Name: preparation of newborn rat brain tissue for ultrastructural morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals
Uploaded: 2019-06-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals at JoVE.com

Detta manuskript stöddes av NIH/NIGMS K08 123321 (till N.L.) och av medel från Institutionen för anestesiologi vid University of Virginia. Författarna vill tacka alev Erisir (Institutionen för biologi, University of Virginia, Charlottesville, VA) för utmärkt utbildning och teknisk assistans med TEM, och för hennes ovärderliga manuskript kritik. Författarna tackar också Advanced Electron Microscopy anläggningen vid University of Virginia för teknisk hjälp med preparat snittningen och efter färgning.

Alla studier godkändes av den institutionella djur omsorgs-och användnings kommittén vid University of Virginia (Charlottesville, VA) och genomfördes i enlighet med de nationella hälso instituten rikt linjer.
1. fixering genom vaskulär perfusion
Anmärkning: En allmän beskrivning av metoden för råtta hjärna vaskulär per fusion har redan detaljerade i denna tid skrift13 och ligger utanför tillämpningsområdet för d...

<ol>
	<li>Lunardi, N., Oklopcic, A., Prillaman, M., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+exposure+to+general+anesthesia+disrupts+spatial+organization+of+presynaptic+vesicles+in+nerve+terminals+of+the+developing+subiculum.">Early exposure to general anesthesia disrupts spatial organization of presynaptic vesicles in nerve terminals of the developing subiculum.</a> Molecular Neurobiology. 52 (2), 942-951 (2015).</li><li>Lunardi, N., Ori, C., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+anesthesia+causes+long-lasting+disturbances+in+the+ultrastructural+properties+of+developing+synapses+in+young+rats.">General anesthesia causes long-lasting disturbances in the ultrastructural properties of developing synapses in young rats.</a> Neurotoxicity Research. 17 (2), 179-188 (2010).</li><li>Sanchez, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+anesthesia+causes+long-term+impairment+of+mitochondrial+morphogenesis+and+synaptic+transmission+in+developing+rat+brain.">General anesthesia causes long-term impairment of mitochondrial morphogenesis and synaptic transmission in developing rat brain.</a> Anesthesiology. 115 (5), 992-1002 (2011).</li><li>Boscolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+abolishment+of+anesthesia-induced+cognitive+impairment+by+timely+protection+of+mitochondria+in+the+developing+rat+brain:+the+importance+of+free+oxygen+radicals+and+mitochondria+integrity.">The abolishment of anesthesia-induced cognitive impairment by timely protection of mitochondria in the developing rat brain: the importance of free oxygen radicals and mitochondria integrity.</a> Neurobiology of Disease. 45 (3), 1031-1041 (2012).</li><li>Aghajanian, G. K., Bloom, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+of+synaptic+junctions+in+developing+rat+brain:+a+quantitative+electron+microscopy+study.">The formation of synaptic junctions in developing rat brain: a quantitative electron microscopy study.</a> Brain Research. 6 (4), 716-727 (1967).</li><li>Akert, K., Sandri, C., Santini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+the+Maillet+method+for+cytochemical+studies+of+synapses.">Significance of the Maillet method for cytochemical studies of synapses.</a> Golgi centennial symposium; Perspectives in Neurobiology. , 387-399 (1975).</li><li>Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemistry+of+synapses:+selective+staining+for+electron+microscopy.">Cytochemistry of synapses: selective staining for electron microscopy.</a> Science. 154 (3756), 1575-1577 (1966).</li><li>Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+structural+and+cytochemical+analysis+of+the+staining+of+synaptic+junctions+with+phosphotungstic+acid.">Fine structural and cytochemical analysis of the staining of synaptic junctions with phosphotungstic acid.</a> Journal of Ultrastructure Research. 22 (5-6), 361-375 (1968).</li><li>Burry, R. W., Lasher, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+electron+microscopy+study+of+synapse+formation+in+dispersed+cell+cultures+of+rat+cerebellum+stained+either+by+O-UL+or+by+E-PTA.">A quantitative electron microscopy study of synapse formation in dispersed cell cultures of rat cerebellum stained either by O-UL or by E-PTA.</a> Brain Research. 147 (1), 1-15 (1978).</li><li>Pellegrino de Iraldi, A., Suburo, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+staining+of+synaptic+vesicles+using+the+Champy-Maillet+technique.">Electron staining of synaptic vesicles using the Champy-Maillet technique.</a> Journal of Microscopy. 91 (2), 99-103 (1970).</li><li>Pfenninger, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytochemistry+of+synaptic+densities.+I.+An+analysis+of+the+bismuth+iodide+impregnation+method.">The cytochemistry of synaptic densities. I. An analysis of the bismuth iodide impregnation method.</a> Journal of Ultrastructural Research. 34 (1), 103-122 (1971).</li><li>Hayat, M. A., Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+fixation.">Chemical fixation.</a> Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications. , 4-84 (2000).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visual Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Hayat, M. A., Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fixation for electron microscopy. , (1981).</li><li>Behrman, E. J., et al., Revel, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemistry+of+osmium+tetroxide+fixation.">The chemistry of osmium tetroxide fixation.</a> The science of biological specimen preparation for microscopy and microanalysis. , 1-5 (1983).</li><li>Nielson, A. J., Griffith, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactions+of+osmium+tetroxide+with+protein+side+chains+and+unsaturated+lipids.">Reactions of osmium tetroxide with protein side chains and unsaturated lipids.</a> Journal of the Chemical Society, Dalton Transactions. (6), 1084-1088 (1979).</li><li>Nielson, A. J., Griffith, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+fixation+by+osmium+tetroxide.+A+possible+role+for+proteins.">Tissue fixation by osmium tetroxide. A possible role for proteins.</a> Journal of Hystochemistry &amp; Cytochemistry. 27 (5), 997-999 (1979).</li><li>Hanker, J. S., Deb, C., Wasserkrug, H. L., Seligman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+tissue+for+light+and+electron+microscopy+by+bridging+metals+with+multidentate+ligands.">Staining tissue for light and electron microscopy by bridging metals with multidentate ligands.</a> Science. 152 (3729), 1631-1634 (1966).</li><li>Zobel, C. R., Beer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+heavy+metal+salts+as+electron+stains.">The use of heavy metal salts as electron stains.</a> International Review of Cytology. 18, 363-400 (1965).</li><li>Silva, M. T., Guerra, F. C., Magalhaes, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fixative+action+of+uranyl+acetate+in+electron+microscopy.">The fixative action of uranyl acetate in electron microscopy.</a> Experientia. 24 (10), 1074 (1968).</li><li>Terzakis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uranyl+acetate,+a+stain+and+a+fixative.">Uranyl acetate, a stain and a fixative.</a> Journal of Ultrastructural Research. 22 (1-2), 168-184 (1968).</li><li>Feldman, I., Jones, J., Cross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chelation+of+uranyl+ions+by+adenine+nucleotides.">Chelation of uranyl ions by adenine nucleotides.</a> Journal of the American Chemical Society. 89 (1), 49-53 (1967).</li><li>Shah, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+uranyl+ions+with+phospholipid+and+cholesterol+monolayer.">Interaction of uranyl ions with phospholipid and cholesterol monolayer.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 29 (2), 210-215 (1969).</li><li>Daems, W. T., Persijn, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Section+staining+with+heavy+metals+of+osmium-fixed+and+formol-fixed+mouse+liver+tissue.">Section staining with heavy metals of osmium-fixed and formol-fixed mouse liver tissue.</a> Journal. Royal Microscopical Society. 81 (pts 3&#38;4), 199-201 (1963).</li><li>Lombardi, L., Prenna, G., Okolicsanyi, L., Gautier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+staining+with+uranyl+acetate:+possible+role+of+free+amino+groups.">Electron staining with uranyl acetate: possible role of free amino groups.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 19 (3), 161-168 (1971).</li><li>Cattini, P. A., Davies, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+lead+citrate+staining+of+thin+sections+for+electron+microscopy.">Kinetics of lead citrate staining of thin sections for electron microscopy.</a> Stain Technology. 58 (1), 29-40 (1983).</li><li>Reynolds, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+lead+citrate+at+high+pH+as+an+electron+opaque+stain+in+electron+microscopy.">The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).</li><li>Cattini, P. A., Davies, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+kinetics+of+uranyl+acetate+and+phosphotungstic+acid+staining+of+chromatin+in+thin+sections+for+electron+microscopy.">Observations on the kinetics of uranyl acetate and phosphotungstic acid staining of chromatin in thin sections for electron microscopy.</a> Stain Technology. 59 (5), 291-304 (1984).</li><li>Derksen, J. W., Meekes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+staining+of+nucleic+acid+containing+structures+by+uranyl+acetate-lead+citrate.">Selective staining of nucleic acid containing structures by uranyl acetate-lead citrate.</a> Micron and Microscopica Acta. 15 (1), 55-58 (1984).</li><li>Frasca, J. M., Parks, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+routine+technique+for+double-staining+ultrathin+sections+using+uranyl+and+lead+salts.">A routine technique for double-staining ultrathin sections using uranyl and lead salts.</a> Journal of Cell Biology. 25 (1), 157-161 (1965).</li><li>Hanaichi, T., Sato, T., Iwamoto, T., Malavasi-Yamashiro, J., Hoshino, M., Mizuno, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stable+lead+by+modification+of+Sato&#8217;s+method.">A stable lead by modification of Sato&#8217;s method.</a> Journal of Electron Microscopy. 35 (3), 304-306 (1986).</li><li>Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+method+for+lead+staining+of+thin+sections.">A modified method for lead staining of thin sections.</a> Journal of Electron Microscopy. 17 (2), 158-159 (1968).</li><li>Lever, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+staining+tissues+with+lead+for+electron+microscopy.">A method of staining tissues with lead for electron microscopy.</a> Nature. , 810-811 (1960).</li><li>Derek, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self+organization+of+the+Escherichia+Coli+chemotaxis+network+imaged+with+super-resolution+light+microscopy.">Self organization of the Escherichia Coli chemotaxis network imaged with super-resolution light microscopy.</a> Public Library of Science Biology. 7 (6), e1000137 (2009).</li><li>Richards, J. G., Heyn, C., Forssmann, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+histochemistry+of+nervous+tissue.">Ultrastructural histochemistry of nervous tissue.</a> Techniques in Neuroanatomical Research. , 277-292 (1981).</li><li>Wood, R. L., Luft, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+the+buffer+system+on+fixation+with+osmium+tetroxide.">The influence of the buffer system on fixation with osmium tetroxide.</a> Journal of Ultrastructural Research. 12 (1-2), 22-45 (1965).</li><li>Louw, J., Williams, K., Harper, I. S., Walfe-Coote, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+dense+artifactual+deposits+in+tissue+sections:+the+role+of+ethanol,+uranyl+acetate+and+phosphate+buffer.">Electron dense artifactual deposits in tissue sections: the role of ethanol, uranyl acetate and phosphate buffer.</a> Stain Technology. 65 (5), 243-250 (1990).</li></ol>

Hantering av vävnads sektioner under preparat preparering för TEM kräver en avsevärd grad av finess, koncentration och tålamod. När du använder en mikropipett för att lägga till och ta bort lösningar, kan proverna sugs in i pipettspetsen med ytspänning, så du bör vara noga med att undvika vävnads skada genom pipetten. Också, vissa steg i dehydratiseringssekvensen kan vara så snabb som 1 min, därav operatören måste arbeta snabbt för att säkerställa att nästa Dehydrering steg startas i tid och prepar...

Vi beskriver metoder för beredning av hjärn vävnad från nyfödda råttor för att erhålla högkvalitativa elektronmikrografer för djupgående morphometrisk analys av synaptisk vesikelspatial fördelning vid nervterminaler1,2. De hög kontrast mikrografer som kan erhållas genom bearbetning av prover efter dessa metoder kan också användas för att studera den detaljerade morfologin av ett antal cellulära komponenter och deras dimensionella strukturella relationer3,4.
Transmission Electron Mikroskop (TEM) är ett kraftfullt verktyg för att studera morfologi av organeller andra cellulära strukturer kvantitativt. Från och med detta årtionde, det finns inga andra metoder för utredning som kan ge samma grad av upplösning av Lipidmembran och organeller utan immuno-taggning, med undantag för kryofixering genom högtrycks frysning. Emellertid, frysa substitutions tekniker används inte i stor utsträckning, och normalt kräver dyr utrustning och långa förberedelse tider.
För att kunna dra nytta av TEM: s höga upplösnings effekt är optimal preparat beredning av största vikt. De viktigaste målen för preparat preparatet är att bevara vävnads strukturen med minimal förändring från den levande tillstånd, förbättra preparat kontrast, och stabilisera vävnaden mot utvinning av cellulära komponenter under bearbetning och exponering för elektronen Beam. Många protokoll för TEM vävnads beredning har införts och fulländat av flera laboratorier under årens lopp. Många av dem har fokuserat på metoder för optimal visualisering av synaptiska vesikler5,6,7,8,9,10,11. Bland ett antal väletablerade, guldmynt standard metoder som för närvarande används, valde vi förfaranden för kemisk fixering, post fixation, en Bloc färgning, sekventiell uttorkning, harts inbäddning och efter färgning som syftar till att bevara optimal vävnads struktur och uppnå utmärkt bild kontrast. Notera, bevarandet av fina ultrastruktur kan vara särskilt utmanande när man arbetar med nyfödda råtta hjärn vävnad. Faktum är att det centrala nerv systemet hos mycket unga djur kännetecknas av en högre vatten halt än den vuxna hjärnan, mer framträdande utvidgning av extracellulära utrymmen, och lösare anslutningar mellan cellerna12. Detta gör nyfödda råtta hjärn vävnad djupt känslig för förändringar i osmolaritet, och utsökt benägna att artifaktuella krympning och/eller svullnad när bearbetas genom sekventiella lösningar av olika Tonicity12. Därför använde våra metoder lösningar för preparat bearbetning som är av osmolaritet så nära som möjligt till den hos råtta nyfödda hjärnan. Vårt mål var att få högkvalitativa, högupplösta elektronmikroskopi bilder för kvantitativ bedömning av synaptisk vesikel spatial distribution vid nervterminaler. Specifikt försökte vi mäta antalet vesikler i nerven terminalen, avståndet till synaptiska vesikler från pre-synaptiska plasma membranet, antalet vesikler dockad vid pre-synaptiska membranet, storleken på synaptiska vesikler och Inter-Vesicle avstånd1.
Tillfredsställande kemisk fixering är en förutsättning för att erhålla högkvalitativa elektronmikrografer som kan ge den morfologiska detalj som krävs för att studera synaptisk vesikelmorfologi och spatial organisation. Även om flera lägen för fixering finns, fixering av hjärn vävnad genom vaskulär per fusion är avgjort överlägsen andra metoder. Eftersom fixering via vaskulär per fusion börjar omedelbart efter gripandet av systemisk cirkulation, förkortar det intervallet mellan syresättning av hjärn vävnaden och tvär bindning av proteiner med fixativ, vilket resulterar i minimala förändringar i cell Struktur. Dessutom åstadkommer det snabb och enhetlig penetration, på grund av det snabba flödet av fixativ från kärl bädden till extracellulära och cellulära fack12,13,14. Primär fixering med glutaraldehyd, följt av sekundär fixering (post-fixation) med osmium tetroxid, ger utmärkt bevarande av den fina strukturen15,16,17. En blandning av glutaraldehyd och paraformaldehyd har den extra fördelen av mer snabb penetration i vävnaden12.
Eftersom biologiska vävnader inte är tillräckligt stela för att skärs i tunna partier utan stöd av en harts matris, måste de bäddas in i ett medium innan tunn snittning. Vatten-immiscible epoxihartser används ofta som en inbäddning medium i TEM. När denna typ av matris används, måste alla preparat fritt vatten bytas ut mot ett organiskt lösnings medel före harts infiltration. Vatten avlägsnas genom att provet passerar genom en serie lösningar av stigande koncentrationer av etanol och/eller aceton12. I detta protokoll är proverna först plana inbäddade mellan flexibla aclar ark, sedan inbäddade i en kapsel. resultatet är vävnad som ligger på spetsen av ett cylindriskt harts block, som har den ideala geometri som minst påverkas av vibrationer som uppstår under mikrotomen snittning.
Färgning med tung metaller för att förbättra endogen vävnad kontrast är en annan viktig aspekt av preparatet preparat. Bildens kontrast i TEM beror på elektrons spridning av atomerna i vävnaden. Biologiskt material består dock till stor del av låga Atom vikt molekyler (dvs. kol, väte, syre och kväve). Därför kräver generering av tillräcklig spridning kontrast införlivandet av hög Atom vikt atomer i cellulära komponenter i vävnaden. Detta uppnås genom färgning av preparatet med tung metaller12,18,19. Osmium tetroxid, uran och bly, som binder starkt till lipider, är de vanligaste tung metaller som används som elektron fläckar.
Osmium (Atom nummer 76) är en av de tätaste metallerna i tillvaron. Det är både en fixativ och en fläck, även om dess primära roll i TEM är som en pålitlig fixativ12. Bland de olika bindnings protokoll som används är metoden för dubbel fixering med glutaraldehyd som följs av osmium den mest effektiva för att reducera extraktionen av cell bestånds delar under preparat preparatet. Dessa två fixativ används för att stabilisera det maximala antalet olika typer av molekyler, särskilt proteiner och lipider, och resultera i överlägsen bevarande av vävnad ultrastruktur12,14,15, 16 för att , och 17.
Uran (Atom nummer 92) är den tyngsta metallen som används som elektron fläck, oftast i form av uranyl acetat. På samma sätt som osmium, fungerar den som en fläck och fixativ, även om dess primära roll i tem är som en fläck20,21. Nukleinsyra-innehållande och membranös strukturerar är starkt och befläckas prioriterat med uranyl saltar i aldehyde-fixade vävnader22,23. Behandling av vävnader med uranyl acetat efter osmication och före Dehydrering resulterar i stabilisering av membranös och nukleinsyra-innehållande strukturer, samt förbättrad kontrast, och tillåter identifiering av vissa strukturella detaljer som inte skulle kan lätt upptäckas i prover som har betats med osmium ensamt12,24,25. Det är tänkt att uranyl acetat kan stabilisera den fina strukturen genom att kombinera med reducerad osmium som har deponerats på Lipidmembran under osmication24. Maximal kontrast uppnås när uranyl acetat appliceras före inbäddning och som en post-fläck i tunna avsnitt12.
Bly (Atom nummer 82) är den vanligaste fläcken som används för TEM och är främst anställd för efter färgning av tunna sektioner. Blysalter har hög elektron opacitet och visar affinitet för ett brett spektrum av cellulära strukturer, inklusive membran, nukleära och cytoplasmatiska proteiner, nukleinsyror och glykogen26,27. När dubbel färgning metoden är anställd (dvs, färgning med uranyl acetat följs av behandling med bly), den senare fungerar som en utvecklare av uranyl acetat färgning. Till exempel, bly efter färgning av kromatin fast med glutaraldehyd ökar uranyl acetat upptag med en faktor på tre28,29,30,31,32. Bly ökar också färgning förmedlas av andra metaller som osmium. Det är tänkt att bly salter fläcken membranen av osmium-fasta vävnader genom att fästa till Polar gruppen av fosfatider i närvaro av reducerad osmium33. En potentiell nackdel med färgning med både uranyl acetat och bly, särskilt för långvarig varaktighet, är att många olika strukturella element är färgade lika och icke-specifikt, och därmed inte kan lätt skiljas från en annan12 .
Den senaste tidens införande av alternativa ljus källor, såsom i optisk super-upplösning foto-aktiverad lokalisering mikroskopi, har betydligt bättre ljus mikroskopi upplösning34. Men eftersom ljus mikroskopi förlitar sig på histokemiska och immuncytokemiska metoder för att visualisera individuellt märkta proteiner eller enzymer, kraften i TEM för att visa alla strukturella element på en gång är oöverträffad för fördjupad studie av morfologi och dimensions relationer i vävnads strukturer. I synnerhet, ingen annan teknik kan ge den morfologiska detaljer som krävs för att utföra morphometriska analys av synaptisk vesikler distribution vid pre-synaptiska nerv boutons. Det är dock viktigt att notera att elektronmikrografer fångar strukturen i vävnaden efter att organismen dör, och därför kan de inte ge information om dynamiken i pre-synaptisk vesikel trafficking och exocytos. Därför, andra verktyg, såsom FM färg-Live Imaging och patch-Clamp elektrofysiologi, bör övervägas när det huvudsakliga målet är att studera dynamiska och/eller funktionella aspekter av synaptisk vesikel trafficking och exocytos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% Osmium tetroxide</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19170</td>
			<td>acqueous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16310</td>
			<td>EM grade, acqueous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aclar 33 C embedding film</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50425-25</td>
			<td>7.8 mil thickness, size 8&#34;x10&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEEM capsule holder</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69916</td>
			<td>holds size &#34;00&#34; capsules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEEM embedding capsules</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70021</td>
			<td>size &#34;00&#34;, flat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butler block trimmer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69945-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camel hair paint brush</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>65576-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disc punch</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>77850-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embed 812 kit</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead citrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead nitrate</td>
			<td>Electron microscopy Sciences</td>
			<td>17900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica UC7 ultracut microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scale</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>62091-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19208</td>
			<td>EM grade, granular</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Thelco laboratory oven</td>
			<td>Thelco</td>
			<td>51221159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StatMark pen</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72109-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrode solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>11760-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of newborn rat brain tissue for ultrastructural morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals

Vårt laboratorium och många andra har utnyttjat den höga upplösnings kraften i transmissionselektronmikroskopi för att studera morfologin och den rumsliga organiseringen av synaptiska vesikler. För att erhålla högkvalitativa elektronmikrografer som kan ge den grad av morfologisk detalj som krävs för kvantitativ analys av pre-synaptisk vesikeldistribution är optimal preparat preparering kritisk. Kemisk fixering är det första steget i processen för preparat beredning, och av yttersta vikt för att bevara fina ultrastruktur. Vaskulär fixering med en glutaraldehyd-formaldehyd lösning, följt av behandling av vibratome-Snittade prover med osmium tetroxid, stabiliserar det maximala antalet molekyler, särskilt proteiner och lipider, och resulterar i överlägsen bevarande av ultrastruktur. Vävnad bearbetas sedan med counterfärgning, sekventiell uttorkning och harts-inbäddning. En block färgning med uranyl acetat (dvs färgning av vibratome-snittad vävnad innan harts inbäddning) förbättrar endogena kontrasten och stabiliserar cell komponenter mot extraktion under preparat bearbetning. Kontrasten kan ökas ytterligare genom applicering av uranyl acetat som en post-fläck på ultratunna sektioner. Dubbel färgning av ultratunna sektioner med blycitrat efter behandling med uranyl acetat förbättrar också bildens upplösning, genom att intensifiera elektron-opacitet av nukleinsyra-innehållande strukturer genom selektiv bindning av bly till uranyl acetat. Transmission elektronmikroskopi är ett kraftfullt verktyg för karakterisering av morfologiska Detaljer av synaptiska vesikler och kvantifiering av deras storlek och rumsliga organisation i terminalen Bouton. Men eftersom den använder fast vävnad, transmissionselektronmikroskopi kan bara ge indirekt information om levande eller föränderliga processer. Därför bör andra tekniker övervägas när huvud syftet är att studera dynamiska eller funktionella aspekter av synaptisk vesikel trafficking och exocytos.

Allmänna kriterier som oftast godtas som indikation på tillfredsställande eller defekt bevarande av preparat för TEM har fastställts. Dessa kriterier exemplifieras i fyra utvalda elektronmikrografer (två exempel på optimala förberedelser, två exempel på defekt preparering) som erhölls genom behandling av unga råtta hjärn vävnad enligt de metoder som beskrivs i detta protokoll.
I allmänhet, en god kvalitet elektron mikrograf visas som en ordnad, distinkt och övergripande gråakt...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals at JoVE.com

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

Vi beskriver förfaranden för behandling av nyfödda råtta hjärn vävnad att få högupplösta elektronmikrografer för morfometriska analys av synaptisk vesikler distribution vid nervterminaler. De mikrografer som erhålls med dessa metoder kan också användas för att studera morfologin hos ett antal andra cellulära komponenter och deras dimensionella strukturella relationer.

Beredning av nyfödda råtta hjärn vävnad för ultrastrukturella Morphometric analys av synaptic Vesicle distribution på Nervterminaler

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial ...

Bland flera befintliga protokoll för vävnad förberedelse för överföring elektronmikroskopi, vi valt metoder som ger optimala strukturella bevarande och hög upplösning mikrografer att utföra morphometric analys av synaptic vesicles distribution vid presynaptic terminaler. De höga kontrastbilder som erhålls med dessa metoder gör det möjligt att kvantifiera parametrar såsom avstånd av synaptiska vesiklar från presynaptiska membran antalet vesiklar dockade vid presynaptiska membranet och inter vesikel avstånd. Alla dessa parametrar är indikativt för synaptisk funktion.Eftersom förändringar i den rumsliga organisationen av synaptiska vesiklar kan associeras med störningen av synaptisk funktion, har dessa metoder använts för att undersöka effekterna av generella anestetika på synaptisk utveckling. Dessa metoder skulle också kunna användas för att undersöka effekterna av något läkemedel eller behandling på detaljerad morfologi av synapser för att ge insikt i deras funktion. Börja med att förbereda osmium tetroxid för post fixering av råtta hjärnsektioner som tidigare fastställts med paraformaldehyd och glutaraldehyd via vaskulär perfusion.Sektioner blir stela efter behandling med osmiumtetroxid. Därför kräver vävnadshantering uppmärksamhet från och med då. Också, innan du lägger osmium, se till att dina sektioner är tillplattad som någon lucka kommer sannolikt att resultera i vävnadsfraktur.Öppna en fem milliliter glas ampule av 4%osmium tetroxid och vatten och släpp den inuti en brun glasflaska. Tillsätt fem milliliter 0,2 molarfosfatbuffert och tillsätt sedan ytterligare 10 milliliter 0,1 molarfosfatbuffert för att uppnå en 1%slutlig lösning. Använd en 20 milliliter spruta utrustad med en lång nål för att dra upp 1%osmium-tetroxiden och tillsätt sedan osmiumtetroxiden till en brun glasburk täckt med aluminiumfolie.Efter att ha sett till att preparatet har vecklats ut och tillplattats, tillsätt 1%osmium tetroxid och 0,1 molar PB till provflaskan. Inkubera preparatet i osmiumtetroxid i en timme i rumstemperatur. Extrahera osmiumtetroxiden med ett mikropipet efter inkubationen är klar och skölj sektionerna enligt beskrivningen i protokollet.För att förbereda uranylacetat, placera en 200 milliliter volymetrisk glaskolv som innehåller 100 milliliter 70%etanol på en omrörningsplatta. Tillsätt fyra gram uranylacetat i kolven, linda in en aluminiumfolie för att förhindra utfällning med ljus och rör om kontinuerligt. Torka ut sektionerna i 50%etanol.Fläck med den beredda 4%uranylacetat i en timme och följ upp med serieuttorkande och sköljning enligt beskrivningen i manuskriptet. Ta bort sprutkolven från en 60 milliliter sondmatningsspruta och locket den med en säkerhetsnål. Placera sprutan med den öppna sidan uppåt och tillsätt varje ingrediens i hartsblandningen en efter en.Avsluta med att lägga till 525 mikroliter av DMP30 med en pipet. Flytta kolven i pipet mycket långsamt som DMP är mycket trögflytande. Sätt tillbaka kolven i sprutan.Invertera sprutan några gånger för att blanda innehållet. Färgen kommer att ändras från gult till bärnsten. Evakuera luften inuti sprutan.Placera den sedan på en vipp med kontinuerlig skakning i minst 30 minuter. Tillsätt en volym epoxiharts och en volym aceton till en scintillationsflaska och skaka för att blanda. Applicera denna en till en harts till aceton blandning på vävnaden avsnitt efter den sista aceton skölj hålla i täckt för att undvika aceton avdunstning.Ta bort en till en blandning av harts och aceton efter två till fyra timmar och ersätta den med full harts och inkubera i fyra timmar. Lägg allt hartsavfall i en uppsamlingsbehållare under huven för att polymerisera och som ska kasseras senare. Skär två rektangulära bitar av klar polyklotrifluoreten film och torka dem med 70%etanol.Trimma dem så att det finns minst 1,5 centimeter vävnadsfri plast på varje sida av sektionen, se till att de har samma bredd men höjden på arket på toppen är ungefär 2/3 av bottenarket. Luta långsamt injektionsflaskan och använd en fin kamelpensel och en flexibel mikrospatel för att mycket försiktigt lyfta upp preparatet från botten. Flytta sedan försiktigt sektionen längs injektionsflaskans väggar och överför på det nedersta PCTFE-arket.Avlägsna överskottsharts med en mikrospata och täck försiktigt preparatet med det översta arket. Tryck försiktigt ut eventuella fångade luftbubblor utan att applicera direkt tryck på vävnadsdelen och utplåna överskottshartsen. Använd en lösningsmedelsresistent penna för att märka arken och placera i en ugn vid 60 grader celsius i två till tre dagar för att polymerisera.Dra försiktigt isär de inklämda PCTFE-arken för att öppna dem. Använd en lösningsmedelsresistent penna för att markera sidan av arket som innehåller den adhering avsnitt som markerar den nära vävnaden. Använd en skivstans för att få ett cirkelprov av sektionen och se till att pennmärket är en del av den stansade vävnaden.Pennmärket glimmar när ljus glänser på preparatet. Placera locket på en inbäddningskapselsida uppåt på en kapselhållare. Placera en droppe harts på locket och sätt in den stansade disken inuti locket med vävnadsdelen uppåt.Sätt in en kapsel i locket med hjälp av en skonsam korkskruvsrörelse. Använd fin pincett för att rulla och sänka en tryckt två centimeter lång pappersetikett i kapseln, se till att den passar till krökningen av sidoväggarna av kapseln. Häll inbäddning harts inuti kapseln, fyll upp till kanten av kapseln och använda en spetsig träpinne för att driva vävnaden exemplaret ner till botten.Placera kapseln i ugnen på 60 grader celsius i två till tre dagar för polymerisering. Och fortsätt sedan med snittning och färgning som beskrivs i protokollet. Elektron mikrograf av tillfredsställande bevarande av neuronal cell struktur visar lager cellmembran utan pauser.Cytoplasman är slutligen granulat och utan tomma utrymmen. Mitokondrierna är varken svullna eller krympta med ett bevarat yttre dubbelmembran och intakt inre cristae. Optimal bevarande av neuronala ultrastructure och fina morfologiska detalj är viktigt för att visualisera synaptiska vesiklar och mäta deras avstånd från presynaptiska membranet.Synaptiska vesiklar bör vara distinkta och kantad av ett obrutet enda membran. För att underlätta morphometric analys av synaptisk vesikel distribution, presynaptiska och postsynaptiska membran bör vara parallella i sin kontinuitet bevaras. Elektron mikrograf av defekta bevarande av vävnad struktur visar snedvridning och brott av neuronala cellmembran och förekomsten av markant utvidgade extracellulära utrymmen.Mitokondrierna verkar utspänd och har svullen cristae. I ett annat exempel på defekt vävnad struktur bevarande, fanns det stora vita tomma utrymmen inom cytoplasman i stället för fint granulat cytoplasmatiskt ämne med utvidgade extracellulära utrymmen. En konstgjord membran som forall sannolikt resulterat från mobilisering av lipider under fixering med glutaraldehyd.När du arbetar unga hjärnvävnaden använda 1 molar fosfat buffert som lösningsmedel för alla din lösning så att du håller tonicity så nära som möjligt att nyfödda råtta hjärna och minimera artefaktuell vävnad krympning och eller svullnad. De mikrografer som erhålls med dessa metoder kan användas för att studera de detaljerade morfologi och dimensionella strukturella relationer av ett antal cellulära komponenter än synaptiska vesiklar. Till exempel mitokondrier, golgiapparat och kärnkromatin.Flera steg i detta protokoll kräver kemikalier som kan vara giftiga. Arbeta alltid under draghuv och använd personlig skyddsutrustning vid hantering av aldehyder, osmium, uran och blyföreningar.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

Studera Synaptic Blås Pools hjälp Photoconversion av Styryl Färgämnen

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric ÃƒÅ½Ã‚Â²-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Beredning av Oligomer β-amyloid 1-42 Och induktion av synaptisk plasticitet Nedskrivning av hippocampus Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Vibrodissociation av nervceller från Slices Gnagare Brain att studera synaptisk transmission och bild Presynaptiska Terminaler

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Kvantitativ analys av Synaptic Blås Pool Påfyllnad i odlade Cerebellar Granule nervceller med hjälp av FM-färgämnen

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Mått kapacitans och Ca 2 + Imaging vid enstaka nervterminaler i näthinnan Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Samtidig före och postsynaptiska Elektrofysiologisk inspelning från<em&gt; Xenopus</em&gt; Nerve-muskel samkulturer

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Högupplösta Kvantitativ immunogold Analys av membranreceptorer på näthinnan Ribbon synapser

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

Peering på Brain polysomer med atomkraftsmikroskopi

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analysera Synaptic Modulering av<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotoreceptorer Efter exponering för Förlängd ljus

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...