Name: preparation of newborn rat brain tissue for ultrastructural morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals
Uploaded: 2019-06-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals at JoVE.com

この原稿は、NIH/NIGMS K08 123321 (to N.L.) とバージニア大学麻酔科からの資金によって支えられました。研究者は Erisir (Alev、バージニア大学、シャーロッツビル、VA) に感謝し、TEM での優れたトレーニングと技術支援のために、そして、彼女の貴重な原稿批評のためにありがとうと思っています。また、バージニア大学の高度電子顕微鏡検査施設では、検体の断面化と染色後の技術支援にも感謝しています。

すべての研究は、バージニア大学 (シャーロッツビル、VA) の機関の動物のケアと使用委員会によって承認され、国立衛生研究所のガイドラインに従って実施しました。
1. 血管灌流による固定
注:ラット脳血管灌流のための方法の一般的な説明は、このジャーナル13で既に詳述されており、このプロトコルの範囲を超えてい...

<ol>
	<li>Lunardi, N., Oklopcic, A., Prillaman, M., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+exposure+to+general+anesthesia+disrupts+spatial+organization+of+presynaptic+vesicles+in+nerve+terminals+of+the+developing+subiculum.">Early exposure to general anesthesia disrupts spatial organization of presynaptic vesicles in nerve terminals of the developing subiculum.</a> Molecular Neurobiology. 52 (2), 942-951 (2015).</li><li>Lunardi, N., Ori, C., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+anesthesia+causes+long-lasting+disturbances+in+the+ultrastructural+properties+of+developing+synapses+in+young+rats.">General anesthesia causes long-lasting disturbances in the ultrastructural properties of developing synapses in young rats.</a> Neurotoxicity Research. 17 (2), 179-188 (2010).</li><li>Sanchez, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+anesthesia+causes+long-term+impairment+of+mitochondrial+morphogenesis+and+synaptic+transmission+in+developing+rat+brain.">General anesthesia causes long-term impairment of mitochondrial morphogenesis and synaptic transmission in developing rat brain.</a> Anesthesiology. 115 (5), 992-1002 (2011).</li><li>Boscolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+abolishment+of+anesthesia-induced+cognitive+impairment+by+timely+protection+of+mitochondria+in+the+developing+rat+brain:+the+importance+of+free+oxygen+radicals+and+mitochondria+integrity.">The abolishment of anesthesia-induced cognitive impairment by timely protection of mitochondria in the developing rat brain: the importance of free oxygen radicals and mitochondria integrity.</a> Neurobiology of Disease. 45 (3), 1031-1041 (2012).</li><li>Aghajanian, G. K., Bloom, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+of+synaptic+junctions+in+developing+rat+brain:+a+quantitative+electron+microscopy+study.">The formation of synaptic junctions in developing rat brain: a quantitative electron microscopy study.</a> Brain Research. 6 (4), 716-727 (1967).</li><li>Akert, K., Sandri, C., Santini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+the+Maillet+method+for+cytochemical+studies+of+synapses.">Significance of the Maillet method for cytochemical studies of synapses.</a> Golgi centennial symposium; Perspectives in Neurobiology. , 387-399 (1975).</li><li>Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemistry+of+synapses:+selective+staining+for+electron+microscopy.">Cytochemistry of synapses: selective staining for electron microscopy.</a> Science. 154 (3756), 1575-1577 (1966).</li><li>Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+structural+and+cytochemical+analysis+of+the+staining+of+synaptic+junctions+with+phosphotungstic+acid.">Fine structural and cytochemical analysis of the staining of synaptic junctions with phosphotungstic acid.</a> Journal of Ultrastructure Research. 22 (5-6), 361-375 (1968).</li><li>Burry, R. W., Lasher, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+electron+microscopy+study+of+synapse+formation+in+dispersed+cell+cultures+of+rat+cerebellum+stained+either+by+O-UL+or+by+E-PTA.">A quantitative electron microscopy study of synapse formation in dispersed cell cultures of rat cerebellum stained either by O-UL or by E-PTA.</a> Brain Research. 147 (1), 1-15 (1978).</li><li>Pellegrino de Iraldi, A., Suburo, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+staining+of+synaptic+vesicles+using+the+Champy-Maillet+technique.">Electron staining of synaptic vesicles using the Champy-Maillet technique.</a> Journal of Microscopy. 91 (2), 99-103 (1970).</li><li>Pfenninger, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytochemistry+of+synaptic+densities.+I.+An+analysis+of+the+bismuth+iodide+impregnation+method.">The cytochemistry of synaptic densities. I. An analysis of the bismuth iodide impregnation method.</a> Journal of Ultrastructural Research. 34 (1), 103-122 (1971).</li><li>Hayat, M. A., Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+fixation.">Chemical fixation.</a> Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications. , 4-84 (2000).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visual Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Hayat, M. A., Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fixation for electron microscopy. , (1981).</li><li>Behrman, E. J., et al., Revel, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemistry+of+osmium+tetroxide+fixation.">The chemistry of osmium tetroxide fixation.</a> The science of biological specimen preparation for microscopy and microanalysis. , 1-5 (1983).</li><li>Nielson, A. J., Griffith, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactions+of+osmium+tetroxide+with+protein+side+chains+and+unsaturated+lipids.">Reactions of osmium tetroxide with protein side chains and unsaturated lipids.</a> Journal of the Chemical Society, Dalton Transactions. (6), 1084-1088 (1979).</li><li>Nielson, A. J., Griffith, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+fixation+by+osmium+tetroxide.+A+possible+role+for+proteins.">Tissue fixation by osmium tetroxide. A possible role for proteins.</a> Journal of Hystochemistry &amp; Cytochemistry. 27 (5), 997-999 (1979).</li><li>Hanker, J. S., Deb, C., Wasserkrug, H. L., Seligman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+tissue+for+light+and+electron+microscopy+by+bridging+metals+with+multidentate+ligands.">Staining tissue for light and electron microscopy by bridging metals with multidentate ligands.</a> Science. 152 (3729), 1631-1634 (1966).</li><li>Zobel, C. R., Beer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+heavy+metal+salts+as+electron+stains.">The use of heavy metal salts as electron stains.</a> International Review of Cytology. 18, 363-400 (1965).</li><li>Silva, M. T., Guerra, F. C., Magalhaes, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fixative+action+of+uranyl+acetate+in+electron+microscopy.">The fixative action of uranyl acetate in electron microscopy.</a> Experientia. 24 (10), 1074 (1968).</li><li>Terzakis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uranyl+acetate,+a+stain+and+a+fixative.">Uranyl acetate, a stain and a fixative.</a> Journal of Ultrastructural Research. 22 (1-2), 168-184 (1968).</li><li>Feldman, I., Jones, J., Cross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chelation+of+uranyl+ions+by+adenine+nucleotides.">Chelation of uranyl ions by adenine nucleotides.</a> Journal of the American Chemical Society. 89 (1), 49-53 (1967).</li><li>Shah, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+uranyl+ions+with+phospholipid+and+cholesterol+monolayer.">Interaction of uranyl ions with phospholipid and cholesterol monolayer.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 29 (2), 210-215 (1969).</li><li>Daems, W. T., Persijn, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Section+staining+with+heavy+metals+of+osmium-fixed+and+formol-fixed+mouse+liver+tissue.">Section staining with heavy metals of osmium-fixed and formol-fixed mouse liver tissue.</a> Journal. Royal Microscopical Society. 81 (pts 3&#38;4), 199-201 (1963).</li><li>Lombardi, L., Prenna, G., Okolicsanyi, L., Gautier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+staining+with+uranyl+acetate:+possible+role+of+free+amino+groups.">Electron staining with uranyl acetate: possible role of free amino groups.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 19 (3), 161-168 (1971).</li><li>Cattini, P. A., Davies, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+lead+citrate+staining+of+thin+sections+for+electron+microscopy.">Kinetics of lead citrate staining of thin sections for electron microscopy.</a> Stain Technology. 58 (1), 29-40 (1983).</li><li>Reynolds, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+lead+citrate+at+high+pH+as+an+electron+opaque+stain+in+electron+microscopy.">The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).</li><li>Cattini, P. A., Davies, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+kinetics+of+uranyl+acetate+and+phosphotungstic+acid+staining+of+chromatin+in+thin+sections+for+electron+microscopy.">Observations on the kinetics of uranyl acetate and phosphotungstic acid staining of chromatin in thin sections for electron microscopy.</a> Stain Technology. 59 (5), 291-304 (1984).</li><li>Derksen, J. W., Meekes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+staining+of+nucleic+acid+containing+structures+by+uranyl+acetate-lead+citrate.">Selective staining of nucleic acid containing structures by uranyl acetate-lead citrate.</a> Micron and Microscopica Acta. 15 (1), 55-58 (1984).</li><li>Frasca, J. M., Parks, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+routine+technique+for+double-staining+ultrathin+sections+using+uranyl+and+lead+salts.">A routine technique for double-staining ultrathin sections using uranyl and lead salts.</a> Journal of Cell Biology. 25 (1), 157-161 (1965).</li><li>Hanaichi, T., Sato, T., Iwamoto, T., Malavasi-Yamashiro, J., Hoshino, M., Mizuno, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stable+lead+by+modification+of+Sato&#8217;s+method.">A stable lead by modification of Sato&#8217;s method.</a> Journal of Electron Microscopy. 35 (3), 304-306 (1986).</li><li>Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+method+for+lead+staining+of+thin+sections.">A modified method for lead staining of thin sections.</a> Journal of Electron Microscopy. 17 (2), 158-159 (1968).</li><li>Lever, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+staining+tissues+with+lead+for+electron+microscopy.">A method of staining tissues with lead for electron microscopy.</a> Nature. , 810-811 (1960).</li><li>Derek, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self+organization+of+the+Escherichia+Coli+chemotaxis+network+imaged+with+super-resolution+light+microscopy.">Self organization of the Escherichia Coli chemotaxis network imaged with super-resolution light microscopy.</a> Public Library of Science Biology. 7 (6), e1000137 (2009).</li><li>Richards, J. G., Heyn, C., Forssmann, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+histochemistry+of+nervous+tissue.">Ultrastructural histochemistry of nervous tissue.</a> Techniques in Neuroanatomical Research. , 277-292 (1981).</li><li>Wood, R. L., Luft, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+the+buffer+system+on+fixation+with+osmium+tetroxide.">The influence of the buffer system on fixation with osmium tetroxide.</a> Journal of Ultrastructural Research. 12 (1-2), 22-45 (1965).</li><li>Louw, J., Williams, K., Harper, I. S., Walfe-Coote, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+dense+artifactual+deposits+in+tissue+sections:+the+role+of+ethanol,+uranyl+acetate+and+phosphate+buffer.">Electron dense artifactual deposits in tissue sections: the role of ethanol, uranyl acetate and phosphate buffer.</a> Stain Technology. 65 (5), 243-250 (1990).</li></ol>

TEM のための試料調製中の組織切片の処理は、かなりの程度の技巧、濃度および忍耐を必要とする。マイクロピペットを使用して溶液を添加および除去する場合、試料は表面張力によってピペットチップに吸入される可能性があるので、ピペットによる組織損傷を避けるために細心の注意が必要である。また、脱水シーケンスの特定のステップは、1分として迅速であることができるので、オ?...

我々は、新生ラット脳組織の調製方法について、神経ターミナル1、2におけるシナプス小胞空間分布の詳細な morphometric 分析のための高品質の電子顕微鏡写真を得るために記述する。これらの方法に従って検体を処理することによって得ることができるハイコントラスト顕微鏡写真は、多数の細胞成分およびそれらの寸法構造関係3,4の詳細な形態を研究するためにも使用することができる。
透過型電子顕微鏡 (TEM) は、オルガネラや他の細胞構造の形態を定量的に研究する強力なツールです。この十年のように、高圧凍結による cryofixation を除いて、免疫タグ付けなしで脂質膜およびオルガネラの同じ程度の分解能を提供できる他の調査方法はない。しかし、凍結置換技術は広く使用されておらず、通常は高価な装置と長い準備時間を必要とします。
TEM の高い分解力を活かすためには、最適な試料調製が最も重要です。検体調製の主な目的は、生体状態からの変化を最小限に抑えて組織構造を保存し、検体のコントラストを高め、処理中の細胞成分の抽出や電子への曝露に対する組織の安定化を図ることである。ビーム。TEM のティッシュの準備のための多数の議定書は長年にわたっていくつかの実験室によって導入され、完成した。それらの多くは、シナプス小胞5、6、7、8、9、10、11の最適な可視化のための方法に焦点を当てています。現在使用されている多くの確立された、金の標準的な方法の中で、私達は最適のティッシュの構造を維持することを目指す化学固定、ポスト固定、en ブロックの染色、連続的な脱水、樹脂の埋め込みおよびポストの染色のためのプロシージャを選びました優れた画像コントラストを実現します。注目すべきは、新生児ラット脳組織で作業する場合、微細 ultrastructure の保存は特に困難な場合があります。実際には、非常に若い動物の中枢神経系は、成体の脳よりも高い水分含量、細胞外空間のより顕著な拡大、および細胞12間のより緩い接続によって特徴付けられる。これにより、新生ラット脳組織はオスモル濃度の変化に深く敏感であり、異なる張度12の逐次溶液を通して処理されたときに、artifactual 収縮および/または腫脹を生じやすい。したがって、我々の方法は、ラット新生児の脳のそれにできるだけ近いオスモル濃度の標本処理のためのソリューションを採用しています。私たちの目標は、神経末端のシナプス小胞空間分布を定量的に評価する高品質・高分解能の電子顕微鏡像を得ることでした。具体的には、神経終末内の小胞の数、シナプス前の形質膜からのシナプスの小胞の距離、シナプス前膜に停泊している小胞の数、シナプス小胞の大きさ、間小胞距離1.
十分な化学的固定は、シナプス小胞形態および空間的組織を研究するために必要な形態学的詳細を提供することができる高品質の電子顕微鏡写真を得るための前提条件である。固定のいくつかのモードが存在するが、血管灌流による脳組織の固定は、他の方法より明らかに優れている。血管灌流による固定は、全身循環の停止の直後に始まるので、脳組織の脱酸素とタンパク質の固定剤との架橋の間の間隔が短くなり、細胞内での最小変化が生じる構造。さらに、それは、血管床から細胞外および細胞区画12、13、14までの固定液の急速な流れのために、迅速かつ均一な浸透を達成する。グルタルアルデヒドとの主な固定は、続いて、四酸化オスミウムとの二次固定 (後固定) によって、微細構造15,16,17の優れた保存をもたらす。グルタルアルデヒドとパラホルムアルデヒドの混合物は、組織12へのより迅速な浸透の追加の利点を有する。
生物学的組織は、樹脂マトリックスを支持せずに薄い切片に切断するのに十分な剛性がないので、薄い断面化する前に培地に埋め込まれている必要がある。水非混和性エポキシ樹脂は、TEM に埋め込み媒体として一般的に使用されている。このタイプのマトリックスを使用する場合、すべての試料の自由水は、樹脂浸潤の前に有機溶媒に交換する必要があります。水は、エタノールおよび/またはアセトン12の上昇濃度の一連の溶液を通して標本を通過させることによって除去される。この議定書では、標本は柔軟な aclar シートの間で最初に平らに埋め込まれ、次にカプセルに埋め込まれる。最終結果は円筒形樹脂ブロックの先端に位置する組織で、ミクロトームの断面化中に生じる振動の影響を最小限にする理想的な形状を有しています。
内因性組織のコントラストを高めるために重金属で染色することは、試料調製のもう一つの重要な側面です。TEM における画像コントラストは、組織内の原子による電子散乱によるものである。しかし、生物学的材料は、主に、低原子量分子 (すなわち、炭素、水素、酸素および窒素) からなる。したがって、十分な散乱コントラストの生成は、組織の細胞成分に高い原子量の原子を組み込むことを必要とする。これは、重金属12、18、19を用いた試料の染色によって達成される。脂質に強く結合するオスミウム四酸化、ウラン、鉛は、電子染色として用いられる最も一般的な重金属です。
オスミウム (原子番号 76) は、存在する最も密金属の一つです。それは、固定剤および染色剤の両方であり、TEM におけるその主な役割は、信頼性の高い定着性12としてである。使用中の様々な固定プロトコルの中で、オスミウムに続くグルタルアルデヒドとの二重固定の方法は、検体調製中の細胞成分の抽出を減少させるのに最も効果的である。これらの2つの固定剤は、異なる種類の分子、特にタンパク質および脂質の最大数を安定化するために使用され、組織 ultrastructure の優れた保存をもたらす12、14、15、16,17.
ウラン (原子番号 92) は、電子染色として使用される最も重い金属であり、最も典型的には酢酸ウラニルの形態である。オスミウムと同様に、それは、染色剤および固定剤として作用し、TEM におけるその主な役割は、染色20、21としてのものである。核酸含有および膜構造は、アルデヒド固定組織22、23においてウラニル塩で強くかつ優先的に染色される。Osmication および脱水前のウラニルによる組織の治療は、膜および核酸含有構造の安定化、ならびに強化されたコントラストをもたらし、そして、そうではないいくつかの構造的な細部の同定を可能にする、オスミウム単独で染色された検体においては12,24,25に容易に検出することができる。酢酸ウラニルは、osmication24中に脂質膜上に堆積した低オスミウムと組み合わせることで微細な構造を安定化させることが考えられる。最大コントラストは、ウラニル酢酸が埋め込む前に適用され、薄いセクション12でポストステインとして達成されます。
鉛 (原子番号 82) TEM のために使用される最も一般的な染色であり、主に薄い切片の後染色のために採用されています。鉛塩は、高い電子不透明度を有し、膜、核および細胞質蛋白質、核酸及びグリコーゲン26、27を含む細胞構造の広い範囲のための親和性を示します。二重染色法が採用されている場合 (すなわち、ウラニル酢酸塩による染色は、鉛による治療が続く)、後者はウラニル酢酸染色の開発者として作用する。例えば、グルタルアルデヒドによって固定されたクロマチンのリードポスト染色では、ウラニルの酢酸摂取量は28、29、30、31、32の3倍に増加します。鉛はまた、オスミウムなどの他の金属によって付与される染色を増強する。鉛塩は、減少したオスミウム33の存在下でホスファチドの極性基に付着することにより、オスミウム固定組織の膜を染色すると考えられている。酢酸ウラニルおよび鉛の両方による染色の潜在的な欠点は、特に長期間にわたって、多くの異なる構造的な要素が等しくかつ非特異的に染色され、したがって、互いに容易に区別できない可能性があることである12.
光学超解像の写真活性化された局在の顕微鏡検査のような代わりとなる光源の最近の導入は、かなり改善される光顕微鏡検査の決断を持っている34。しかし、光顕微鏡は、個々に標識されたタンパク質または酵素を視覚化するために組織化と免疫 cytochemical 法に依存しているため、TEM の力は、一度にすべての構造要素を表示するために、そのままの綿密な研究のために卓越しています。組織構造の形態と寸法関係特に、他の技術は、シナプス前神経 boutons におけるシナプス小胞分布の morphometric 分析を行うために必要な形態学的詳細を提供することができる。それにもかかわらず、電子顕微鏡写真は、生物が死亡した後に組織の構造を捕捉し、したがって、シナプス前小胞輸送およびエキソサイトーシスのダイナミクスに関する情報を提供することができないことに注意することが重要である。したがって、FM 色素ライブイメージングやパッチクランプ電気生理学などの他のツールは、主な目的がシナプス小胞輸送およびエキソサイトーシスの動的および/または機能的側面を研究することであると考える必要があります。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% Osmium tetroxide</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19170</td>
			<td>acqueous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16310</td>
			<td>EM grade, acqueous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aclar 33 C embedding film</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50425-25</td>
			<td>7.8 mil thickness, size 8&#34;x10&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEEM capsule holder</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69916</td>
			<td>holds size &#34;00&#34; capsules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEEM embedding capsules</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70021</td>
			<td>size &#34;00&#34;, flat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butler block trimmer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69945-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camel hair paint brush</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>65576-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disc punch</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>77850-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embed 812 kit</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead citrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead nitrate</td>
			<td>Electron microscopy Sciences</td>
			<td>17900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica UC7 ultracut microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scale</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>62091-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19208</td>
			<td>EM grade, granular</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Thelco laboratory oven</td>
			<td>Thelco</td>
			<td>51221159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StatMark pen</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72109-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrode solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>11760-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of newborn rat brain tissue for ultrastructural morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals

私たちの研究室や他の多くは、シナプス小胞の形態と空間的組織化を研究するために、透過型電子顕微鏡検査の高い分解力を利用しています。シナプス前小胞分布の定量分析に必要な形態学的詳細の程度を得られる高品質の電子顕微鏡写真を得るためには、最適な試料調製が重要である。化学的固定は、試料調製のプロセスの第一歩であり、微細な ultrastructure を維持するために最も重要です。グルタルアルデヒド溶液を用いた血管固定、続いて四酸化オスミウムを用いたビブラトーム切片標本の治療により、分子の最大数、特にタンパク質と脂質を安定化し、優れた保存をもたらすの ultrastructure。その後、組織は、切片、シーケンシャル脱水および樹脂包埋で処理されます。酢酸ウラニル (すなわち、樹脂埋め込み前のビブラトームによる組織の染色) による En ブロック染色は、内因性のコントラストを高め、検体処理中の抽出に対して細胞成分を安定化させます。コントラストは、超薄断面の後染色として酢酸ウラニルを適用することによってさらに増加させることができる。酢酸ウラニル処理後のクエン酸鉛を用いた極薄の切片の二重染色により、ウラニルへの鉛の選択的結合による核酸含有構造の電子不透過性を強化することにより、画像分解能も向上させる。透過型電子顕微鏡法は、シナプスベシクルの形態学的詳細の特徴付けと、末端 bouton におけるそれらのサイズおよび空間的組織の定量化のための強力なツールである。しかし、固定された組織を使用しているため、透過型電子顕微鏡は、生きているプロセスや進化する過程に関する間接情報しか提供できません。したがって、主な目的は、シナプスの小胞の人身売買およびエキソサイトーシスの動的または機能的側面を研究することである場合、他の技術を考慮する必要があります。

TEM 用の検体の保存が良好または不良の指標として主に認められている一般的な基準が確立されている。これらの基準は、4つの選択された電子顕微鏡写真 (最適な調製の2つの例、欠陥製剤の2つの例) において、このプロトコールに記載された方法に従って若年ラット脳組織を処置することによって得られる。
一般に、良質の電子顕微鏡写真は、整然とした、明瞭で、全体...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals at JoVE.com

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

我々は、新生ラット脳組織を処理して、神経終末におけるシナプス小胞分布の morphometric 分析のための高分解能電子顕微鏡写真を得るための手順を説明する。これらの方法で得られた顕微鏡写真は、多数の他の細胞成分およびそれらの寸法構造関係の形態を研究するためにも使用することができる。

Ultrastructural のための新生ラット脳組織の調製 Morphometric 神経末端におけるシナプス小胞分布の解析

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial ...

透過型電子顕微鏡のための組織調製のためのいくつかの既存のプロトコルの中で、シナプス前末端でシナプス小胞分布の形態測定分析を行うために最適な構造保存と高解像度顕微鏡を得る方法を選択しました。これらの方法で得られた高コントラスト画像は、シナプス前膜にドッキングされた小胞のシナプス前膜数と小胞間距離からのシナプス小胞の距離などのパラメータを定量化することを可能にする。これらのパラメータはすべてシナプス機能を示しています。シナプス小胞の空間組織における変化はシナプス機能の破壊に関連している可能性があるため、これらの方法はシナプス開発に対する全身麻酔薬の影響を調べるために使用されてきた。これらの方法は、シナプスの詳細な形態に対する薬物または治療の効果を調べ、その機能に関する洞察を提供するためにも使用できる。血管灌流を介してパラホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドで以前に固定されたラット脳切片の後の固定のためのオスミウム四酸化症を準備することで始めます.四酸化オスミウムで処理した後、セクションが硬くなります。したがって、組織の取り扱いはそれ以来注意を必要とします。また、オスミウムを追加する前に、任意の折り畳みが組織骨折をもたらす可能性が高いように、あなたのセクションが平らにされていることを確認してください。4%オスミウム四酸化窒素と水の1つの5ミリリットルガラスアンプルを開き、茶色のガラス瓶の中に落とします。0.2モルリン酸緩衝液の5ミリリットルを加え、0.1モルリン酸緩衝液の追加10ミリリットルを加えて、1%の最終溶液を達成する。長い針を取り付けた20ミリリットルのシリンジを使用して1%オスミウム四酸化を引き上げ、オスミウム四酸化オスミウムをアルミ箔で覆われた茶色のガラス瓶に加えます。標本が展開され、平らにされていることを確認した後、標本バイアルに1%オスミウム四酸化および0.1モルPBを加える。試料をオスミウム四酸化スに室温で1時間インキュベートする。インキュベーションが終了した後にマイクロピペットで四酸化オスミウムを抽出し、プロトコルに記載されているようにセクションをすすいでください。酢酸ウラニルを調製するには、攪拌板に100ミリリットルの70%エタノールを含む200ミリリットルの体積ガラスフラスコを置きます。フラスコに酢酸ウラニルの4グラムを追加し、光による沈殿を防ぐためにアルミニウム箔を包み、連続的に攪拌します。50%エタノールでセクションを脱水します。4%の酢酸を1時間調製した染色し、原稿に記載されているように連続脱水およびすすいで続ける。60ミリリットルのギャージ注射器から注射器プランジャーを取り出し、安全針でキャップします。開いた側を上にしてシリンジを置き、樹脂ミックスの各成分を1つずつ加えます。525マイクロリットルのDMP30をピペットで追加して仕上げ。DMPが非常に粘性であるように非常にゆっくりとピペットのプランジャーを移動します。プランジャーを注射器に戻します。シリンジを数回反転して内容を混ぜます。色は黄色から琥珀色に変わります。注射器の中の空気を避難させる。その後、少なくとも30分間連続的に揺れるロッカーの上に置きます。1ボリュームのエポキシ樹脂と1ボリュームのアセトンをシンチレーションバイアルに加え、振って混ぜます。アセトンの蒸発を避けるために、最後のアセトンリンスを覆った後、組織セクション上のアセトン混合物に1つの樹脂にこれを適用します。2~4時間後に樹脂とアセトンの混合物を1対1で取り出し、フルレジンに交換し、4時間インキュベートします。すべての樹脂廃棄物をボンネットの下の回収容器に入れて重合し、後で処分する。透明なポリクロロトリフルオロエチレンフィルムを2枚切り、70%エタノールで拭きます。セクションの各側面に少なくとも1.5センチメートルのティッシュフリープラスチックが存在するようにトリミングし、同じ幅を持っていますが、上のシートの高さは底面の約2/3であることを確認します。ゆっくりとバイアルを傾け、細かいラクダの絵筆と柔軟なマイクロヘラを使用して、標本を底から非常に穏やかに持ち上げます。その後、慎重にバイアル壁に沿ってセクションを移動し、下部PCTFEシートに転送します。余分な樹脂をマイクロヘラで取り除き、上のシートで標本をそっと覆います。組織部分に直接圧力をかけずに閉じ込められた気泡を静かに押し出し、余分な樹脂を拭き取ります。溶剤耐性ペンを使用してシートにラベルを付け、オーブンに2〜3日間摂氏60度で置き、重合します。サンドイッチされたPCTFEシートをそっと引き離して開きます。溶剤耐性ペンを使用して、組織の近くに付着したシートの側面をマークします。ディスクパンチを使用して、ペンマークがパンチアウト組織の一部であることを確認するセクションの円サンプルを取得します。試料に光が光を当てたとき、ペンマークが輝きます。埋め込みカプセル側のキャップをカプセルホルダーの上に置きます。キャップに樹脂を一滴置き、パンチドディスクをキャップの内側に挿入し、組織セクションを上に向けます。穏やかなコルクスクリューの動きを使用してキャップにカプセルを挿入します。細かいピンセットを使用して、印刷された長さ2センチメートルの紙のラベルをカプセルに転がし、カプセルの側壁の湾曲に収まることを確認します。カプセルの中に埋め込み樹脂を注ぎ、カプセルの端まで満たし、尖った木製の棒を使用して組織標本を底に押し下げます。カプセルをオーブンに60°Cで2~3日間置き、重合します。そして、プロトコルに記載されているように、切り分けと染色を続行します。神経細胞構造の十分な保存の電子顕微鏡写真は、破断のない層状細胞膜を示す。細胞質は最終的に粒状で、空のスペースはありません。ミトコンドリアは、保存された外側の二重膜と無傷の内部クリステで腫れたり縮めたりしていません。シナプス小胞を可視化し、シナプス前膜からの距離を測定するためには、神経の超構造と微細な形態学的詳細の最適な保存が不可欠です。シナプス小胞は、切れ目のない単一の膜によって明確かつ並べられるべきです。シナプス小胞分布の形態測定解析を容易にするためには、シナプス前膜と心内膜は、その連続性に平行に保存されるべきである。組織構造の欠陥保存の電子顕微鏡写真は、神経細胞膜の歪みや破損、および著しく拡大した細胞外空間の存在を示す。ミトコンドリアは膨張し、クリステが腫れているように見える。欠陥組織構造保存の別の例では、細胞外空間が拡大した細かい粒状の細胞質物質の代わりに、細胞質内に大きな白い空きスペースがあった。全体として人工膜はグルタルアルデヒドとの固定中に脂質の動員に起因する可能性が高い。若い脳組織を働くとき、新生児ラットの脳の中にできるだけ近い間にトニシティを保ち、関節の実際の組織の収縮および腫れを最小限に抑えるように、すべての溶液のための溶媒として1モルリン酸塩緩衝液を使用する。これらの方法で得られた顕微鏡写真は、シナプス小胞以外の多くの細胞成分の詳細な形態および次元構造関係を研究するために使用することができる。例えば、ミトコンドリア、ゴルジ装置および核クロマチンが挙げられる。このプロトコルのいくつかのステップは、有毒である可能性のある化学物質を必要とします。常にヒュームフードの下で動作し、アルデヒド、オスミウム、ウラン、鉛化合物を扱うときは、個人的な保護具を着用してください。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

スチリル染料の光変換を使用して、シナプス小胞プールの勉強

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric ÃƒÅ½Ã‚Â²-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

β-アミロイドオリゴマーの調製 1から42まで</sub海馬スライスでのシナプス可塑性の減損の>と誘導

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

シナプス伝達とイメージシナプス前終末を研究するために齧歯類の脳スライスからの神経細胞のVibrodissociation

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

FM染料を用いて培養小脳顆粒神経細胞のシナプス小胞プールの補充の定量分析

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

パッチクランプキャパシタンス測定とCa 2 +</sup網膜スライスにおける単一神経終末で>イメージング

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

からの同時プリとポストシナプスの電気生理学的記録<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;神経筋共培養

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

網膜リボンシナプスにおける膜受容体の高分解能定量的イムノゴールド分析

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

原子間力顕微鏡で脳ポリソームでピアリング

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

のシナプス変調を分析<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;長時間の光照射後の感光体

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...