Name: quantifying subcellular ubiquitin-proteasome activity in the rodent brain
Uploaded: 2019-05-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door Startup funds van het College of landbouw en Life Sciences en het College of Science bij Virginia Tech. T.M. wordt ondersteund door het George Washington Carver-programma van Virginia Tech.

Alle procedures, met inbegrip van dierproef personen, zijn goedgekeurd door het Virginia Polytechnic Institute en de State University institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC).
1. verzameling en dissectie van het hersenweefsel van knaagdieren
Opmerking: Dit protocol kan worden toegepast op een verscheidenheid van hersengebieden en gebruikt met verschillende weefsel verzameling procedures. Hieronder is de procedure die wordt gebruikt in ons...

<ol>
	<li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+system.">The ubiquitin system.</a> Annu Rev Biochem. 67, 425-479 (1998).</li><li>Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+chain+diversity+at+a+glance.">Ubiquitin chain diversity at a glance.</a> Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).</li><li>Ravid, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+degradation+signals+in+the+ubiquitin-proteasome+system.">Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (9), 679-690 (2008).</li><li>Erpapazoglou, Z., Walker, O., Haguenauer-Tsapis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+roles+of+k63-linked+ubiquitin+chains+in+trafficking.">Versatile roles of k63-linked ubiquitin chains in trafficking.</a> Cells. 3 (4), 1027-1088 (2014).</li><li>Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+ubiquitin+chains:+NF-kappaB+signalling,+cell+death+and+beyond.">Linear ubiquitin chains: NF-kappaB signalling, cell death and beyond.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 15 (8), 503-508 (2014).</li><li>Rieser, E., Cordier, S. M., Walczak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+ubiquitination:+a+newly+discovered+regulator+of+cell+signalling.">Linear ubiquitination: a newly discovered regulator of cell signalling.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (2), 94-102 (2013).</li><li>Collins, G. A., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Logic+of+the+26S+Proteasome.">The Logic of the 26S Proteasome.</a> Cell. 169 (5), 792-806 (2017).</li><li>Bhat, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+19S+proteasome+ATPase+Sug1+plays+a+critical+role+in+regulating+MHC+class+II+transcription.">The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription.</a> Molecular Immunology. 45 (8), 2214-2224 (2008).</li><li>Ezhkova, E., Tansey, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasomal+ATPases+link+ubiquitylation+of+histone+H2B+to+methylation+of+histone+H3.">Proteasomal ATPases link ubiquitylation of histone H2B to methylation of histone H3.</a> Molecular Cell. 13 (3), 435-442 (2004).</li><li>Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+system+as+a+critical+regulator+of+synaptic+plasticity+and+long-term+memory+formation.">The ubiquitin-proteasome system as a critical regulator of synaptic plasticity and long-term memory formation.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 105, 107-116 (2013).</li><li>Hegde, A. N., Upadhya, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+pathway+in+health+and+disease+of+the+nervous+system.">The ubiquitin-proteasome pathway in health and disease of the nervous system.</a> Trends in Neuroscience. 30 (11), 587-595 (2007).</li><li>Adori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+distribution+of+components+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+non-diseased+human+and+rat+brain.">Subcellular distribution of components of the ubiquitin-proteasome system in non-diseased human and rat brain.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54 (2), 263-267 (2006).</li><li>Upadhya, S. C., Ding, L., Smith, T. K., Hegde, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+proteasome+activity+in+the+nucleus+and+the+synaptic+terminals.">Differential regulation of proteasome activity in the nucleus and the synaptic terminals.</a> Neurochemistry International. 48 (4), 296-305 (2006).</li><li>Enenkel, C., Lehmann, A., Kloetzel, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+distribution+of+proteasomes+implicates+a+major+location+of+protein+degradation+in+the+nuclear+envelope-ER+network+in+yeast.">Subcellular distribution of proteasomes implicates a major location of protein degradation in the nuclear envelope-ER network in yeast.</a> EMBO Journal. 17 (21), 6144-6154 (1998).</li><li>Jarome, T. J., Kwapis, J. L., Ruenzel, W. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII,+but+not+protein+kinase+A,+regulates+Rpt6+phosphorylation+and+proteasome+activity+during+the+formation+of+long-term+memories.">CaMKII, but not protein kinase A, regulates Rpt6 phosphorylation and proteasome activity during the formation of long-term memories.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 7, 115 (2013).</li><li>Jarome, T. J., Werner, C. T., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+dependent+protein+degradation+is+critical+for+the+formation+and+stability+of+fear+memory+in+the+amygdala.">Activity dependent protein degradation is critical for the formation and stability of fear memory in the amygdala.</a> PLoS One. 6 (9), e24349 (2011).</li><li>Lopez-Salon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+cascade+is+required+for+mammalian+long-term+memory+formation.">The ubiquitin-proteasome cascade is required for mammalian long-term memory formation.</a> European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1820-1826 (2001).</li><li>Reis, D. S., Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+formation+for+trace+fear+conditioning+requires+ubiquitin-proteasome+mediated+protein+degradation+in+the+prefrontal+cortex.">Memory formation for trace fear conditioning requires ubiquitin-proteasome mediated protein degradation in the prefrontal cortex.</a> Frontiers in Behavior Neuroscience. 7, 150 (2013).</li><li>Rosenberg, T., Elkobi, A., Rosenblum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mAChR-dependent+decrease+in+proteasome+activity+in+the+gustatory+cortex+is+necessary+for+novel+taste+learning.">mAChR-dependent decrease in proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for novel taste learning.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 135, 115-124 (2016).</li><li>Rosenberg, T., Elkobi, A., Dieterich, D. C., Rosenblum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDAR-dependent+proteasome+activity+in+the+gustatory+cortex+is+necessary+for+conditioned+taste+aversion.">NMDAR-dependent proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for conditioned taste aversion.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 130, 7-16 (2016).</li><li>Orsi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+subcellular+changes+in+proteasome+activity+and+linkage-specific+protein+polyubiquitination+in+the+amygdala+during+the+consolidation+and+reconsolidation+of+a+fear+memory.">Distinct subcellular changes in proteasome activity and linkage-specific protein polyubiquitination in the amygdala during the consolidation and reconsolidation of a fear memory.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 157, 1-11 (2019).</li><li>Cullen, P. K., Ferrara, N. C., Pullins, S. E., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context+memory+formation+requires+activity-dependent+protein+degradation+in+the+hippocampus.">Context memory formation requires activity-dependent protein degradation in the hippocampus.</a> Learning and Memory. 24 (11), 589-596 (2017).</li><li>Jarome, T. J., Ferrara, N. C., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII+regulates+proteasome+phosphorylation+and+activity+and+promotes+memory+destabilization+following+retrieval.">CaMKII regulates proteasome phosphorylation and activity and promotes memory destabilization following retrieval.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 128, 103-109 (2016).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+protein+degradation+underlies+destabilization+of+retrieved+fear+memory.">Synaptic protein degradation underlies destabilization of retrieved fear memory.</a> Science. 319 (5867), 1253-1256 (2008).</li><li>Dunah, A. W., Standaert, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D1+receptor-dependent+trafficking+of+striatal+NMDA+glutamate+receptors+to+the+postsynaptic+membrane.">Dopamine D1 receptor-dependent trafficking of striatal NMDA glutamate receptors to the postsynaptic membrane.</a> Journal of Neuroscience. 21 (15), 5546-5558 (2001).</li><li>Kelly, P. T., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+proteins.+Characterization+of+tubulin+and+actin+and+identification+of+a+distinct+postsynaptic+density+polypeptide.">Synaptic proteins. Characterization of tubulin and actin and identification of a distinct postsynaptic density polypeptide.</a> Journal of Cell Biology. 79 (1), 173-183 (1978).</li><li>Mengual, E., Arizti, P., Rodrigo, J., Gimenez-Amaya, J. M., Castano, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+distribution+and+electron+microscopic+subcellular+localization+of+the+proteasome+in+the+rat+CNS.">Immunohistochemical distribution and electron microscopic subcellular localization of the proteasome in the rat CNS.</a> Journal of Neuroscience. 16 (20), 6331-6341 (1996).</li></ol>

Hier tonen we een efficiënte methode voor het kwantificeren van veranderingen in ubiquitin-proteasome activiteit over verschillende subcellulaire compartimenten in hetzelfde dier. Momenteel zijn de meeste pogingen om subcellulaire veranderingen in activiteit van het ubiquitin-proteasome systeem te meten beperkt tot één compartiment per monster, wat resulteerde in de noodzaak om experimenten te herhalen. Dit leidt tot aanzienlijke kosten en verlies van dierlijk leven. Ons protocol lost dit probleem op door hemisferen t...

Het ubiquitin-proteasome systeem (UPS) is een complex netwerk van onderling verbonden eiwit structuren en ligasen die de afbraak van de meeste kortstondige eiwitten in de cellen1regelt. In dit systeem, eiwitten zijn gemarkeerd voor afbraak of andere cellulaire processen/Fates door de kleine modifier ubiquitin. Een doeleiwit kan 1-7 ubiquitine-modificaties verwerven, die samen kunnen linken op een van de zeven lysine (K)-sites (K6, K11, K27, K29, K33, K48 en K63) of de N-terminale methionine (M1; zoals lineair genoemd) in de vorige ubiquitine2. Sommige van deze polyubiquitin Tags zijn afbraak-specifieke (K48)3, terwijl anderen zijn grotendeels onafhankelijk van het eiwitafbraak proces (M1)4,5,6. Zo is het eiwit Ubiquitination proces ongelooflijk complex en het vermogen om veranderingen in een specifieke polyubiquitin-tag te kwantificeren is van cruciaal belang om uiteindelijk de rol van die gegeven modificatie in cellulaire werking te begrijpen. Door de studie van dit systeem verder te compliceren, is het proteasome, dat de katalytische structuur van de ups7is, beide eiwitten degradeert, maar kan het ook worden betrokken bij andere niet-Proteolytische processen8,9. Niet verrassend dan, sinds de eerste ontdekking, normale en afwijkende ubiquitin-proteasome activiteit is betrokken bij de lange-termijn Geheugenvorming en een verscheidenheid van ziektetoestanden, met inbegrip van vele neurologische, neurodegeneratieve en psychiatrische aandoeningen10,11. Als gevolg hiervan zijn methoden die effectief en efficiënt de activiteit van UPS in de hersenen kunnen kwantificeren essentieel om uiteindelijk te begrijpen hoe dit systeem wordt ontregeld in ziektetoestanden en de uiteindelijke ontwikkeling van behandelingsopties die gericht zijn op ubiquitine en/of proteasoom functioneren.
Er zijn een aantal problemen bij het kwantificeren van ubiquitine-proteasome activiteit in hersenweefsel van ratten en muizen, de meest voorkomende modelsystemen die worden gebruikt om de UPS-functie te bestuderen, waaronder 1) de diversiteit van ubiquitine-modificaties, en 2) distributie en differentiële regulering van ups die in subcellulaire compartimenten12,13en14functioneren. Bijvoorbeeld, veel van de vroege demonstraties van ubiquitin-proteasoom functie in de hersenen tijdens Geheugenvorming gebruikt hele celllysates en aangegeven tijdafhankelijke verhogingen in beide eiwit Ubiquitination en proteasoom activiteit15, 16 , 17 , 18 , 19 , 20. we vonden echter onlangs dat ubiquitin-proteasome-activiteit sterk varieerde over subcellulaire compartimenten in reactie op leren, met gelijktijdige stijgingen in sommige regio's en dalingen in andere, een patroon dat aanzienlijk verschilt van wat eerder werd gerapporteerd in de hele cel eiwitlysaten21. Dit is in overeenstemming met de beperking van een hele celbenadering, omdat het de bijdrage van veranderingen in de UPS-activiteit in verschillende subcellulaire compartimenten niet kan ontkoppelen. Hoewel meer recente studies hebben gebruikt synaptische fractie protocollen voor het bestuderen van de ups specifiek op synapsen in reactie op het leren van22,23,24, de gebruikte methoden occlude de mogelijkheid om te meten nucleaire en cytoplasmische ubiquitine-proteasome veranderingen in hetzelfde dier. Dit resulteert in een onnodige noodzaak om experimenten meerdere malen herhalen, het verzamelen van een andere subcellulaire Fractie in elk. Dit resulteert niet alleen in een groter verlies van dier levens, maar elimineert de mogelijkheid om de UPS-activiteit direct te vergelijken met verschillende subcellulaire compartimenten in reactie op een bepaalde gebeurtenis of tijdens een specifieke ziektestatus. Gezien het feit dat eiwit doelen van ubiquitine en het proteasoom sterk variëren in de cel, begrijpen hoe ubiquitine-proteasoom signalering verschilt in verschillende subcellulaire compartimenten is essentieel voor het identificeren van de functionele rol van de ups in de hersenen tijdens Geheugenvorming en neurologische, neurodegeneratieve en psychiatrische stoornissen.
Om deze behoefte aan te pakken, hebben we onlangs een procedure ontwikkeld waarin nucleaire, cytoplasmatische en synaptische fracties kunnen worden verzameld voor een bepaald hersengebied van hetzelfde dier21. Om rekening te houden met de beperkte hoeveelheid eiwitten die kan worden verkregen uit het verzamelen van meerdere subcellulaire fracties uit hetzelfde monster, hebben we eerder vastgestelde protocollen geoptimaliseerd om in vitro proteasoom activiteit en koppelings-specifieke eiwit ubiquitinatie in gelyseerd cellen verzameld uit knaagdier hersenweefsel. Met behulp van dit protocol, we waren in staat om te verzamelen en direct te vergelijken leer afhankelijke veranderingen in proteasoom activiteit, K48, K63, M1 en algehele eiwit polyubiquitination niveaus in de Nucleus en cytoplasma en bij synapsen in de laterale amygdala van ratten. Hier beschrijven we in detail onze procedure (Figuur 1), die ons begrip van hoe de ups betrokken is bij de lange termijn Geheugenvorming en verschillende ziektetoestanden aanzienlijk zou kunnen verbeteren. Echter, opgemerkt moet worden dat de in vitro proteasoom activiteit die in ons protocol wordt besproken, terwijl op grote schaal gebruikt, niet direct de activiteit van complete 26s proteasoom complexen meet. Eerder, deze bepaling meet de activiteit van de kern van de 20s, wat betekent dat het kan alleen dienen als een volmacht om te begrijpen van de activiteit van de kern zelf in tegenstelling tot de gehele 26s proteasoom complex.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:878px;" width="878">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">0.5M EDTA</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">15575020</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">20S Proteasome Activity Kit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>APT280</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">ATP</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">FERR1441</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Beta-actin antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>4967S</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Beta-tubulin antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>2128T</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BioTek Synergy H1 plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>VATECHH1MT3</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN19024280</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">clasto lactacystin b-lactone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L7035</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cryogenic cup</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>033377B</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMSO</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Varous other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">DTT</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">D0632</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Glycerol</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">G5516</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">H3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1791</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">HEPES</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">H3375</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SA48</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">IGEPAL (NP-40)</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">I3021</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">K48 Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab140601</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">K63 Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab179434</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">KCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">P9541</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KONTES tissue grinder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885300-0002</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laemmli sample buffer</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Linear Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Life Sensors</td>
			<td>AB-0130-0100</td>
			<td>Only M1 antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">MgCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">442611</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000213</td>
			<td>Various other manufacturers/models</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">myr-AIP</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-P212-0500</td>
			<td>Carried by Millipore-Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">NaCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">S3014</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Odyssey Fc Imaging System</td>
			<td>LiCor</td>
			<td>2800-02</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Phosphatase Inhibitor</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">524625</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Precision Plus Protein Standard</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>161-0373</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Protease Inhibitor</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">P8340</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PSD95 antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>3450T</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:222px;">SDS</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">L3771</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SS255</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:222px;">Sucrose</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">S0389</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">TBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62938</td>
			<td>Varous other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:50px;width:222px;">Tris</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">T1503</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;">Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;">Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-PW8810</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying subcellular ubiquitin-proteasome activity in the rodent brain

Het ubiquitin-proteasome-systeem is een belangrijke regulator van eiwit degradatie en een verscheidenheid aan andere cellulaire processen in eukaryoten. In de hersenen, stijgingen van de activiteit van ubiquitin-proteasome zijn van cruciaal belang voor synaptische plasticiteit en Geheugenvorming en afwijkende veranderingen in dit systeem zijn geassocieerd met een verscheidenheid van neurologische, neurodegeneratieve en psychiatrische stoornissen. Een van de problemen bij het bestuderen van ubiquitin-proteasome functioneren in de hersenen is dat het aanwezig is in alle cellulaire compartimenten, waarin de eiwit doelen, functionele rol en mechanismen van regulering sterk kunnen variëren. Als gevolg daarvan is de mogelijkheid om de hersenen ubiquitine eiwit targeting en proteasoom katalytische activiteit in verschillende subcellulaire compartimenten binnen hetzelfde dier direct te vergelijken, essentieel om volledig te begrijpen hoe de ups bijdraagt aan synaptische plasticiteit, geheugen en ziekte. De hier beschreven methode maakt verzameling van nucleaire, cytoplasmatische en ruwe synaptische fracties van dezelfde knaagdier (rat) hersenen, gevolgd door gelijktijdige kwantificering van proteasoom katalytische activiteit (indirect, het verstrekken van activiteit van de proteasoom kern alleen) en koppelings specifieke ubiquitine-eiwit tagging. Zo, de methode kan worden gebruikt om direct te vergelijken subcellulaire veranderingen in ubiquitin-proteasome activiteit in verschillende hersengebieden in hetzelfde dier tijdens synaptische plasticiteit, Geheugenvorming en verschillende ziektetoestanden. Deze methode kan ook worden gebruikt om de subcellulaire verdeling en functie van andere eiwitten binnen hetzelfde dier te beoordelen.

Met behulp van de hier beschreven procedure, nucleaire, cytoplasmatische en synaptische fracties werden verzameld uit de laterale amygdala van de hersenen van de rat (Figuur 1). De zuiverheid van de afzonderlijke fracties werd bevestigd via Western blotting, het indringende met antilichamen tegen eiwitten die moeten worden verrijkt of uitgeput in het lysaat. In het eerste halfrond waar een ruwe synaptische Fractie werd verzameld, postsynaptisch dichtheid eiwi...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain at JoVE.com

Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain

Dit protocol is ontworpen om de activiteit van ubiquitin-proteasome System (UPS) in verschillende cellulaire compartimenten van de knaagdieren hersenen efficiënt te kwantificeren. Gebruikers zijn in staat om de werking van UPS in nucleaire, cytoplasmatische en synaptische fracties in hetzelfde dier te onderzoeken, waardoor de hoeveelheid tijd en het aantal dieren dat nodig is om deze complexe analyses uit te voeren, wordt verminderd.

Kwantificerende Subcellulaire Ubiquitin-proteasome activiteit in het knaagdier hersenen

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases ...

Dit protocol meet subcellulaire eiwitubiquilining niveaus en proteasoom activiteit in het knaagdier hersenen waardoor binnen onderwerpen vergelijkingen van hoe ubiquitine-proteasoom activiteit verandert in reactie op cellulaire activiteit, leren, of ziekte. Het protocol maakt het verzamelen van synaptische, cytoplasmatische en nucleaire fracties van hetzelfde knaagdierbrein mogelijk. Het minimaliseren van verlies, het kan worden uitgevoerd met kleine weefselhoeveelheden en basislaboratoriumapparatuur.Het aantonen van de procedure zal Taylor McFadden zijn, een afgestudeerde student van mijn laboratorium. Begin deze procedure met het verzamelen en ontwijken van knaagdieren hersenweefsel zoals beschreven in het tekstprotocol. Zorg ervoor dat het halfrond dat wordt gebruikt, tegenwicht is voor de extractieomstandigheden voor elke experimentele groep.Verwijder de 1,5 milliliter centrifuge microbuis met een halfrond van het gebied van belang uit de min 80 graden Celsius vriezer. Met behulp van een scalpel, breng het bevroren hersenweefsel naar een twee milliliter glas Teflon homogenisator. Voeg 500 microliter lysebuffer toe aan de Teflon buis.Met behulp van stamper B, homogeniseren hetzelfde weefsel met 15 slagen totdat er geen zichtbare hoeveelheid vast materiaal aanwezig is. Gebruik een draaiende beweging tijdens elke slag. Breng met een pipet van 1.000 microliter het gehomogeniseerde monster over naar een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifugebuis.Leg de buis op nat ijs en broed gedurende 30 minuten. Plaats de buis in de microcentrifuge en draai gedurende 10 minuten op 845 keer g in vier graden Celsius. Verwijder na voltooiing voorzichtig de supernatant door pipetting en plaats in een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifuge buis.Dit is de cytoplasmische fractie. Voeg 50 microliter extractiebuffer toe aan de resulterende pellet en opnieuw te besteden door pipetting. Niet vortex de pellet.Plaats de buis met de geresuspendeerde pellet op ijs en uitbroed gedurende 30 minuten. Dan centrifugeren de buis gedurende 20 minuten op 21, 456 keer g in vier graden Celsius. Na centrifugatie, verwijder voorzichtig het supernatant door pipetting en plaats in een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifuge buis.Dit is de nucleaire fractie. Homogenize een halfrond van de regio van belang als voorheen, behalve om 500 microliters van TEVP buffer in plaats van lysis buffer te gebruiken. Breng met behulp van een pipet van 1.000 microliter het gehomogeniseerde monster over naar een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifugebuis.Centrifugeren het monster op 1.000 keer g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Verzamel de supernatant en breng het naar een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifuge buis met behulp van een 1.000 microliter pipet. Centrifugeren het monster op 10,000 keer g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.Gooi de originele pellet die kernen en het grote puin bevat. Breng de supernatant over op een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Dit is de cytosolische fractie.Voeg 50 microliter homogenisatiebuffer toe aan de pellet en verzwaarde door pipetting totdat er geen vast materiaal zichtbaar is. Centrifugeren het monster op 20.000 keer g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Breng de supernatant over op een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifugebuis.Dit is de ruwe synaptosomale membraanfractie. Om de test op te zetten, verwarmt u de plaatlezer tot 37 graden Celsius en houdt u de run vast. Stel de excitatie in op 360 nanometer en emissie op 460 nanometer.Als de 96 goed gebruikte plaat duidelijk is, stel de optiekpositie op de bodem. Als een donkere 96 put plaat wordt gebruikt, stel optica positie naar boven. Programmeer een kinetische run met een tijd van twee uur scannen om de 30 minuten.Reconstrueren van de 20S 10X test buffer die in de kit met 13,5 milliliter ultrazuiver water. Voeg 14 microliter van 100 millimolar ATP toe aan de nu 1X buffer. Dit verbetert de proteasoomactiviteit in de monsters aanzienlijk en verbetert de betrouwbaarheid van de test.Reconstrueren van de AMC standaard in de kit met 100 microliter van DMSO. Voer stappen uit met behulp van de AMC-standaard in het donker of bij weinig licht, omdat de standaard lichtgevoelig is. Maak een standaardcurve van AMC van een reeks hoge tot lage AMC-concentraties.Deze curve zal worden gebruikt voor de kalibratie van de plaatlezer en de analyse van proteasoomactiviteit in de gehomogeniseerde monsters. Reconstrueren van de proteasoom subtraat in de kit met 65 microliter van DMSO. Voer deze stap ook uit in het donker of bij weinig licht, omdat het substraat lichtgevoelig is.Maak vervolgens een een tot 20 verdunning van het proteasoom substraat in een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifuge buis met behulp van 20S test buffer. Voeg een genormaliseerde hoeveelheid van de gewenste monsters toe aan een 96 putplaat. Voer elk monster in tweevoud uit.De benodigde hoeveelheid monster varieert op basis van weefselvoorbereiding. Over het algemeen is 10 tot 20 microgram voldoende voor elke subcellulaire fractie. Breng het monster goed volume tot 80 microliter met ultrazuiver water.De toegevoegde hoeveelheid is afhankelijk van de hoeveelheid monster die is toegevoegd. In twee afzonderlijke putten, voeg 80 microliter water alleen. Dit zullen de test blanks zijn.Voeg 10 microliter van 20S test buffer aan elke put met inbegrip van test blanks. Gebruik een repeater of geautomatiseerde pipet om een consistent testvolume in de putten te garanderen. Doe de lichten uit of ga een donkere kamer binnen.Voeg alle 100 microliters van verdunde AMC-normen toe aan een nieuwe put met behulp van een enkele put voor elke standaard. Gebruik in het donker een repeater of geautomatiseerde pipet om 10 microliter verdund proteasoomsubstraat toe te voegen aan putten die monster- en test blanks bevatten, maar niet de AMC-standaard. Plaats de plaat in de plaatlezer en start de kinetische run.Uitvoeren kwantificering van diverse polyubiquitine tags in verschillende subcellulaire fracties verzameld uit knaagdier hersenweefsel met behulp van een verscheidenheid van standaard westerse blotting protocollen in combinatie met unieke koppeling-specifieke polyubiquitine antilichamen. Sommige ubiquitine Westelijke blotbeelden zullen kolommen van verschillende banden verstrekken terwijl anderen uitstrijkje-als patroon met weinig of geen duidelijke lijnen produceert. Voor kwantificering van afgebeelde ubiquitine westerse vlekken, teken een doos rond de kolom die de gehele moleculaire normen ladder uitbreidt.Pas de doos aan als ubiquitine kleuring zich door de hele ladder uitstrekt. Dit is gebruikelijk voor lysine 48 wijzigingen en varieert sterk tussen subcellulaire compartimenten. Ten slotte trek je de achtergrond af die wordt berekend als de gemiddelde optische dichtheid van de achtergrond die direct rond de kolom aan alle kanten is.Hier is de kwantificering van proteasoomactiviteit in verschillende fracties verzameld uit de laterale amygdala van hetzelfde dier. Tijdens de in vitro proteasome activiteit test, relatieve fluorescerende eenheden gedetecteerd toegenomen van het begin tot het einde van de test in de synaptische fractie, de cytoplasmatische fractie, en de nucleaire fractie. De proteasome remmer beta-lac verhinderd RFUs van het veranderen over de sessie.Subcellulaire verschillen werden waargenomen bij proteasoomactiviteit in de laterale amygdala van hetzelfde dier. Bij getrainde dieren werd een toename van de nucleaire proteasoomactiviteit vastgesteld ten opzichte van controles die overeenkwamen met een afname van de activiteit binnen de synaptische fractie. Cytoplasmische proteasoomactiviteit bleef bij de uitgangswaarde.Hier worden subcellulaire verschillen in koppelingsspecifieke eiwitubiquilinting in de laterale amygdala van hetzelfde dier na het leren weergegeven. Er was een toename van de algehele alomtegenwoordigheid in de nucleaire fractie na het leren die correleerde met een afname van de cytoplasmatische fractie. Na het leren nam de lineaire alomtegenwoordigheid toe in de kernfractie, maar niet in cytoplastische of synaptische breuken.Interessant is dat K63-alomtegenwoordigheid steeg in de nucleaire fractie na het leren, wat correleerde met een afname van de synaptische fractie. Overwegende dat K48 uniquitination steeg in de nucleaire en cytoplasmatische fracties na het leren, maar niet in de synaptische fractie. Dit protocol kan ook worden gebruikt om de subcellulaire distributie en functie van andere eiwitten binnen hetzelfde dier te begrijpen.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Neuroscience

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

Gelijktijdig fMRI en elektrofysiologie bij knaagdieren Brain

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Kwantificeren van de activiteit van Cis-Regulatorische elementen in de muis Retina door Explantatie Elektroporatie

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Directe Intraventriculaire levering van drugs aan het knaagdier centrale zenuwstelsel

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo optogenetische Stimulatie van de knaagdieren centrale zenuwstelsel

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase activiteit in de verschillende regio&#39;s van de hersenen van muizen: Non-Radioactive Telomerase Herhaal Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Gelijktijdig Elektrofysiologische opname en Micro-injecties van remmende middelen in de knaagdierhersenen

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

Gepersonaliseerde naalden voor Microinjections in de hersenen knaagdier

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Evaluatie van SYNAPS dichtheid in Hippocampal knaagdier hersenen plakjes

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Opname en moduleren van Epileptiform activiteit in knaagdier hersenen plakjes gekoppeld aan micro-elektrode Arrays

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Gevolgen van Blast-geïnduceerde Neurotrauma voor hydrofoor knaagdier midden cerebrale bloedvaten

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...