Name: preparation of newborn rat brain tissue for ultrastructural morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals
Uploaded: 2019-06-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals at JoVE.com

Dette manuskript blev støttet af NIH/NIGMS K08 123321 (til N.L.) og af midler fra Institut for anæstesiologi ved University of Virginia. Forfatterne ønsker at takke Alev Erisir (Department of Biology, University of Virginia, Charlottesville, VA) for fremragende uddannelse og teknisk bistand med TEM, og for hendes uvurderlige manuskript kritik. Forfatterne også takke Advanced Electron Micro scopy facilitet på University of Virginia for teknisk bistand med præparat skæring og post-farvning.

Alle undersøgelser blev godkendt af Institut for dyrepasning og-brug på University of Virginia (Charlottesville, VA) og gennemført i overensstemmelse med de nationale Institut for sundhed retningslinjer.
1. fiksering af vaskulær perfusion
Bemærk: En generel beskrivelse af metoden for rotte hjerne vaskulær perfusion er allerede beskrevet i denne tidsskrift13 og ligger uden for denne protokols anvendelsesområde. Men følge...

<ol>
	<li>Lunardi, N., Oklopcic, A., Prillaman, M., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+exposure+to+general+anesthesia+disrupts+spatial+organization+of+presynaptic+vesicles+in+nerve+terminals+of+the+developing+subiculum.">Early exposure to general anesthesia disrupts spatial organization of presynaptic vesicles in nerve terminals of the developing subiculum.</a> Molecular Neurobiology. 52 (2), 942-951 (2015).</li><li>Lunardi, N., Ori, C., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+anesthesia+causes+long-lasting+disturbances+in+the+ultrastructural+properties+of+developing+synapses+in+young+rats.">General anesthesia causes long-lasting disturbances in the ultrastructural properties of developing synapses in young rats.</a> Neurotoxicity Research. 17 (2), 179-188 (2010).</li><li>Sanchez, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+anesthesia+causes+long-term+impairment+of+mitochondrial+morphogenesis+and+synaptic+transmission+in+developing+rat+brain.">General anesthesia causes long-term impairment of mitochondrial morphogenesis and synaptic transmission in developing rat brain.</a> Anesthesiology. 115 (5), 992-1002 (2011).</li><li>Boscolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+abolishment+of+anesthesia-induced+cognitive+impairment+by+timely+protection+of+mitochondria+in+the+developing+rat+brain:+the+importance+of+free+oxygen+radicals+and+mitochondria+integrity.">The abolishment of anesthesia-induced cognitive impairment by timely protection of mitochondria in the developing rat brain: the importance of free oxygen radicals and mitochondria integrity.</a> Neurobiology of Disease. 45 (3), 1031-1041 (2012).</li><li>Aghajanian, G. K., Bloom, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+of+synaptic+junctions+in+developing+rat+brain:+a+quantitative+electron+microscopy+study.">The formation of synaptic junctions in developing rat brain: a quantitative electron microscopy study.</a> Brain Research. 6 (4), 716-727 (1967).</li><li>Akert, K., Sandri, C., Santini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+the+Maillet+method+for+cytochemical+studies+of+synapses.">Significance of the Maillet method for cytochemical studies of synapses.</a> Golgi centennial symposium; Perspectives in Neurobiology. , 387-399 (1975).</li><li>Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemistry+of+synapses:+selective+staining+for+electron+microscopy.">Cytochemistry of synapses: selective staining for electron microscopy.</a> Science. 154 (3756), 1575-1577 (1966).</li><li>Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+structural+and+cytochemical+analysis+of+the+staining+of+synaptic+junctions+with+phosphotungstic+acid.">Fine structural and cytochemical analysis of the staining of synaptic junctions with phosphotungstic acid.</a> Journal of Ultrastructure Research. 22 (5-6), 361-375 (1968).</li><li>Burry, R. W., Lasher, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+electron+microscopy+study+of+synapse+formation+in+dispersed+cell+cultures+of+rat+cerebellum+stained+either+by+O-UL+or+by+E-PTA.">A quantitative electron microscopy study of synapse formation in dispersed cell cultures of rat cerebellum stained either by O-UL or by E-PTA.</a> Brain Research. 147 (1), 1-15 (1978).</li><li>Pellegrino de Iraldi, A., Suburo, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+staining+of+synaptic+vesicles+using+the+Champy-Maillet+technique.">Electron staining of synaptic vesicles using the Champy-Maillet technique.</a> Journal of Microscopy. 91 (2), 99-103 (1970).</li><li>Pfenninger, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytochemistry+of+synaptic+densities.+I.+An+analysis+of+the+bismuth+iodide+impregnation+method.">The cytochemistry of synaptic densities. I. An analysis of the bismuth iodide impregnation method.</a> Journal of Ultrastructural Research. 34 (1), 103-122 (1971).</li><li>Hayat, M. A., Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+fixation.">Chemical fixation.</a> Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications. , 4-84 (2000).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visual Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Hayat, M. A., Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fixation for electron microscopy. , (1981).</li><li>Behrman, E. J., et al., Revel, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemistry+of+osmium+tetroxide+fixation.">The chemistry of osmium tetroxide fixation.</a> The science of biological specimen preparation for microscopy and microanalysis. , 1-5 (1983).</li><li>Nielson, A. J., Griffith, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactions+of+osmium+tetroxide+with+protein+side+chains+and+unsaturated+lipids.">Reactions of osmium tetroxide with protein side chains and unsaturated lipids.</a> Journal of the Chemical Society, Dalton Transactions. (6), 1084-1088 (1979).</li><li>Nielson, A. J., Griffith, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+fixation+by+osmium+tetroxide.+A+possible+role+for+proteins.">Tissue fixation by osmium tetroxide. A possible role for proteins.</a> Journal of Hystochemistry &amp; Cytochemistry. 27 (5), 997-999 (1979).</li><li>Hanker, J. S., Deb, C., Wasserkrug, H. L., Seligman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+tissue+for+light+and+electron+microscopy+by+bridging+metals+with+multidentate+ligands.">Staining tissue for light and electron microscopy by bridging metals with multidentate ligands.</a> Science. 152 (3729), 1631-1634 (1966).</li><li>Zobel, C. R., Beer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+heavy+metal+salts+as+electron+stains.">The use of heavy metal salts as electron stains.</a> International Review of Cytology. 18, 363-400 (1965).</li><li>Silva, M. T., Guerra, F. C., Magalhaes, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fixative+action+of+uranyl+acetate+in+electron+microscopy.">The fixative action of uranyl acetate in electron microscopy.</a> Experientia. 24 (10), 1074 (1968).</li><li>Terzakis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uranyl+acetate,+a+stain+and+a+fixative.">Uranyl acetate, a stain and a fixative.</a> Journal of Ultrastructural Research. 22 (1-2), 168-184 (1968).</li><li>Feldman, I., Jones, J., Cross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chelation+of+uranyl+ions+by+adenine+nucleotides.">Chelation of uranyl ions by adenine nucleotides.</a> Journal of the American Chemical Society. 89 (1), 49-53 (1967).</li><li>Shah, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+uranyl+ions+with+phospholipid+and+cholesterol+monolayer.">Interaction of uranyl ions with phospholipid and cholesterol monolayer.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 29 (2), 210-215 (1969).</li><li>Daems, W. T., Persijn, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Section+staining+with+heavy+metals+of+osmium-fixed+and+formol-fixed+mouse+liver+tissue.">Section staining with heavy metals of osmium-fixed and formol-fixed mouse liver tissue.</a> Journal. Royal Microscopical Society. 81 (pts 3&#38;4), 199-201 (1963).</li><li>Lombardi, L., Prenna, G., Okolicsanyi, L., Gautier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+staining+with+uranyl+acetate:+possible+role+of+free+amino+groups.">Electron staining with uranyl acetate: possible role of free amino groups.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 19 (3), 161-168 (1971).</li><li>Cattini, P. A., Davies, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+lead+citrate+staining+of+thin+sections+for+electron+microscopy.">Kinetics of lead citrate staining of thin sections for electron microscopy.</a> Stain Technology. 58 (1), 29-40 (1983).</li><li>Reynolds, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+lead+citrate+at+high+pH+as+an+electron+opaque+stain+in+electron+microscopy.">The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).</li><li>Cattini, P. A., Davies, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+kinetics+of+uranyl+acetate+and+phosphotungstic+acid+staining+of+chromatin+in+thin+sections+for+electron+microscopy.">Observations on the kinetics of uranyl acetate and phosphotungstic acid staining of chromatin in thin sections for electron microscopy.</a> Stain Technology. 59 (5), 291-304 (1984).</li><li>Derksen, J. W., Meekes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+staining+of+nucleic+acid+containing+structures+by+uranyl+acetate-lead+citrate.">Selective staining of nucleic acid containing structures by uranyl acetate-lead citrate.</a> Micron and Microscopica Acta. 15 (1), 55-58 (1984).</li><li>Frasca, J. M., Parks, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+routine+technique+for+double-staining+ultrathin+sections+using+uranyl+and+lead+salts.">A routine technique for double-staining ultrathin sections using uranyl and lead salts.</a> Journal of Cell Biology. 25 (1), 157-161 (1965).</li><li>Hanaichi, T., Sato, T., Iwamoto, T., Malavasi-Yamashiro, J., Hoshino, M., Mizuno, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stable+lead+by+modification+of+Sato&#8217;s+method.">A stable lead by modification of Sato&#8217;s method.</a> Journal of Electron Microscopy. 35 (3), 304-306 (1986).</li><li>Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+method+for+lead+staining+of+thin+sections.">A modified method for lead staining of thin sections.</a> Journal of Electron Microscopy. 17 (2), 158-159 (1968).</li><li>Lever, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+staining+tissues+with+lead+for+electron+microscopy.">A method of staining tissues with lead for electron microscopy.</a> Nature. , 810-811 (1960).</li><li>Derek, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self+organization+of+the+Escherichia+Coli+chemotaxis+network+imaged+with+super-resolution+light+microscopy.">Self organization of the Escherichia Coli chemotaxis network imaged with super-resolution light microscopy.</a> Public Library of Science Biology. 7 (6), e1000137 (2009).</li><li>Richards, J. G., Heyn, C., Forssmann, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+histochemistry+of+nervous+tissue.">Ultrastructural histochemistry of nervous tissue.</a> Techniques in Neuroanatomical Research. , 277-292 (1981).</li><li>Wood, R. L., Luft, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+the+buffer+system+on+fixation+with+osmium+tetroxide.">The influence of the buffer system on fixation with osmium tetroxide.</a> Journal of Ultrastructural Research. 12 (1-2), 22-45 (1965).</li><li>Louw, J., Williams, K., Harper, I. S., Walfe-Coote, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+dense+artifactual+deposits+in+tissue+sections:+the+role+of+ethanol,+uranyl+acetate+and+phosphate+buffer.">Electron dense artifactual deposits in tissue sections: the role of ethanol, uranyl acetate and phosphate buffer.</a> Stain Technology. 65 (5), 243-250 (1990).</li></ol>

Håndtering af vævs sektioner under præparat forberedelsen til TEM kræver en betydelig grad af finesse, koncentration og tålmodighed. Når der anvendes en mikropipette til at tilføje og fjerne opløsninger, kan prøverne suges ind i pipettespidsen med overfladespænding, så der skal udvises stor omhu for at undgå vævsbeskadigelse af pipetten. Også, visse trin af dehydrering sekvens kan være så hurtig som 1 min, derfor operatøren har brug for at arbejde hurtigt for at sikre, at den næste dehydrering trin star...

Vi beskriver metoder til fremstilling af nyfødte rotte hjernevæv for at opnå højkvalitets elektron mikrografer til dybdegående morfometrisk analyse af synaptisk vesikel rumlig fordeling ved nerve terminaler1,2. De høj-kontrast mikrografer, der kan opnås ved at behandle prøver efter disse metoder kan også bruges til at studere den detaljerede morfologi af en række cellulære komponenter og deres dimensionale strukturelle relationer3,4.
Transmission elektronmikroskop (TEM) er et kraftfuldt værktøj til at studere morfologien af organeller og andre cellulære strukturer kvantitativt. Som i dette årti, er der ingen andre metoder til undersøgelse, der kan give den samme grad af opløsning af lipid membraner og organeller uden immuno-tagging, med undtagelse af kryofiksering ved højt tryk frysning. Dog, fryse substitutions teknikker er ikke almindeligt anvendt, og normalt kræver dyrt udstyr og lange tilberedningstider.
For at kunne udnytte TEM-systemets høje opløsnings effekt er det yderst vigtigt at have et optimalt præparat. De vigtigste mål for præparat præparatet er at bevare vævs struktur med minimal ændring fra den levende tilstand, forbedre præparatet kontrast, og stabilisere vævet mod udvinding af cellulære komponenter under behandling og eksponering for elektron Stråle. Talrige protokoller for TEM væv forberedelse er blevet indført og perfektioneret af flere laboratorier i årenes løb. Mange af dem har fokuseret på metoder til optimal visualisering af synaptiske vesikler5,6,7,8,9,10,11. Blandt en række veletablerede, guld standardmetoder, der i øjeblikket er i brug, valgte vi procedurer for kemisk fiksering, post fiksation, en bloc farvning, sekventiel dehydreringen, harpiks indlejringen og post farvning, der har til formål at bevare optimal vævs struktur og opnå fremragende billedkontrast. Bemærk, bevarelse af fin ultrastruktur kan være særligt udfordrende, når man arbejder med nyfødte rotte hjernevæv. Faktisk er det centrale nervesystem af meget unge dyr karakteriseret ved et højere vandindhold end den voksne hjerne, mere fremtrædende udvidelse af ekstracellulære rum, og løsere forbindelser mellem cellerne12. Dette gør nyfødte rotte hjernevæv dybt følsom over for ændringer i osmolaritet, og udsøgt tilbøjelige til artifaktivt svind og/eller hævelse, når de behandles gennem sekventielle opløsninger af forskellige tonicitet12. Derfor, vores metoder anvendes løsninger til præparat behandling, der er af osmolaritet så tæt som muligt på, at af rotte nyfødte hjernen. Vores mål var at opnå højkvalitets højopløsnings elektronmikroskopi billeder til kvantitativ vurdering af den synaptiske vesikel rumlige fordeling ved nerve terminaler. Specifikt, vi forsøgte at måle antallet af vesikler i nerve terminalen, afstanden af synaptiske vesikler fra den præ-synaptiske plasma membran, antallet af vesikler forankret i den præ-synaptiske membran, størrelsen af synaptiske vesikler og mellem vesikel afstande1.
Tilfredsstillende kemisk fiksering er en forudsætning for at opnå højkvalitets elektron mikrografer, der kan give de morfologiske detaljer, der er nødvendige for at studere synaptisk blære morfologi og rumlig organisation. Selv om flere former for fiksering findes, fiksering af hjernevæv ved vaskulær perfusion er decideret overlegen i andre metoder. Da fiksering via vaskulær perfusion begynder umiddelbart efter anholdelsen af systemisk cirkulation, forkorter det intervallet mellem deoxygenering af hjernevæv og Cross-Linking af proteiner med fixativer, hvilket resulterer i minimum ændringer i celle Struktur. Desuden, det opnår hurtig og ensartet penetration, på grund af den hurtige strøm af fiksativ fra den vaskulære seng til ekstracellulære og cellulære rum12,13,14. Primær fiksering med glutaraldehyd, efterfulgt af sekundær fiksering (efter fiksering) med osmium tetroxid, giver fremragende bevarelse af den fine struktur15,16,17. En blanding af glutaraldehyd og PARAFORMALDEHYD har den yderligere fordel, at den hurtigere trænger ind i vævet12.
Da biologisk væv ikke er tilstrækkelig stift til at blive skåret i tynde sektioner uden støtte fra en harpiks matrix, skal de integreres i et medium før tynde skæring. Vand-immiscible epoxyharpiks er almindeligt anvendt som et indlejrings medium i TEM. Når denne type matrix anvendes, skal hele prøveemnets frie vand udskiftes med et organisk opløsningsmiddel før harpiks infiltration. Vand fjernes ved at passere prøven gennem en række opløsninger af stigende koncentrationer af ethanol og/eller acetone12. I denne protokol, er prøverne første flade indlejret mellem fleksible aklar ark, derefter indlejret i en kapsel. Det endelige resultat er væv placeret på spidsen af en cylindrisk harpiks blok, som har den ideelle geometri til at være mindst påvirket af vibrationer, der opstår under mikrotom skæring.
Farvning med tungmetaller til at forbedre endogene væv kontrast er et andet vigtigt aspekt af præparatet præparat. Billedkontrast i TEM skyldes elektron spredning af atomerne i vævet. Biologiske materialer består dog hovedsagelig af lavatomare molekyler (dvs. kulstof, brint, ilt og nitrogen). Derfor, dannelsen af tilstrækkelig spredning kontrast kræver inkorporering af høj atomare vægt atomer i cellulære komponenter i vævet. Dette opnås ved farvning af prøven med tungmetaller12,18,19. Osmium tetroxide, uran og bly, som binder stærkt til lipider, er de mest almindelige tungmetaller, der anvendes som elektron pletter.
Osmium (atomnummer 76) er en af de tætteste metaller i eksistens. Det er både en fiksativ og en plet, selv om dens primære rolle i tem er som en pålidelig fikativ12. Blandt de forskellige fikserings protokoller, der anvendes, er metoden med dobbelt fiksering med glutaraldehyd efterfulgt af osmium den mest effektive til at reducere udvindingen af cellebestanddele under præparat tilberedningen. Disse to aromastoffer bruges til at stabilisere det maksimale antal forskellige typer af molekyler, især proteiner og lipider, og resultere i overlegen bevaring af væv ultrastruktur12,14,15, 16 ud af , af 17.
Uran (atomnummer 92) er det tungeste metal, der anvendes som elektron pletter, oftest i form af uranylacetat. På samme måde som osmium, fungerer det som en plet og fikativ, selv om dets primære rolle i tem er som en plet20,21. Nukleinsyre-holdige og membranøse strukturer er stærkt og fortrinsvis farves med uranylnitrat salte i aldehyd-faste væv22,23. Behandling af væv med uranylnitrat acetat efter osmication og før dehydrering resulterer i stabilisering af membranøse og nukleinsyre-holdige strukturer, samt øget kontrast, og gør det muligt at identificere nogle strukturelle detaljer, der ikke ville let påvises i enheder plettet med osmium alene12,24,25. Det menes, at uranylnitrat acetat kan stabilisere den fine struktur ved at kombinere med reduceret osmium, der er blevet deponeret på lipid membraner under osmication24. Der opnås maksimal kontrast, når uranylnitrat acetat påføres før indlejring og som post pletten i tynde afsnit12.
Bly (atomnummer 82) er den mest almindelige plet, der anvendes til TEM og er hovedsagelig beskæftiget med efter farvning af tynde sektioner. Blysalte har høj elektron opacitet og viser affinitet for en bred vifte af cellulære strukturer, herunder membraner, nukleare og cytoplasmatiske proteiner, nukleinsyre og glykogen26,27. Når den dobbelte farvnings metode anvendes (dvs. farvning med uranylnitrat acetat efterfølges af behandling med bly), fungerer sidstnævnte som udvikler af uranylnitrat acetat farvning. For eksempel, bly post-farvning af kromatin fikseret med glutaraldehyd øger uranylnitrat acetat optagelse med en faktor på tre28,29,30,31,32. Bly også forbedrer farvning overført af andre metaller såsom osmium. Det menes, at bly salte bejdsede membraner af osmium-faste væv ved at binde sig til Polar gruppen af phosphatidylphosphatider i nærværelse af reduceret osmium33. En potentiel ulempe ved farvning med både uranylnitrat acetat og bly, især for længerevarende varigheder, er, at mange forskellige strukturelle elementer er plettet lige og ikke-specifikt, og derfor kan ikke let skelnes fra hinanden12 .
Den nylige indførelse af alternative lyskilder, såsom i optisk super-opløsning foto-aktiveret lokalisering mikroskopi, har væsentligt forbedret lys mikroskopi opløsning34. Men fordi let mikroskopi er afhængig af histokemiske og immun-cytokemiske metoder til at visualisere individuelt mærkede proteiner eller enzymer, er kraften i TEM til at vise alle strukturelle elementer på én gang stadig uovertruffen til dybtgående undersøgelse af morfologi og dimensionelle relationer af vævs strukturer. Især kan ingen anden teknik give de morfologiske detaljer, der er nødvendige for at udføre morfometrisk analyse af synaptisk vesikel fordeling på præ-synaptiske nerve boutoner. Ikke desto mindre er det vigtigt at bemærke, at elektron mikrografer fanger vævs strukturen, efter at organismen dør, og de kan derfor ikke give oplysninger om dynamikken i den præ-synaptiske vesikel-Handel og ekocytose. Derfor bør andre værktøjer, såsom FM Dye-levende billeddannelse og patch-klemme Elektrofysiologi, overvejes, når Hovedformålet er at studere dynamiske og/eller funktionelle aspekter af synaptisk vesikel Handel og exocytose.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% Osmium tetroxide</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19170</td>
			<td>acqueous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16310</td>
			<td>EM grade, acqueous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aclar 33 C embedding film</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50425-25</td>
			<td>7.8 mil thickness, size 8&#34;x10&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEEM capsule holder</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69916</td>
			<td>holds size &#34;00&#34; capsules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEEM embedding capsules</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70021</td>
			<td>size &#34;00&#34;, flat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butler block trimmer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69945-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camel hair paint brush</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>65576-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disc punch</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>77850-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embed 812 kit</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead citrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead nitrate</td>
			<td>Electron microscopy Sciences</td>
			<td>17900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica UC7 ultracut microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scale</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>62091-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19208</td>
			<td>EM grade, granular</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Thelco laboratory oven</td>
			<td>Thelco</td>
			<td>51221159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StatMark pen</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72109-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrode solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>11760-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of newborn rat brain tissue for ultrastructural morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals

Vores laboratorium og mange andre har udnyttet den høje løsning magt transmission elektronmikroskopi til at studere morfologi og rumlig organisering af synaptiske vesikler. For at opnå høj kvalitet elektron mikrografer, der kan give den grad af morfologiske detaljer er nødvendige for kvantitativ analyse af præ-synaptisk vesikel fordeling, optimal præparat præparat er kritisk. Kemisk fiksering er det første skridt i processen med præparat forberedelse, og af allerstørste betydning for at bevare fine ultrastruktur. Vaskulær fiksering med en glutaraldehyd-formaldehyd opløsning, efterfulgt af behandling af vibratome-sekerede prøver med osmium tetroxid, stabiliserer det maksimale antal molekyler, især proteiner og lipider, og resulterer i overlegen bevaring af ultrastruktur. Væv bliver derefter behandlet med modfarvning, sekventiel dehydrering og harpiks-Embedding. En bloc farvning med uranylnitrat acetat (dvs. farvning af vibratome-sekeret væv før harpiks indlejring) forbedrer endogene kontrast og stabiliserer celle komponenter mod ekstraktion under præparat behandling. Kontrasten kan øges yderligere ved at anvende uranylnitrat acetat som post pletten på ultratynde sektioner. Dobbelt farvning af ultratynde sektioner med bly citrat efter uranylnitrat acetat behandling forbedrer også billedopløsningen ved at intensivere elektron-opacitet af nukleinsyre-holdige strukturer gennem selektiv binding af bly til uranylnitrat acetat. Transmission elektronmikroskopi er et kraftfuldt værktøj til karakterisering af de morfologiske detaljer i synaptiske vesikler og kvantificering af deres størrelse og rumlige organisation i terminalens Bouton. Men, fordi det bruger fast væv, transmission elektronmikroskopi kan kun give indirekte oplysninger om levende eller udviklende processer. Derfor bør andre teknikker overvejes, når Hovedformålet er at studere dynamiske eller funktionelle aspekter af synaptisk blære handel og ekocytose.

Der er fastlagt generelle kriterier, som for det meste accepteres som tegn på tilfredsstillende eller mangelfuld konservering af enheden for TEM. Disse kriterier er eksemplificeret i fire udvalgte elektron mikrografer (to eksempler på optimal tilberedning, to eksempler på defekt præparat), som blev opnået ved at behandle unge rotte hjernevæv efter de metoder, der er beskrevet i denne protokol.
Generelt fremstår en elektron Mikrograf af god kvalitet som en velordnet, tydelig og overordne...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals at JoVE.com

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

Vi beskriver procedurer for behandling af nyfødte rotte hjernevæv for at opnå højopløsnings elektron mikrografer til morfometrisk analyse af synaptisk vesikel fordeling ved nerve terminaler. Mikrograferne opnået med disse metoder kan også bruges til at studere morfologien af en række andre cellulære komponenter og deres dimensionale strukturelle relationer.

Forberedelse af nyfødte rotte hjernevæv til Ultrastrukturel morfometrisk analyse af Synaptic Vesicle distribution på nerve terminaler

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial ...

Blandt flere eksisterende protokoller for vævspræparation til transmission elektronmikroskopi valgte vi metoder, der giver optimal strukturel konservering og højopløsningsmikrografier til at udføre morfometrisk analyse af synaptiske vesiklerfordeling ved præsynaptiske terminaler. De billeder med stor kontrast, der er fremkommet ved disse metoder, gør det muligt at kvantificere parametre såsom afstand af synaptiske vesikler fra det præsynaptiske membranantællertal af vesikler, der er forankret ved den præsynaptiske membran og inter vesicle afstande. Alle disse parametre er tegn på synaptisk funktion.Da ændringer i den geografiske organisering af synaptiske vesikler kan være forbundet med afbrydelse af synaptisk funktion, er disse metoder blevet anvendt til at undersøge virkningerne af generel bedøvelse på synaptisk udvikling. Disse metoder kan også bruges til at undersøge virkningerne af ethvert lægemiddel eller behandling på den detaljerede morfologi af synapser at give indsigt i deres funktion. Begynd med at forberede osmium tetroxid til post fiksering af rotte hjerne sektioner tidligere fastsat med paraformaldehyd og glutaraldehyd via vaskulær perfusion.Sektioner bliver stive efter behandling med osmium tetroxid. Derfor væv håndtering kræver opmærksomhed fra da af. Også, før du tilføjer osmium, Sørg for, at dine sektioner er fladtrykt som enhver fold vil sandsynligvis resultere i væv fraktur.Åbn en fem milliliter glas ampule på 4%osmium tetroxid og vand og slip det inde i en brun glasflaske. Der tilsættes fem milliliter 0,2 molarphosphatbuffer, og der tilsættes derefter yderligere 10 milliliter 0,1 molarphosphatbuffer for at opnå en 1%endelig opløsning. Brug en 20 milliliter sprøjte udstyret med en lang nål til at udarbejde 1% osmium tetroxid og derefter tilføje osmium tetroxid til en brun glaskrukke dækket med aluminiumsfolie.Efter at have sørget for, at prøven er blevet udfoldet og fladtrykt, tilsættes 1%osmium tetroxid og 0,1 molar PB til prøvehætteglasset. Prøven inkuberes i osmiumtetroxid i en time ved stuetemperatur. Osmiumtetroxid udvindes med et mikropipet, når inkubationen er færdig, og skyl sektionerne som beskrevet i protokollen.For at forberede uranylacetat anbringes en 200 milliliterkolbe med 100 milliliter 70% ethanol på en omrøringsplade. Tilsæt fire gram uranylacetat til kolben, pak en aluminiumsfolie ind for at forhindre udfældning af lys og rør kontinuerligt. Dehydrer sektionerne i 50% ethanol.Plet med forberedt 4% uranylacetat i en time og følg med serielle dehydrering og skylning som beskrevet i manuskriptet. Fjern sprøjtestemplet fra en 60 milliliterslydsprøjtesprøjte, og hætten med en sikkerhedsnål. Ansvar sprøjten med den åbne side op, og tilsæt hver ingrediens i harpiksen en efter en.Afslut ved at tilføje 525 mikroliter DMP30 med en pipet. Flytning af stemplet af pipet meget langsomt som DMP er meget tyktflydende. Sæt stemplet tilbage i sprøjten.Inverter sprøjten et par gange for at blande indholdet. Farven skifter fra gul til gul. Evakuer luften inde i sprøjten.Derefter placere den på en rocker med kontinuerlig omrystning i mindst 30 minutter. Tilsæt en volumen epoxy harpiks og en volumen af acetone til en scintillation hætteglas og ryst til at blande. Påfør denne ene til en harpiks til acetone blanding på vævssektionen efter den sidste acetone skylning holde i dækket for at undgå acetone fordampning.Fjern den ene til en blanding af harpiks og acetone efter to til fire timer og erstatte det med fuld harpiks og inkubere i fire timer. Læg alt harpiksaffald i en opsamlingsbeholder under kølerhjelmen for at polymerisere og bortskaffes senere. Skær to rektangulære stykker klar polychlortrifluorethylen film og tør dem med 70% ethanol.Trim dem, så der er mindst 1,5 centimeter vævsfri plast på hver side af sektionen, og sørg for, at de har samme bredde, men højden af arket på toppen er ca 2/3 af det nederste ark. Vip langsomt hætteglasset og brug en fin kamel pensel og en fleksibel mikrospatel til meget forsigtigt at løfte prøven fra bunden. Flyt derefter forsigtigt sektionen langs hætteglasvæggene og overfør den til det nederste PCTFE-ark.Fjern overskydende harpiks med en mikrospatel, og dæk forsigtigt prøven med det øverste ark. Skub forsigtigt eventuelle fanget luftbobler ud uden at trykke direkte på vævssektionen og udslette den overskydende harpiks. Brug en opløsningsmiddelresistent pen til at mærke arkene og placere i en ovn ved 60 grader celsius i to til tre dage for at polymerisere.Træk forsigtigt de klemt PCTFE-ark fra hinanden for at åbne dem. Brug en opløsningsmiddelresistent pen til at markere den side af arket, der indeholder den klæbende sektion, der markerer den i nærheden af vævet. Brug en skivepunch til at få en cirkelprøve af sektionen, og sørg for, at pennemærket er en del af det udstansede væv.Pennemærket glimter, når lyset lyser på prøven. Anstænft hætten på en indlejringskapselside op på en kapselholder. Placer en dråbe harpiks på hætten og indsæt den udstansede disk inde i hætten med vævssektionen opad.Sæt en kapsel i hætten ved hjælp af en blid proptrækkerbevægelse. Brug fine pincet til at rulle og sænke en trykt to centimeter langt stykke papir etiket i kapslen, og sørg for det passer til krumning af sidevæggene i kapslen. Hæld indlejring harpiks inde i kapslen, fyld op til kanten af kapslen og bruge en spids træpind til at skubbe vævsprøven ned til bunden.Anse kapslen i ovnen ved 60 grader celsius i to til tre dage for polymerisering. Og fortsæt derefter med trækning og farvning som beskrevet i protokollen. Elektron mikrograf af tilfredsstillende bevarelse af neuronal cellestruktur viser lagdelte cellemembraner uden pauser.Cytoplasmaet er endelig granuleret og uden tomme mellemrum. Mitokondrier er hverken hævede eller indskrumpet med en bevaret ydre dobbelt membran og intakt indre cristae. Optimal konservering af neuronal ultrastruktur og fine morfologiske detaljer er afgørende for at visualisere synaptiske vesikler og måle deres afstand fra den præsynaptiske membran.Synaptiske vesikler skal være forskellige og foret med en ubrudt enkelt membran. For at lette morfometrisk analyse af fordeling af synaptisk vesicle bør præsynaptiske og postsynaptiske membraner være parallelle i deres kontinuitet bevares. Elektron mikrograf af defekt konservering af vævsstruktur viser forvrængning og brud af neuronal cellemembraner og tilstedeværelsen af markant forstørrede ekstracellulære rum.Mitokondrier synes udspilet og har hævede cristae. I et andet eksempel på defekt vævsstruktur konservering, var der store hvide tomme rum i cytoplasmaet i stedet for fint granulære cytoplasmatisk stof med forstørrede ekstracellulære rum. En kunstig membran som forall sandsynligvis skyldes mobilisering af lipider under fiksering med glutaraldehyd.Når du arbejder unge hjernevæv bruge 1 molar fosfat buffer som et opløsningsmiddel til alle dine opløsning, så du holder tonicity så tæt som muligt på den nyfødte rotte hjerne og minimere artefaktuel væv svind og eller hævelse. De mikrografer, der opnås med disse metoder, kan bruges til at studere de detaljerede morfologi og dimensionelle strukturelle relationer af en række andre cellekomponenter end synaptiske vesikler. For eksempel mitokondrier, golgi apparater og nukleare kromatin.Flere trin i denne protokol kræver kemikalier, der kan være giftige. Arbejd altid under en røghætte og bær personlige værnemidler ved håndtering af aldehyder, osmium, uran og blyforbindelser.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric ÃƒÅ½Ã‚Â²-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Kvantitativ analyse af Synaptic vesikel Pool Replenishment i dyrkede cerebellare Granule Neuroner bruger FM Farvestoffer

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Kapacitans Målinger og Ca 2 + Imaging på Single nerveterminaler i Retinal Skiver

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Samtidig Pre-og Post-synaptiske Elektrofysiologiske Optagelse fra<em&gt; Xenopus</em&gt; Nerve-muskel Co-kulturer

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

High-Resolution Kvantitativ immunoguld Analyse af membranreceptorer på retinale Ribbon synapser

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

Peering på Brain Polysomer med Atomic force mikroskopi

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyse Synaptic Graduering af<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotoreceptorer efter Udsættelse for Langvarig Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...