültürde ailesel PD hasta kaynaklı dopaminerjik nöronlar kullanarak hastalık mekanizmaları çalışmaya devam edebilirsiniz. Bir de nakledilen hücrelerin hasarlı nöronal devreleri nasıl etkilediğini araştırmaya devam edebilirsiniz.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Periferik kan Hematopoetik Progenitör Hücreleri İnsan Sinir Kök Hücre Doğrudan İndüksiyon

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Besleyici içermeyen şartlar Sendai virüs kullanılarak insan periferik T hücrelerinden uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Epizomal vektörlerin kullanılması insan periferik kan mononükleer hücrelerinden entegrasyon içermeyen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

Periferal Kan Türevi İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Kondrositlerin Farklılaşması

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Yatay Dağ Dağı: Derinin kalın, üç boyutlu doku kesitleri için yeni bir İşleme ve Görüntüleme Protokolü

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş Pluripotent kök hücrelerinden retina Pigment epitel hücrelerinin

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Yaşam sağlam Zebra balığı tek hücreli Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

Türetme ve köpek yumurtalık mezenkimal kök hücre farklılaşma

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

3B cilt Organoid kablosu kan kaynaklı nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...