Name: quantifying subcellular ubiquitin-proteasome activity in the rodent brain
Uploaded: 2019-05-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من قبل صناديق بدء التشغيل من كلية العلوم الزراعية والحياة وكلية العلوم في فرجينيا للتكنولوجيا.

وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات بما في ذلك المواضيع الحيوانية من قبل معهد فرجينيا للفنون التطبيقية وجامعة الولاية المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC).
1. جمع وتشريح أنسجة الدماغ القوارض
ملاحظة: يمكن تطبيق هذا البروتوكول على مجموعة متنوعة م...

<ol>
	<li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+system.">The ubiquitin system.</a> Annu Rev Biochem. 67, 425-479 (1998).</li><li>Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+chain+diversity+at+a+glance.">Ubiquitin chain diversity at a glance.</a> Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).</li><li>Ravid, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+degradation+signals+in+the+ubiquitin-proteasome+system.">Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (9), 679-690 (2008).</li><li>Erpapazoglou, Z., Walker, O., Haguenauer-Tsapis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+roles+of+k63-linked+ubiquitin+chains+in+trafficking.">Versatile roles of k63-linked ubiquitin chains in trafficking.</a> Cells. 3 (4), 1027-1088 (2014).</li><li>Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+ubiquitin+chains:+NF-kappaB+signalling,+cell+death+and+beyond.">Linear ubiquitin chains: NF-kappaB signalling, cell death and beyond.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 15 (8), 503-508 (2014).</li><li>Rieser, E., Cordier, S. M., Walczak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+ubiquitination:+a+newly+discovered+regulator+of+cell+signalling.">Linear ubiquitination: a newly discovered regulator of cell signalling.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (2), 94-102 (2013).</li><li>Collins, G. A., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Logic+of+the+26S+Proteasome.">The Logic of the 26S Proteasome.</a> Cell. 169 (5), 792-806 (2017).</li><li>Bhat, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+19S+proteasome+ATPase+Sug1+plays+a+critical+role+in+regulating+MHC+class+II+transcription.">The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription.</a> Molecular Immunology. 45 (8), 2214-2224 (2008).</li><li>Ezhkova, E., Tansey, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasomal+ATPases+link+ubiquitylation+of+histone+H2B+to+methylation+of+histone+H3.">Proteasomal ATPases link ubiquitylation of histone H2B to methylation of histone H3.</a> Molecular Cell. 13 (3), 435-442 (2004).</li><li>Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+system+as+a+critical+regulator+of+synaptic+plasticity+and+long-term+memory+formation.">The ubiquitin-proteasome system as a critical regulator of synaptic plasticity and long-term memory formation.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 105, 107-116 (2013).</li><li>Hegde, A. N., Upadhya, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+pathway+in+health+and+disease+of+the+nervous+system.">The ubiquitin-proteasome pathway in health and disease of the nervous system.</a> Trends in Neuroscience. 30 (11), 587-595 (2007).</li><li>Adori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+distribution+of+components+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+non-diseased+human+and+rat+brain.">Subcellular distribution of components of the ubiquitin-proteasome system in non-diseased human and rat brain.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54 (2), 263-267 (2006).</li><li>Upadhya, S. C., Ding, L., Smith, T. K., Hegde, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+proteasome+activity+in+the+nucleus+and+the+synaptic+terminals.">Differential regulation of proteasome activity in the nucleus and the synaptic terminals.</a> Neurochemistry International. 48 (4), 296-305 (2006).</li><li>Enenkel, C., Lehmann, A., Kloetzel, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+distribution+of+proteasomes+implicates+a+major+location+of+protein+degradation+in+the+nuclear+envelope-ER+network+in+yeast.">Subcellular distribution of proteasomes implicates a major location of protein degradation in the nuclear envelope-ER network in yeast.</a> EMBO Journal. 17 (21), 6144-6154 (1998).</li><li>Jarome, T. J., Kwapis, J. L., Ruenzel, W. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII,+but+not+protein+kinase+A,+regulates+Rpt6+phosphorylation+and+proteasome+activity+during+the+formation+of+long-term+memories.">CaMKII, but not protein kinase A, regulates Rpt6 phosphorylation and proteasome activity during the formation of long-term memories.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 7, 115 (2013).</li><li>Jarome, T. J., Werner, C. T., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+dependent+protein+degradation+is+critical+for+the+formation+and+stability+of+fear+memory+in+the+amygdala.">Activity dependent protein degradation is critical for the formation and stability of fear memory in the amygdala.</a> PLoS One. 6 (9), e24349 (2011).</li><li>Lopez-Salon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+cascade+is+required+for+mammalian+long-term+memory+formation.">The ubiquitin-proteasome cascade is required for mammalian long-term memory formation.</a> European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1820-1826 (2001).</li><li>Reis, D. S., Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+formation+for+trace+fear+conditioning+requires+ubiquitin-proteasome+mediated+protein+degradation+in+the+prefrontal+cortex.">Memory formation for trace fear conditioning requires ubiquitin-proteasome mediated protein degradation in the prefrontal cortex.</a> Frontiers in Behavior Neuroscience. 7, 150 (2013).</li><li>Rosenberg, T., Elkobi, A., Rosenblum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mAChR-dependent+decrease+in+proteasome+activity+in+the+gustatory+cortex+is+necessary+for+novel+taste+learning.">mAChR-dependent decrease in proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for novel taste learning.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 135, 115-124 (2016).</li><li>Rosenberg, T., Elkobi, A., Dieterich, D. C., Rosenblum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDAR-dependent+proteasome+activity+in+the+gustatory+cortex+is+necessary+for+conditioned+taste+aversion.">NMDAR-dependent proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for conditioned taste aversion.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 130, 7-16 (2016).</li><li>Orsi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+subcellular+changes+in+proteasome+activity+and+linkage-specific+protein+polyubiquitination+in+the+amygdala+during+the+consolidation+and+reconsolidation+of+a+fear+memory.">Distinct subcellular changes in proteasome activity and linkage-specific protein polyubiquitination in the amygdala during the consolidation and reconsolidation of a fear memory.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 157, 1-11 (2019).</li><li>Cullen, P. K., Ferrara, N. C., Pullins, S. E., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context+memory+formation+requires+activity-dependent+protein+degradation+in+the+hippocampus.">Context memory formation requires activity-dependent protein degradation in the hippocampus.</a> Learning and Memory. 24 (11), 589-596 (2017).</li><li>Jarome, T. J., Ferrara, N. C., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII+regulates+proteasome+phosphorylation+and+activity+and+promotes+memory+destabilization+following+retrieval.">CaMKII regulates proteasome phosphorylation and activity and promotes memory destabilization following retrieval.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 128, 103-109 (2016).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+protein+degradation+underlies+destabilization+of+retrieved+fear+memory.">Synaptic protein degradation underlies destabilization of retrieved fear memory.</a> Science. 319 (5867), 1253-1256 (2008).</li><li>Dunah, A. W., Standaert, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D1+receptor-dependent+trafficking+of+striatal+NMDA+glutamate+receptors+to+the+postsynaptic+membrane.">Dopamine D1 receptor-dependent trafficking of striatal NMDA glutamate receptors to the postsynaptic membrane.</a> Journal of Neuroscience. 21 (15), 5546-5558 (2001).</li><li>Kelly, P. T., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+proteins.+Characterization+of+tubulin+and+actin+and+identification+of+a+distinct+postsynaptic+density+polypeptide.">Synaptic proteins. Characterization of tubulin and actin and identification of a distinct postsynaptic density polypeptide.</a> Journal of Cell Biology. 79 (1), 173-183 (1978).</li><li>Mengual, E., Arizti, P., Rodrigo, J., Gimenez-Amaya, J. M., Castano, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+distribution+and+electron+microscopic+subcellular+localization+of+the+proteasome+in+the+rat+CNS.">Immunohistochemical distribution and electron microscopic subcellular localization of the proteasome in the rat CNS.</a> Journal of Neuroscience. 16 (20), 6331-6341 (1996).</li></ol>

هنا، نقوم بتوضيح طريقة فعالة لتحديد التغيرات في النشاط في كل مكان-بروتياسوم عبر مقصورات تحت الخلوية المختلفة في نفس الحيوان. وفي الوقت الراهن، اقتصرت معظم المحاولات الرامية إلى قياس التغيرات دون الخلوية في نشاط النظام البروتيسوم في كل من يوبيكويتين على مقصورة واحدة لكل عينة، مما أدى إلى ...

نظام ubiquitin-proteasome (UPS) هو شبكة معقدة من هياكل البروتين المترابطة والأربطة التي تتحكم في تدهور معظم البروتينات قصيرة الأجل في الخلايا1. في هذا النظام، يتم وضع علامة على البروتينات للتحلل أو غيرها من العمليات الخلوية / مصائر من قبل فيوكويتين المعدل الصغيرة. يمكن للبروتين المستهدف الحصول على 1-7 تعديلات يوبيكويتين، والتي يمكن أن تربط معا في واحد من سبعة مواقع يسين (K) (K6، K11، K27، K29، K33، K48 و K63) أو ميثيونين N-الطرفية (M1؛ كما هو معروف باسم الخطي) في ubiquitin السابقة2. بعض من هذه العلامات polyubiquitin هي تدهور محددة (K48)3, في حين أن البعض الآخر مستقلة إلى حد كبير عن عملية تدهور البروتين (M1)4,5,6. وهكذا، فإن عملية انتشار البروتين معقدة بشكل لا يصدق والقدرة على قياس التغيرات في علامة بوليوبيكتين محددة أمر بالغ الأهمية لفهم دور ذلك التعديل في الأداء الخلوي في نهاية المطاف. زيادة تعقيد دراسة هذا النظام، وبروتياسوم، وهو الهيكل الحفاز للUPS7، على حد سواء يتحلل البروتينات ولكن يمكن أيضا أن تشارك في عمليات أخرى غير بروتيوليتيك8،9. ليس من المستغرب بعد ذلك، منذ اكتشافه الأولي، وقد تورط النشاط العادي والشاذ في ubiquitin-proteasome في تكوين الذاكرة على المدى الطويل ومجموعة متنوعة من حالات المرض، بما في ذلك العديد من العصبية، العصبية والنفسية اضطرابات10,11. ونتيجة لذلك، فإن الأساليب التي يمكن أن تحدد بشكل فعال وفعال نشاط UPS في الدماغ حاسمة لفهم في نهاية المطاف كيف يتم تنظيم هذا النظام في حالات المرض والتطوير النهائي لخيارات العلاج التي تستهدف في كل مكان و / أو أداء بروتياسوم.
هناك عدد من القضايا في قياس النشاط في كل مكان بروتيسوم في أنسجة الدماغ من الفئران والفئران، والتي هي النظم النموذجية الأكثر شيوعا المستخدمة لدراسة وظيفة يو بي سي، بما في ذلك 1) تنوع التعديلات ubiquitin، و 2) توزيع و التنظيم التفاضلي لUPS يعمل عبر المقصورات دون الخلوية12،13،14. على سبيل المثال، العديد من المظاهرات المبكرة من وظيفة ubiquitin-بروتياسوم في الدماغ أثناء تكوين الذاكرة تستخدم lysates الخلية بأكملها وأشار إلى زيادات تعتمد على الوقت في كل من البروتين في كل مكان والنشاط بروتياسوم15، 16 سنة , 17 سنة , 18 سنة , 19 سنة , 20.ومع ذلك، وجدنا مؤخرا أن النشاط ubiquitin-proteasome تختلف على نطاق واسع عبر المقصورات دون الخلوية استجابة للتعلم، مع زيادات متزامنة في بعض المناطق والانخفاض في مناطق أخرى، وهو نمط يختلف اختلافا كبيرا من ما تم الإبلاغ عنه سابقا في خلية كاملة lysates21. وهذا يتسق مع الحد من نهج الخلية بأكملها، كما أنه لا يمكن فصل مساهمة التغييرات في نشاط UPS عبر مقصورات دون الخلوية المختلفة. على الرغم من أن الدراسات الحديثة قد استخدمت بروتوكولات الكسور متشابك لدراسة UPS على وجه التحديد في نقاط الاشتباك العصبي استجابة للتعلم22،23،24، والأساليب المستخدمة occlude القدرة على قياس النووية والسيتوبلازمية في كل مكان بروتياسوم التغيرات في نفس الحيوان. وهذا يؤدي إلى حاجة لا لزوم لها لتكرار التجارب عدة مرات، وجمع كسر دون الخلوية مختلفة في كل. وهذا لا يؤدي فقط إلى خسارة أكبر في الأرواح الحيوانية، ولكنه يلغي القدرة على مقارنة نشاط يو بي سي مباشرة عبر مقصورات دون خلوية مختلفة استجابة لحدث معين أو أثناء حالة مرض معين. وبالنظر إلى أن أهداف البروتين من ubiquitin وبروتياسوم تختلف على نطاق واسع في جميع أنحاء الخلية، وفهم كيف يختلف الإشارات ubiquitin-proteasome في مقصورات دون الخلوية متميزة أمر بالغ الأهمية لتحديد الدور الوظيفي للUPS في الدماغ أثناء تكوين الذاكرة والاضطرابات العصبية والعصبية والنفسية.
لتلبية هذه الحاجة، قمنا مؤخرا بتطوير إجراء حيث يمكن جمع الكسور النووية والسيتوبلازمية ومتشابك لمنطقة الدماغ معينة من نفس الحيوان21. بالإضافة إلى ذلك، لحساب كمية محدودة من البروتين التي يمكن الحصول عليها من جمع كسور دون الخلوية متعددة من نفس العينة، ونحن الأمثل البروتوكولات المنشأة سابقا لفحص في المختبر نشاط بروتياسوم والربط محددة البروتين في كل مكان في الخلايا اللمعة التي تم جمعها من أنسجة الدماغ القوارض. باستخدام هذا البروتوكول، تمكنا من جمع ومقارنة مباشرة التغيرات تعتمد على التعلم في النشاط بروتياسوم، K48، K63، M1 ومستويات تعدد النقاط البروتينية الشاملة في النواة والسيتوبلازم وفي نقاط الاشتباك العصبي في اللوزة الجانبية للفئران. هنا، ونحن نصف بالتفصيل إجراءنا ( الشكل1)،والتي يمكن أن تحسن بشكل كبير فهمنا لكيفية مشاركة UPS في تشكيل الذاكرة على المدى الطويل ومختلف حالات المرض. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن النشاط البروتياسوم في المختبر التي نوقشت في بروتوكولنا، على الرغم من استخدامها على نطاق واسع، لا يقيس مباشرة نشاط المجمعات بروتياسوم 26S كاملة. بدلا من ذلك، يقيس هذا الفحص نشاط جوهر 20S، وهذا يعني أنه يمكن أن يكون فقط بمثابة وكيل لفهم نشاط الأساسية نفسها بدلا من مجمع 26S بروتياسوم بأكمله.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:878px;" width="878">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">0.5M EDTA</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">15575020</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">20S Proteasome Activity Kit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>APT280</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">ATP</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">FERR1441</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Beta-actin antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>4967S</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Beta-tubulin antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>2128T</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BioTek Synergy H1 plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>VATECHH1MT3</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN19024280</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">clasto lactacystin b-lactone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L7035</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cryogenic cup</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>033377B</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMSO</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Varous other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">DTT</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">D0632</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Glycerol</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">G5516</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">H3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1791</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">HEPES</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">H3375</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SA48</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">IGEPAL (NP-40)</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">I3021</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">K48 Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab140601</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">K63 Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab179434</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">KCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">P9541</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KONTES tissue grinder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885300-0002</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laemmli sample buffer</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Linear Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Life Sensors</td>
			<td>AB-0130-0100</td>
			<td>Only M1 antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">MgCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">442611</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000213</td>
			<td>Various other manufacturers/models</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">myr-AIP</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-P212-0500</td>
			<td>Carried by Millipore-Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">NaCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">S3014</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Odyssey Fc Imaging System</td>
			<td>LiCor</td>
			<td>2800-02</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Phosphatase Inhibitor</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">524625</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Precision Plus Protein Standard</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>161-0373</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Protease Inhibitor</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">P8340</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PSD95 antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>3450T</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:222px;">SDS</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">L3771</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SS255</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:222px;">Sucrose</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">S0389</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">TBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62938</td>
			<td>Varous other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:50px;width:222px;">Tris</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">T1503</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;">Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;">Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-PW8810</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying subcellular ubiquitin-proteasome activity in the rodent brain

نظام فيوكويتين بروتياسوم هو منظم رئيسي لتدهور البروتين ومجموعة متنوعة من العمليات الخلوية الأخرى في eukaryotes. في الدماغ، ترتبط الزيادات في النشاط في يوبيكويتين بروتياسوم حاسمة للدونة متشابك وتكوين الذاكرة والتغيرات الشاذة في هذا النظام مع مجموعة متنوعة من الاضطرابات العصبية والعصبية والنفسية. واحدة من القضايا في دراسة العمل في كل مكان بروتيسوم في الدماغ هو أنه موجود في جميع المقصورات الخلوية, التي أهداف البروتين, دور وظيفي وآليات التنظيم يمكن أن تختلف على نطاق واسع. ونتيجة لذلك، فإن القدرة على المقارنة المباشرة لاستهداف بروتين في وبيكوتين الدماغ والنشاط الحفاز البروتياسوم في مقصورات تحت الخلية المختلفة داخل نفس الحيوان أمر بالغ الأهمية لفهم كامل كيف يساهم UPS في اللدونة متشابك، الذاكرة والمرض. الطريقة الموصوفة هنا تسمح بجمع الكسور النووية والسيتوبلازمية والخام متشابك من نفس القوارض (الفئران) الدماغ، تليها القياس الكمي في وقت واحد من النشاط الحفاز بروتياسوم (بشكل غير مباشر، وتوفير نشاط من جوهر بروتياسوم فقط) والربط محددة في كل من يوبيكويتين وضع العلامات البروتين. وهكذا، يمكن استخدام هذه الطريقة لمقارنة مباشرة التغيرات دون الخلوية في النشاط في يوبيكويتين بروتياسوم في مناطق الدماغ المختلفة في نفس الحيوان خلال اللدونة متشابك، وتشكيل الذاكرة وحالات المرض المختلفة. ويمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لتقييم التوزيع دون الخلوي ووظيفة البروتينات الأخرى داخل نفس الحيوان.

باستخدام الإجراء الموضح هنا، تم جمع الكسور النووية والسيتوبلازمية ومتشابك من اللوزة الجانبية لدماغ الفئران (الشكل 1). تم تأكيد نقاء الكسور الفردية عن طريق النشاف الغربي، والتحقيق مع الأجسام المضادة ضد البروتينات التي ينبغي إثراؤها أو استنفادها في lysate. ف?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain at JoVE.com

Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain

تم تصميم هذا البروتوكول لتحديد قدر ة نشاط نظام يوبيكويتين بروتياسوم (UPS) بكفاءة في مقصورات خلوية مختلفة من الدماغ القوارض. ويتمكن المستخدمون من فحص أداء شركة UPS في الكسور النووية والسيتوبلازمية ومتشابكة في نفس الحيوان، مما يقلل من مقدار الوقت وعدد الحيوانات اللازمة لإجراء هذه التحليلات المعقدة.

قياس النشاط شبه الخلوي يوبيكويتين بروتياسوم في الدماغ القوارض

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases ...

يقيس هذا البروتوكول مستويات البروتين دون الخلية في كل مكان والنشاط البروتيفي في دماغ القوارض مما يسمح في إطار الموضوعات بإجراء مقارنات حول كيفية تغير النشاط في كل مكان أو البروتيم استجابة للنشاط الخلوي أو التعلم أو المرض. يسمح البروتوكول بجمع الكسور المتشابكة والسيكتوبلازمية والنووية من نفس دماغ القوارض. والتقليل إلى أدنى حد من الخسارة، يمكن أن يتم ذلك بكميات صغيرة من الأنسجة ومعدات مختبرية أساسية.إثبات الإجراء سيكون تايلور مكفادين، طالب دراسات عليا من مختبري. ابدأ هذا الإجراء مع جمع وتشريح أنسجة الدماغ القوارض كما هو موضح في بروتوكول النص. التأكد من أن نصف الكرة الأرضية المستخدم متوازن في ظروف الاستخراج لكل مجموعة تجريبية.إزالة 1.5 ملليلتر الطرد المركزي الأنابيب الدقيقة التي تحتوي على نصف الكرة الأرضية واحد من المنطقة ذات الاهتمام من الفريزر ناقص 80 درجة مئوية. باستخدام مشرط، نقل أنسجة المخ المجمدة إلى اثنين ملليلتر الزجاج التفلون التجانس. إضافة 500 ميكرولترات من عازلة التحلل إلى أنبوب تفلون.باستخدام الآفة B، التجانس نفس الأنسجة مع 15 السكتات الدماغية حتى لا يوجد كمية مرئية من المواد الصلبة موجودة. استخدم حركة الدوران أثناء كل ضربة. مع ماصة 1000 ميكرولتر، نقل العينة المتجانسة إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر microcentrifuge.ضع الأنبوب على الثلج الرطب وحضن لمدة 30 دقيقة. وضع الأنبوب في microcentrifuge وتدور لمدة 10 دقائق في 845 مرات ز في أربع درجات مئوية. بعد الانتهاء، وإزالة بعناية عظمى عن طريق الأنابيب ووضعها في أنبوب جديد microcentrifuge 1.5 ملليلتر.هذا هو الكسر السيتوبلازمي إضافة 50 ميكرولترات من استخراج العازلة إلى بيليه الناتجة و resuspend عن طريق الأنابيب. لا دوامة بيليه.وضع أنبوب يحتوي على بيليه resuspended على الجليد واحتضان لمدة 30 دقيقة. ثم الطرد المركزي الأنبوب لمدة 20 دقيقة في 21، 456 مرات ز في أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي، وإزالة بعناية سوبرانت عن طريق الأنابيب ووضع في أنبوب جديد 1.5 ملليلتر microcentruge.هذا هو الكسر النووي التجانس نصف الكرة الأرضية واحد من المنطقة ذات الأهمية كما كان من قبل باستثناء استخدام 500 ميكرولترات من العازلة TEVP بدلا من العازلة تحلل. باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر، نقل عينة متجانسة إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر microcentrifuge.الطرد المركزي العينة في 1،000 مرات ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. جمع سوبرنات ونقلها إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر microcentrifuge باستخدام 1، 000 ماصة ميكرولتر. جهاز طرد مركزي العينة في 10،000 مرات ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية.تخلص من الكريه الأصلي الذي يحتوي على النوى والحطام الكبير. نقل عظمى إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر microcentrifuge. هذا هو الكسر السيتوسوليكإضافة 50 ميكرولترات من العازلة التجانس إلى بيليه و resuspend عن طريق الأنابيب حتى لا تكون المواد الصلبة مرئية. الطرد المركزي العينة في 20، 000 مرة ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. نقل عظمى إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر microcentrifuge.هذا هو جزء الغشاء السيني بالزيتان الخام. لإعداد الفحص ، prewarm قارئ لوحة إلى 37 درجة مئوية وعقد من خلال المدى. تعيين الإثارة إلى 360 نانومتر والانبعاثات إلى 460 نانومتر.إذا كان 96 لوحة جيدا المستخدمة واضحة، تعيين موقف البصريات إلى أسفل. إذا تم استخدام لوحة 96 جيدا الظلام، تعيين موقف البصريات إلى الأعلى. برنامج تشغيل الحركية مع وقت ساعتين المسح كل 30 دقيقة.إعادة تشكيل 20S 10X المخزن المؤقت للمحسّن المتوفرة في المجموعة مع 13.5 ملليلتر من الماء فائقة الخطورة. إضافة 14 ميكرولترات من ATP 100 ملليمولار إلى المخزن المؤقت 1X الآن. وهذا يعزز بشكل كبير نشاط proteasome في العينات ويحسن موثوقية المقايسة.إعادة تشكيل معيار AMC المقدمة في مجموعة مع 100 ميكرولترات من DMSO. تنفيذ الخطوات باستخدام معيار AMC في ظروف الإضاءة الداكنة أو في ظروف الإضاءة المنخفضة حيث أن المعيار حساس للضوء. إنشاء منحنى قياسي من AMC من سلسلة من تركيزات AMC عالية إلى منخفضة.سيتم استخدام هذا المنحنى لمعايرة قارئ لوحة وتحليل النشاط proteasome في العينات المتجانسة. إعادة تشكيل الركيزة بروتية المقدمة في مجموعة مع 65 ميكرولترات من DMSO. أيضا تنفيذ هذه الخطوة في الظلام أو في ظروف الإضاءة الخافتة كما الركيزة هو الضوء الحساسة.ثم إنشاء تخفيف واحد إلى 20 من الركيزة proteasome في أنبوب جديد 1.5 ملليلتر microcentuge باستخدام 20S العازلة المقايسة. إضافة كمية عادية من العينات المطلوبة إلى لوحة 96 جيدا. تشغيل كل عينة في مكررة.كمية العينة اللازمة تختلف على أساس إعداد الأنسجة. عموما، 10 إلى 20 ميكروغرام كافية لأي كسر دون الخلية. جلب حجم العينة جيدا إلى 80 ميكرولترات مع المياه فائقة الpure.يعتمد المبلغ المضاف على حجم العينة المضافة. في بئرين منفصلين، أضف 80 ميكرولترات من الماء وحده. هذه ستكون الفراغات المقايسةإضافة 10 microliters من 20S المخزن المؤقت إلى كل جيدا بما في ذلك الفراغات المقايسة. استخدم مكرر أو ماص آلي لضمان حجم المقايسة المتسق عبر الآبار. أطفئ الأنوار أو أدخل غرفة مظلمة.أضف جميع 100 ميكرولترات من معايير AMC المخففة إلى بئر جديد باستخدام بئر واحد لكل معيار. في الظلام، استخدم مكرر أو ماصة آلية لإضافة 10 ميكرولترات من الركيزة البروتية المخففة إلى الآبار التي تحتوي على عينات وفراغات مقايسة ولكن ليس معيار AMC. ضع اللوحة في قارئ اللوحة وابدأ تشغيل الحركة.تنفيذ القياس الكمي للعلامات متعددة polyubiquitin في مختلف الكسور دون الخلوية التي تم جمعها من أنسجة الدماغ القوارض باستخدام مجموعة متنوعة من بروتوكولات النشاف الغربية القياسية في تركيبة مع الأجسام المضادة متعددة الاستخدامات الفريدة الخاصة بالروابط. بعض الصور ubiquitin لطخة الغربية سوف توفر أعمدة من عصابات متميزة في حين أن البعض الآخر ينتج نمط مثل تشويه مع خطوط قليلة أو معدومة واضحة. للحصول على تحديد كمي لللطخات الغربية المُصوَّرة، ارسم صندوقًا حول العمود الذي يمتد سلم المعايير الجزيئية بأكمله.ضبط مربع إذا ubiquitin تلطيخ لا تمتد من خلال سلم كامل. وهذا أمر شائع بالنسبة للتعديلات 48 lysine ويختلف على نطاق واسع عبر المقصورات دون الخلوية. وأخيراً، اطرح الخلفية التي يتم حسابها على أنها متوسط الكثافة البصرية للخلفية المحيطة مباشرة بالعمود من جميع الجوانب.يظهر هنا هو القياس الكمي للنشاط البروتيم في كسور مختلفة تم جمعها من اللوزة الجانبي من نفس الحيوان. خلال فحص النشاط البرفي ، زادت وحدات الفلورسنت النسبية المكتشفة من بداية إلى نهاية المقايسة في الكسر المتشابك ، والكسر السيتوبلازمي ، والكسر النووي. منع مثبطات البروتية beta-lac RFUs من التغير عبر الجلسة.ولوحظت اختلافات دون خلوية في النشاط البروتيمي في اللوزة الجانبي لنفس الحيوان. وقد تم الكشف عن زيادة في النشاط النووي في الحيوانات المدربة نسبة إلى الضوابط التي تتوافق مع انخفاض في النشاط داخل الجزء متشابك. وظل نشاط البروتيلازم السيتوبلازمي عند خط الأساس.تظهر هنا اختلافات دون الخلية في كل مكان البروتين الخاص بالروابط في اللوزة الجانبي من نفس الحيوان بعد التعلم. كانت هناك زيادة في الانتشار الكلي في الكسر النووي بعد التعلم الذي يرتبط بانخفاض في الكسر السيتوبلازمي. بعد التعلم، زادت الكسور في كل مكان خطية في الكسور النووية ولكن ليس الكسور السيتوبلازمية أو متشابك.ومن المثير للاهتمام، ارتفع في كل مكان K63 في الجزء النووي بعد التعلم الذي يرتبط مع انخفاض في جزء متشابك. في حين أن K48 uniquitination زاد في الكسور النووية والسيكتوبلازمية بعد التعلم ولكن ليس في جزء متشابك. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه البروتوكولة لفهم التوزيع دون الخلوية وظيفة البروتينات الأخرى داخل نفس الحيوان.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Neuroscience

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

الرنين المغناطيسي الوظيفي في وقت واحد والكهربية في الدماغ القوارض

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

قياس نشاط رابطة الدول المستقلة عناصر التنظيم في الشبكية بواسطة الماوس Electroporation يزدرع

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

مباشرة داخل البطين تسليم المخدرات الى القوارض الجهاز العصبي المركزي

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

في الجسم الحي Optogenetic تحفيز الجهاز العصبي المركزي القوارض

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

نشاط التيلوميراز في مناطق مختلفة من الدماغ ماوس: التيلوميراز غير المشعة كرر بروتوكول التضخيم (TRAP) الفحص

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

في وقت واحد تسجيل الكهربية والصغرى، والحقن وكلاء المثبطة في الدماغ القوارض

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

الإبر مخصصة لميكروينجيكشنز في الدماغ القوارض

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

تقييم كثافة المشبك في الدماغ القوارض هيبوكامبال شرائح

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

تسجيل وتعديل النشاط صرعية في الدماغ القوارض شرائح بالإضافة إلى صفائف ميكروليكترودي

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

آثار Neurotrauma الناجمة عن الانفجار على القوارض المضغوط الأوسط الشرايين الدماغية

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...