Name: preparation of newborn rat brain tissue for ultrastructural morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals
Uploaded: 2019-06-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals at JoVE.com

Dette manuskriptet ble støttet av NIH/NIGMS K08 123321 (til N.L.) og av midler fra Department of Anesthesiology ved University of Virginia. Forfatterne ønsker å takke Alev Erisir (Department of Biology, University of Virginia, Charlottesville, VA) for utmerket opplæring og teknisk assistanse med TEM, og for hennes uvurderlige manuskript kritikk. Forfatterne takker også Advanced Electron mikroskopi anlegget ved University of Virginia for teknisk assistanse med prøve snitting og post-farging.

Alle studier ble godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee ved University of Virginia (Charlottesville, VA) og gjennomføres i samsvar med National Institutes of Health retningslinjer.
1. fiksering av vaskulær
Merk: En generell beskrivelse av metoden for rotte hjernen vaskulær blod er allerede beskrevet i denne tidsskriftet13 og er utenfor omfanget av denne protokollen. Men følgende trinn er spesifikke for uta...

<ol>
	<li>Lunardi, N., Oklopcic, A., Prillaman, M., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+exposure+to+general+anesthesia+disrupts+spatial+organization+of+presynaptic+vesicles+in+nerve+terminals+of+the+developing+subiculum.">Early exposure to general anesthesia disrupts spatial organization of presynaptic vesicles in nerve terminals of the developing subiculum.</a> Molecular Neurobiology. 52 (2), 942-951 (2015).</li><li>Lunardi, N., Ori, C., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+anesthesia+causes+long-lasting+disturbances+in+the+ultrastructural+properties+of+developing+synapses+in+young+rats.">General anesthesia causes long-lasting disturbances in the ultrastructural properties of developing synapses in young rats.</a> Neurotoxicity Research. 17 (2), 179-188 (2010).</li><li>Sanchez, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+anesthesia+causes+long-term+impairment+of+mitochondrial+morphogenesis+and+synaptic+transmission+in+developing+rat+brain.">General anesthesia causes long-term impairment of mitochondrial morphogenesis and synaptic transmission in developing rat brain.</a> Anesthesiology. 115 (5), 992-1002 (2011).</li><li>Boscolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+abolishment+of+anesthesia-induced+cognitive+impairment+by+timely+protection+of+mitochondria+in+the+developing+rat+brain:+the+importance+of+free+oxygen+radicals+and+mitochondria+integrity.">The abolishment of anesthesia-induced cognitive impairment by timely protection of mitochondria in the developing rat brain: the importance of free oxygen radicals and mitochondria integrity.</a> Neurobiology of Disease. 45 (3), 1031-1041 (2012).</li><li>Aghajanian, G. K., Bloom, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+of+synaptic+junctions+in+developing+rat+brain:+a+quantitative+electron+microscopy+study.">The formation of synaptic junctions in developing rat brain: a quantitative electron microscopy study.</a> Brain Research. 6 (4), 716-727 (1967).</li><li>Akert, K., Sandri, C., Santini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+the+Maillet+method+for+cytochemical+studies+of+synapses.">Significance of the Maillet method for cytochemical studies of synapses.</a> Golgi centennial symposium; Perspectives in Neurobiology. , 387-399 (1975).</li><li>Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemistry+of+synapses:+selective+staining+for+electron+microscopy.">Cytochemistry of synapses: selective staining for electron microscopy.</a> Science. 154 (3756), 1575-1577 (1966).</li><li>Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+structural+and+cytochemical+analysis+of+the+staining+of+synaptic+junctions+with+phosphotungstic+acid.">Fine structural and cytochemical analysis of the staining of synaptic junctions with phosphotungstic acid.</a> Journal of Ultrastructure Research. 22 (5-6), 361-375 (1968).</li><li>Burry, R. W., Lasher, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+electron+microscopy+study+of+synapse+formation+in+dispersed+cell+cultures+of+rat+cerebellum+stained+either+by+O-UL+or+by+E-PTA.">A quantitative electron microscopy study of synapse formation in dispersed cell cultures of rat cerebellum stained either by O-UL or by E-PTA.</a> Brain Research. 147 (1), 1-15 (1978).</li><li>Pellegrino de Iraldi, A., Suburo, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+staining+of+synaptic+vesicles+using+the+Champy-Maillet+technique.">Electron staining of synaptic vesicles using the Champy-Maillet technique.</a> Journal of Microscopy. 91 (2), 99-103 (1970).</li><li>Pfenninger, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytochemistry+of+synaptic+densities.+I.+An+analysis+of+the+bismuth+iodide+impregnation+method.">The cytochemistry of synaptic densities. I. An analysis of the bismuth iodide impregnation method.</a> Journal of Ultrastructural Research. 34 (1), 103-122 (1971).</li><li>Hayat, M. A., Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+fixation.">Chemical fixation.</a> Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications. , 4-84 (2000).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visual Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Hayat, M. A., Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fixation for electron microscopy. , (1981).</li><li>Behrman, E. J., et al., Revel, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemistry+of+osmium+tetroxide+fixation.">The chemistry of osmium tetroxide fixation.</a> The science of biological specimen preparation for microscopy and microanalysis. , 1-5 (1983).</li><li>Nielson, A. J., Griffith, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactions+of+osmium+tetroxide+with+protein+side+chains+and+unsaturated+lipids.">Reactions of osmium tetroxide with protein side chains and unsaturated lipids.</a> Journal of the Chemical Society, Dalton Transactions. (6), 1084-1088 (1979).</li><li>Nielson, A. J., Griffith, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+fixation+by+osmium+tetroxide.+A+possible+role+for+proteins.">Tissue fixation by osmium tetroxide. A possible role for proteins.</a> Journal of Hystochemistry &amp; Cytochemistry. 27 (5), 997-999 (1979).</li><li>Hanker, J. S., Deb, C., Wasserkrug, H. L., Seligman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+tissue+for+light+and+electron+microscopy+by+bridging+metals+with+multidentate+ligands.">Staining tissue for light and electron microscopy by bridging metals with multidentate ligands.</a> Science. 152 (3729), 1631-1634 (1966).</li><li>Zobel, C. R., Beer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+heavy+metal+salts+as+electron+stains.">The use of heavy metal salts as electron stains.</a> International Review of Cytology. 18, 363-400 (1965).</li><li>Silva, M. T., Guerra, F. C., Magalhaes, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fixative+action+of+uranyl+acetate+in+electron+microscopy.">The fixative action of uranyl acetate in electron microscopy.</a> Experientia. 24 (10), 1074 (1968).</li><li>Terzakis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uranyl+acetate,+a+stain+and+a+fixative.">Uranyl acetate, a stain and a fixative.</a> Journal of Ultrastructural Research. 22 (1-2), 168-184 (1968).</li><li>Feldman, I., Jones, J., Cross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chelation+of+uranyl+ions+by+adenine+nucleotides.">Chelation of uranyl ions by adenine nucleotides.</a> Journal of the American Chemical Society. 89 (1), 49-53 (1967).</li><li>Shah, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+uranyl+ions+with+phospholipid+and+cholesterol+monolayer.">Interaction of uranyl ions with phospholipid and cholesterol monolayer.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 29 (2), 210-215 (1969).</li><li>Daems, W. T., Persijn, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Section+staining+with+heavy+metals+of+osmium-fixed+and+formol-fixed+mouse+liver+tissue.">Section staining with heavy metals of osmium-fixed and formol-fixed mouse liver tissue.</a> Journal. Royal Microscopical Society. 81 (pts 3&#38;4), 199-201 (1963).</li><li>Lombardi, L., Prenna, G., Okolicsanyi, L., Gautier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+staining+with+uranyl+acetate:+possible+role+of+free+amino+groups.">Electron staining with uranyl acetate: possible role of free amino groups.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 19 (3), 161-168 (1971).</li><li>Cattini, P. A., Davies, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+lead+citrate+staining+of+thin+sections+for+electron+microscopy.">Kinetics of lead citrate staining of thin sections for electron microscopy.</a> Stain Technology. 58 (1), 29-40 (1983).</li><li>Reynolds, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+lead+citrate+at+high+pH+as+an+electron+opaque+stain+in+electron+microscopy.">The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).</li><li>Cattini, P. A., Davies, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+kinetics+of+uranyl+acetate+and+phosphotungstic+acid+staining+of+chromatin+in+thin+sections+for+electron+microscopy.">Observations on the kinetics of uranyl acetate and phosphotungstic acid staining of chromatin in thin sections for electron microscopy.</a> Stain Technology. 59 (5), 291-304 (1984).</li><li>Derksen, J. W., Meekes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+staining+of+nucleic+acid+containing+structures+by+uranyl+acetate-lead+citrate.">Selective staining of nucleic acid containing structures by uranyl acetate-lead citrate.</a> Micron and Microscopica Acta. 15 (1), 55-58 (1984).</li><li>Frasca, J. M., Parks, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+routine+technique+for+double-staining+ultrathin+sections+using+uranyl+and+lead+salts.">A routine technique for double-staining ultrathin sections using uranyl and lead salts.</a> Journal of Cell Biology. 25 (1), 157-161 (1965).</li><li>Hanaichi, T., Sato, T., Iwamoto, T., Malavasi-Yamashiro, J., Hoshino, M., Mizuno, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stable+lead+by+modification+of+Sato&#8217;s+method.">A stable lead by modification of Sato&#8217;s method.</a> Journal of Electron Microscopy. 35 (3), 304-306 (1986).</li><li>Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+method+for+lead+staining+of+thin+sections.">A modified method for lead staining of thin sections.</a> Journal of Electron Microscopy. 17 (2), 158-159 (1968).</li><li>Lever, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+staining+tissues+with+lead+for+electron+microscopy.">A method of staining tissues with lead for electron microscopy.</a> Nature. , 810-811 (1960).</li><li>Derek, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self+organization+of+the+Escherichia+Coli+chemotaxis+network+imaged+with+super-resolution+light+microscopy.">Self organization of the Escherichia Coli chemotaxis network imaged with super-resolution light microscopy.</a> Public Library of Science Biology. 7 (6), e1000137 (2009).</li><li>Richards, J. G., Heyn, C., Forssmann, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+histochemistry+of+nervous+tissue.">Ultrastructural histochemistry of nervous tissue.</a> Techniques in Neuroanatomical Research. , 277-292 (1981).</li><li>Wood, R. L., Luft, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+the+buffer+system+on+fixation+with+osmium+tetroxide.">The influence of the buffer system on fixation with osmium tetroxide.</a> Journal of Ultrastructural Research. 12 (1-2), 22-45 (1965).</li><li>Louw, J., Williams, K., Harper, I. S., Walfe-Coote, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+dense+artifactual+deposits+in+tissue+sections:+the+role+of+ethanol,+uranyl+acetate+and+phosphate+buffer.">Electron dense artifactual deposits in tissue sections: the role of ethanol, uranyl acetate and phosphate buffer.</a> Stain Technology. 65 (5), 243-250 (1990).</li></ol>

Håndtering av vevs deler under prøveforberedelse for TEM krever en betydelig grad av finesse, konsentrasjon og tålmodighet. Når du bruker en micropipette til å legge til og fjerne løsninger, kan prøver suges inn i pipette spissen ved overflatespenning, så stor forsiktighet bør tas for å unngå vevskader av pipette. Også visse trinn av dehydrering sekvensen kan være så rask som 1 min, derav operatøren må arbeide raskt for å sikre at neste dehydrering trinn er startet på tid og prøven ikke tørr eller ryn...

Vi beskriver metoder for utarbeidelse av nyfødte rotte hjernevev for å oppnå høy kvalitet elektron micrographs for grundig morphometric analyse av Synaptic vesicle romlig fordeling på nerve terminaler1,2. Høy kontrast micrographs som kan oppnås ved å behandle prøver som følge av disse metodene kan også brukes til å studere den detaljerte morfologi av en rekke cellulære komponenter og deres dimensjonale strukturelle forhold3,4.
Overføringen elektronmikroskop (TEM) er et kraftig verktøy for å studere morfologi av organeller og andre cellulære strukturer kvantitativt. Fra og med dette tiåret, er det ingen andre metoder for etterforskning som kan gi samme grad av oppløsning av lipid membraner og organeller uten Immuno-merking, med unntak av cryofixation ved høyt trykk frysing. Men fryse substitusjon teknikker er ikke mye brukt, og normalt krever dyrt utstyr og lang forberedelse ganger.
For å dra nytte av TEM høy løse kraft, er optimal prøveforberedelse av største betydning. De viktigste målene for prøven forberedelse er å bevare vev struktur med minimal endring fra den levende tilstand, forbedre prøven kontrast, og stabilisere vevet mot ekstraksjon av cellulære komponenter under behandling og eksponering for elektron Stråle. Tallrike protokoller for TEM-vevs forberedelser har blitt innført og perfeksjonert av flere laboratorier gjennom årene. Mange av dem har fokusert på metoder for optimal visualisering av Synaptic blemmer5,6,7,8,9,10,11. Blant en rekke veletablerte, gull standard metoder som er i bruk, vi valgte prosedyrer for kjemisk fiksering, post fiksering, en blokk farging, sekvensiell dehydrering, harpiks innebygging og post flekker som tar sikte på å bevare optimal vev struktur og oppnå utmerket bilde kontrast. Av notatet, bevaring av fine Ultrastructure kan være spesielt utfordrende når du arbeider med nyfødte rotte hjernevev. Faktisk er det sentrale nervesystemet av svært unge dyr preget av en høyere vanninnhold enn den voksne hjernen, mer fremtredende utvidelse av ekstracellulære mellomrom, og løsere forbindelser mellom cellene12. Dette gjør nyfødt rotte hjernevev dypt følsomme for endringer i OSMOLARITETSSYSTEM, og utsøkt utsatt for artifactual krymping og/eller hevelse når de behandles gjennom sekvensielle løsninger av ulike tonisitet12. Derfor våre metoder ansatt løsninger for prøve behandling som er av OSMOLARITETSSYSTEM så nær som mulig til at av rotte nyfødte hjernen. Vårt mål var å få høykvalitets, høyoppløselig elektron mikroskopi bilder for kvantitativ vurdering av Synaptic vesicle romlig distribusjon på nerve terminaler. Nærmere bestemt har vi søkt å måle antall blemmer i nerve terminalen, avstanden Synaptic blemmer fra pre-Synaptic plasma membran, antall blemmer forankret på pre-Synaptic membran, størrelsen på Synaptic blemmer og mellom vesicle avstander1.
Tilfredsstillende kjemisk fiksering er en forutsetning for å oppnå høykvalitets elektron micrographs som kan gi de morfologiske detaljer som er nødvendige for å studere Synaptic vesicle morfologi og romlig organisasjon. Selv om flere moduser av fiksering eksisterer, fiksering av hjernevev ved vaskulær blod er desidert overlegen andre metoder. Siden fiksering via vaskulær blod starter umiddelbart etter arrestasjonen av systemisk sirkulasjon, forkorter det intervallet mellom deoxygenation av hjernevevet og krysskobling av proteiner med fiksativene, noe som resulterer i minimale endringer i celle Struktur. Videre oppnår det rask og ensartet penetrasjon, på grunn av den raske flyten av bindemiddel fra vaskulær seng til ekstracellulære og cellulære rom12,13,14. Primær fiksering med glutaraldehyde, etterfulgt av sekundær fiksering (etter fiksering) med Osmium tetroxide, gir utmerket bevaring av den fine strukturen15,16,17. En blanding av glutaraldehyde og paraformaldehyde har den ekstra fordelen av raskere penetrasjon inn i vevet12.
Siden biologisk vev ikke er tilstrekkelig stive til å bli skåret i tynne seksjoner uten støtte fra en harpiks matrise, må de bygges inn i et medium før tynn snitting. Vann-ublandbare epoxy harpiks er ofte brukt som en embedding medium i TEM. Når denne typen matrise brukes, må alle prøve fritt vann erstattes med et organisk løsemiddel før harpiks infiltrasjon. Vann fjernes ved å sende prøven gjennom en rekke løsninger av stigende konsentrasjoner av etanol og/eller aceton12. I denne protokollen, prøvene er første flat innebygd mellom fleksible aclar ark, deretter innebygd i en kapsel. Det endelige resultatet er vev som ligger på spissen av en sylindrisk harpiks blokk, som har den ideelle geometrien til å være minst påvirket av vibrasjoner som oppstår under mikrotomen snitting.
Farging med tungmetaller for å forbedre endogene vev kontrasten er en annen viktig del av prøven forberedelse. Bildekontrasten i TEM skyldes elektron spredning av atomer i vevet. Imidlertid består biologiske materialer i stor grad av lav Atom vekt molekyler (dvs. karbon, hydrogen, oksygen og nitrogen). Derfor krever generering av tilstrekkelig spredning kontrast inkorporering av høy Atomic vekt atomer i cellulære komponenter av vevet. Dette oppnås gjennom farging av prøven med tungmetaller12,18,19. Osmium tetroxide, uran og bly, som binder sterkt til lipider, er de vanligste tungmetaller brukes som elektron flekker.
Osmium (atomnummer 76) er en av de tetteste metaller i eksistens. Det er både en bindemiddel og en flekk, selv om den primære rolle i TEM er som en pålitelig bindemiddel12. Blant ulike fiksering protokoller i bruk, metoden for dobbel fiksering med glutaraldehyde etterfulgt av Osmium er den mest effektive i å redusere ekstraksjon av celle bestanddeler under prøven forberedelse. Disse to fiksativene brukes til å stabilisere det maksimale antall ulike typer molekyler, spesielt proteiner og lipider, og resultere i overlegen bevaring av vev Ultrastructure12,14,15, 16 flere , 17av dem.
Uran (atomnummer 92) er det tyngste metallet som brukes som elektron beis, vanligvis i form av uranylnitratet acetate. På samme måte som Osmium, fungerer den som en flekk og bindemiddel, selv om den primære rolle i tem er som en flekk på20,21. Nukleinsyre acid-inneholdende og membranous strukturer er sterkt og fortrinnsvis beiset med uranylnitratet salter i aldehyd-faste vev22,23. Behandling av vev med uranylnitratet acetate etter osmication og før dehydrering resulterer i stabilisering av membranous og nukleinsyre syre-inneholdende strukturer, så vel som forbedret kontrast, og tillater identifisering av noen strukturelle detaljer som ikke ville lett oppdages i prøver beiset med Osmium alene12,24,25. Det er antatt at uranylnitratet acetate kan stabilisere den fine strukturen ved å kombinere med reduserte Osmium som har blitt avsatt på lipid membraner under osmication24. Maksimal kontrast oppnås når uranylnitratet acetate påføres før embedding og som en post-flekken i tynne seksjoner12.
Bly (Atomic nummer 82) er den vanligste flekken som brukes for TEM og er hovedsakelig ansatt for post-farging av tynne seksjoner. Bly salter har høy elektron tetthet og viser affinitet for et bredt spekter av cellulære strukturer, inkludert membraner, kjernefysiske og cytoplasmatiske proteiner, nukleinsyre syrer og glykogen26,27. Når den doble farging metoden er ansatt (dvs. farging med uranylnitratet acetate etterfølges av behandling med bly), sistnevnte fungerer som en utvikler av uranylnitratet acetate farging. For eksempel, bly post-farging av kromatin fast med glutaraldehyde øker uranylnitratet acetate opptak av en faktor på tre28,29,30,31,32. Bly også forbedrer farging formidles av andre metaller som Osmium. Det er antatt at bly salter flekker på membraner av Osmium-fast vev ved å feste til Polar gruppen av fosfatid i nærvær av reduserte Osmium33. En potensiell ulempe for farging med både uranylnitratet acetate og bly, spesielt for langvarig varighet, er at mange ulike strukturelle elementer er farget likt og ikke-spesielt, og dermed kan ikke være lett skilles fra hverandre12 .
Den nylige innføringen av alternative lyskilder, slik som i optisk super oppløselig bilde-aktivert lokalisering mikroskopi, har betydelig forbedret lys mikroskopi oppløsning34. Men fordi lys mikroskopi er avhengig av histochemical og immune-cytokjemiske metoder for å visualisere individuelt merkede proteiner eller enzymer, er kraften i TEM å vise alle strukturelle elementer samtidig uovertruffen for dyptgående studie av morfologi og dimensjonale relasjoner av vev strukturer. Spesielt ingen annen teknikk kan gi morfologiske detaljer er nødvendig for å utføre morphometric analyse av Synaptic vesicle distribusjon på pre-Synaptic nerve boutons. Likevel er det viktig å merke seg at elektron micrographs fange strukturen i vevet etter at organismen dør, og derfor kan de ikke gi informasjon om dynamikken i pre-Synaptic vesicle smugling og exocytosis. Derfor bør andre verktøy, slik som FM Dye-Live Imaging og patch-Clamp elektrofysiologi, vurderes når Hovedmålet er å studere dynamiske og/eller funksjonelle aspekter ved Synaptic vesicle smugling og exocytosis.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% Osmium tetroxide</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19170</td>
			<td>acqueous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16310</td>
			<td>EM grade, acqueous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aclar 33 C embedding film</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50425-25</td>
			<td>7.8 mil thickness, size 8&#34;x10&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEEM capsule holder</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69916</td>
			<td>holds size &#34;00&#34; capsules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEEM embedding capsules</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70021</td>
			<td>size &#34;00&#34;, flat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butler block trimmer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69945-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camel hair paint brush</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>65576-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disc punch</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>77850-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embed 812 kit</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead citrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead nitrate</td>
			<td>Electron microscopy Sciences</td>
			<td>17900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica UC7 ultracut microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scale</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>62091-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19208</td>
			<td>EM grade, granular</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Thelco laboratory oven</td>
			<td>Thelco</td>
			<td>51221159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StatMark pen</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72109-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrode solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>11760-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of newborn rat brain tissue for ultrastructural morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals

Vårt laboratorium og mange andre har utnyttet den høye løse kraften i overføring elektron mikroskopi å studere morfologi og romlig organisering av Synaptic blemmer. For å oppnå høy kvalitet elektron micrographs som kan gi graden av morfologiske detaljer er nødvendig for kvantitativ analyse av pre-Synaptic vesicle fordeling, er optimal prøveforberedelse kritisk. Kjemisk fiksering er det første skrittet i prosessen med forberedelse av prøver, og av største viktighet for å bevare fin Ultrastructure. Vaskulær fiksering med en glutaraldehyde-formaldehyd løsning, etterfulgt av behandling av vibratome-delt prøver med Osmium tetroxide, stabiliserer maksimalt antall molekyler, spesielt proteiner og lipider, og resulterer i overlegen bevaring av Ultrastructure. Tissue blir deretter behandlet med counterstaining, sekvensiell dehydrering og harpiks-innebygging. En blokk farging med uranylnitratet acetate (dvs. farging av vibratome-delt vev før harpiks Embedding) forbedrer endogene kontrasten og stabiliserer celle komponenter mot ekstraksjon under prøve behandling. Kontrasten kan økes ytterligere ved å påføre uranylnitratet acetate som et post-flekken på ultratynne seksjoner. Double-farging av ultratynne seksjoner med bly citrate etter uranylnitratet acetate behandling også forbedrer bildeoppløsning, ved å intensivere elektron-opacity av nukleinsyre syre-inneholdende strukturer gjennom selektiv binding av bly til uranylnitratet acetate. Transmission Electron mikroskopi er et kraftig verktøy for karakterisering av morfologiske detaljer av Synaptic blemmer og kvantifisering av deres størrelse og romlig organisasjon i terminalen Bouton. Men fordi den bruker fast vev, kan overføring elektron mikroskopi bare gi indirekte informasjon om levende eller utviklende prosesser. Derfor bør andre teknikker vurderes når Hovedmålet er å studere dynamiske eller funksjonelle aspekter av Synaptic vesicle smugling og exocytosis.

Generelle kriterier som for det meste aksepteres som en indikasjon på tilfredsstillende eller defekt bevaring av prøve for TEM er fastslått. Disse kriteriene er eksempler på fire utvalgte elektron micrographs (to eksempler på optimal forberedelse, to eksempler på defekt forberedelse) som ble oppnådd ved å behandle unge rotte hjernevev etter metodene som er beskrevet i denne protokollen.
Generelt, en god kvalitet elektronmikroskop vises som en ryddig, distinkt og generell grå bilde. I ...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals at JoVE.com

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

Vi beskriver prosedyrer for behandling av nyfødte rotte hjernen vev for å få høyoppløselig elektron micrographs for morphometric analyse av Synaptic vesicle distribusjon på nerve terminaler. Micrographs innhentet med disse metodene kan også brukes til å studere morfologi av en rekke andre cellulære komponenter og deres dimensjonale strukturelle relasjoner.

Utarbeidelse av nyfødte Rat Brain tissue for ultrastructural Morphometric analyse av Synaptic vesicle fordeling på nerve terminaler

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial ...

Blant flere eksisterende protokoller for vevsforberedelse for overføring av elektronmikroskopi valgte vi metoder som gir optimal strukturell bevaring og høyoppløselige mikrografer for å utføre morfometrisk analyse av synaptiske vesikler distribusjon ved presynaptiske terminaler. De høye kontrastbildene som er oppnådd med disse metodene, gjør det mulig å kvantifisere parametere som avstand av synaptiske vesikler fra det presynaptiske membranantall vesikler som er forankret ved den presynaptiske membranen og inter vesikkelavstander. Alle disse parametrene er et tegn på synaptisk funksjon.Siden endringer i romlig organisering av synaptiske vesikler kan være forbundet med forstyrrelsen av synaptisk funksjon, har disse metodene blitt brukt til å undersøke effekten av generell anestetika på synaptisk utvikling. Disse metodene kan også brukes til å undersøke effekten av ethvert stoff eller behandling på den detaljerte morfologien til synapser for å gi innsikt i deres funksjon. Begynn med å forberede osmiumtetroksid for postfiksering av rottehjerneseksjoner som tidligere var festet med paraformaldehyd og glutaraldehyd via vaskulær perfusjon.Seksjoner blir stive etter behandling med osmiumtetroksid. Derfor krever vevshåndtering oppmerksomhet fra da av. Også, før du legger osmium, sørg for at seksjonene er flatet som noen fold vil trolig resultere i vev brudd.Åpne en fem milliliter glass ampull på 4% osmium tetroxide og vann og slipp den inne i en brun glassflaske. Tilsett fem milliliter med 0,2 molarfosfatbuffer og legg deretter til ytterligere 10 milliliter med 0,1 molarfosfatbuffer for å oppnå en 1% endelig løsning. Bruk en 20 milliliter sprøyte utstyrt med en lang nål for å trekke opp 1% osmium tetroxide og deretter legge osmium tetroxide til en brun glassburk dekket med aluminiumsfolie.Etter å ha sørget for at prøven er brettet ut og flatet ut, tilsett 1% osmiumtetroksid og 0,1 molar PB til prøvehetteglasset. Inkuber prøven i osmiumtetroksid i en time ved romtemperatur. Trekk ut osmiumtetroksidet med en mikropipe etter at inkubasjonen er ferdig og skyll seksjonene som beskrevet i protokollen.For å forberede uranylacetat, legg en 200 milliliter volumetrisk glasskolbe som inneholder 100 milliliter 70% etanol på en røreplate. Tilsett fire gram uranylacetat i kolben, pakk en aluminiumsfolie for å forhindre nedbør av lys og rør kontinuerlig. Dehydrer seksjonene i 50% etanol.Flekk med forberedt 4% uranylacetat i en time og følg med seriell dehydrering og skylling som beskrevet i manuskriptet. Fjern sprøytestempelet fra en 60 milliliter gavage sprøyte og cap den med en sikkerhetsnål. Plasser sprøyten med den åpne siden opp og tilsett hver ingrediens i harpiksblandingen en etter en.Avslutt med å legge til 525 mikroliter DMP30 med pipet. Flytte stempelet på pipet veldig sakte som DMP er svært viskøs. Sett stempelet tilbake i sprøyten.Inverter sprøyten noen ganger for å blande innholdet. Fargen endres fra gul til gul. Evakuer luften inne i sprøyten.Plasser den deretter på en rocker med kontinuerlig risting i minst 30 minutter. Tilsett ett volum epoksyharpiks og ett volum aceton til et scintillation hetteglass og rist for å blande. Påfør denne til en harpiks på acetonblandingen på vevsdelen etter den siste acetonskyllingen som holder seg tildekket for å unngå acetonfordampning.Fjern en til en blanding av harpiks og aceton etter to til fire timer og erstatt den med full harpiks og inkuber i fire timer. Legg alt harpiksavfall i en oppsamlingsbeholder under panseret for å polymerisere og kastes senere. Klipp to rektangulære stykker klar polyklortrifluoretylenfilm og tørk dem med 70% etanol.Trim dem slik at det er minst 1,5 centimeter vevsfri plast på hver side av seksjonen, og pass på at de har samme bredde, men høyden på arket på toppen er ca 2/3 av bunnarket. Vipp hetteglasset langsomt og bruk en fin kamelbørste og en fleksibel mikrospatel for å løfte prøven forsiktig fra bunnen. Deretter flytter du forsiktig avsnittet langs hetteglassveggene og overføres til det nederste PCTFE-arket.Fjern overflødig harpiks med en mikrospatel og dekk forsiktig prøven med topparket. Skyv forsiktig ut eventuelle fanget luftbobler uten å bruke direkte trykk på vevsdelen og tørk ut overflødig harpiks. Bruk en løsningsmiddelbestandig penn til å merke arkene og legg i en ovn på 60 grader celsius i to til tre dager for å polymerisere.Trekk forsiktig fra hverandre de sandwichede PCTFE-arkene for å åpne dem. Bruk en løsningsmiddelbestandig penn til å markere siden av arket som inneholder følgeseksjonen som markerer den i nærheten av vevet. Bruk en skiveslag for å få en sirkelprøve av seksjonen som sørger for at pennemerket er en del av det utslagne vevet.Pennemerket vil skinne når lyset skinner på prøven. Plasser hetten på en innbyggingskapsel side opp på en kapselholder. Plasser en dråpe harpiks på hetten og sett den stansede disken inn i hetten med vevsdelen vendt opp.Sett en kapsel inn i hetten ved hjelp av en mild korketrekkerbevegelse. Bruk fine pinsett til å rulle og senke et trykt to centimeter langt papiretikett i kapselen, og pass på at den passer til krumningen på kapselens sidevegger. Hell innebyggingsharpiksen inne i kapselen, fyll opp til kanten av kapselen og bruk en spiss trepinne for å skyve vevsprøven ned til bunnen.Plasser kapselen i ovnen ved 60 grader celsius i to til tre dager for polymerisering. Og fortsett deretter med snitting og farging som beskrevet i protokollen. Elektronmikrograf for tilfredsstillende bevaring av nevronal cellestruktur viser lagdelte cellemembraner uten pauser.Cytoplasma er endelig granulær og uten tomme rom. Mitokondrier er verken hovne eller krympet med en bevart ytre dobbel membran og intakt indre cristae. Optimal bevaring av nevronal ultrastruktur og fin morfologiske detaljer er avgjørende for å visualisere synaptiske vesikler og måle avstanden fra den presynaptiske membranen.Synaptiske vesikler skal være distinkte og foret av en ubrutt enkeltmembran. For å lette morfometrisk analyse av synaptisk vesikkelfordeling, bør presynaptiske og postsynaptiske membraner være parallelle i kontinuiteten bevart. Elektronmikrograf for defekt bevaring av vevsstruktur viser forvrengning og brudd på nevronale cellemembraner og tilstedeværelsen av markert forstørrede ekstracellulære rom.Mitokondrier vises distended og har hovne cristae. I et annet eksempel på defekt vevstrukturbevaring var det store hvite tomme rom i cytoplasma i stedet for fint granulært cytoplasmatisk stoff med forstørrede ekstracellulære rom. En kunstig membran som foralle sannsynligvis skyldes mobilisering av lipider under fiksering med glutaraldehyd.Når du arbeider ung hjernevev bruke 1 molar fosfat buffer som et løsningsmiddel for all din løsning, slik at du holder tonicity så nært som mulig til den nyfødte rotte hjernen og minimere artefaktvev krymping og eller hevelse. Mikrografene som er oppnådd med disse metodene, kan brukes til å studere de detaljerte morfologien og dimensjonale strukturelle relasjonene til en rekke andre cellulære komponenter enn synaptiske vesikler. For eksempel mitokondrier, golgiapparat og kjernefysisk kromatin.Flere trinn i denne protokollen krever kjemikalier som kan være giftige. Arbeid alltid under en røykhette og bruk personlig verneutstyr ved håndtering av aldehyder, osmium, uran og blyforbindelser.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric ÃƒÅ½Ã‚Â²-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Kvantitativ analyse av Synaptic vesicle Pool Etterfylling i Cultured lillehjernen Granule Neurons bruker FM Fargestoffer

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Kapasitans Målinger og Ca 2 + Imaging ved Singel nerveterminaler i Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Samtidig Pre-og postsynaptiske Elektrofysiologisk Opptak fra<em&gt; Xenopus</em&gt; Nerve-muskel Co-kulturer

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Høy oppløsning Kvantitativ immungull Analyse av membranreseptorer på retina Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

Peering på Brain Polysomes med Atomic Force Microscopy

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analysere Synaptic Modulation av<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotoreseptorer etter eksponering for Langvarig lys

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...