Name: quantifying subcellular ubiquitin-proteasome activity in the rodent brain
Uploaded: 2019-05-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage du College of Agricultural and Life Sciences et le College of Science de Virginia Tech. T.M. est soutenu par le programme George Washington Carver de Virginia Tech.

Toutes les procédures, y compris les sujets animaux, ont été approuvées par le Virginia Polytechnic Institute et le State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Collection et dissection du tissu cérébral de rongeur
REMARQUE: Ce protocole peut être appliqué à une variété de régions du cerveau et utilisé avec diverses procédures de collecte de tissus. Voici la procédure utilisée dans notre laboratoire pour la ...

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	<li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+system.">The ubiquitin system.</a> Annu Rev Biochem. 67, 425-479 (1998).</li><li>Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+chain+diversity+at+a+glance.">Ubiquitin chain diversity at a glance.</a> Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).</li><li>Ravid, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+degradation+signals+in+the+ubiquitin-proteasome+system.">Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (9), 679-690 (2008).</li><li>Erpapazoglou, Z., Walker, O., Haguenauer-Tsapis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+roles+of+k63-linked+ubiquitin+chains+in+trafficking.">Versatile roles of k63-linked ubiquitin chains in trafficking.</a> Cells. 3 (4), 1027-1088 (2014).</li><li>Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+ubiquitin+chains:+NF-kappaB+signalling,+cell+death+and+beyond.">Linear ubiquitin chains: NF-kappaB signalling, cell death and beyond.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 15 (8), 503-508 (2014).</li><li>Rieser, E., Cordier, S. M., Walczak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+ubiquitination:+a+newly+discovered+regulator+of+cell+signalling.">Linear ubiquitination: a newly discovered regulator of cell signalling.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (2), 94-102 (2013).</li><li>Collins, G. A., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Logic+of+the+26S+Proteasome.">The Logic of the 26S Proteasome.</a> Cell. 169 (5), 792-806 (2017).</li><li>Bhat, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+19S+proteasome+ATPase+Sug1+plays+a+critical+role+in+regulating+MHC+class+II+transcription.">The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription.</a> Molecular Immunology. 45 (8), 2214-2224 (2008).</li><li>Ezhkova, E., Tansey, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasomal+ATPases+link+ubiquitylation+of+histone+H2B+to+methylation+of+histone+H3.">Proteasomal ATPases link ubiquitylation of histone H2B to methylation of histone H3.</a> Molecular Cell. 13 (3), 435-442 (2004).</li><li>Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+system+as+a+critical+regulator+of+synaptic+plasticity+and+long-term+memory+formation.">The ubiquitin-proteasome system as a critical regulator of synaptic plasticity and long-term memory formation.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 105, 107-116 (2013).</li><li>Hegde, A. N., Upadhya, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+pathway+in+health+and+disease+of+the+nervous+system.">The ubiquitin-proteasome pathway in health and disease of the nervous system.</a> Trends in Neuroscience. 30 (11), 587-595 (2007).</li><li>Adori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+distribution+of+components+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+non-diseased+human+and+rat+brain.">Subcellular distribution of components of the ubiquitin-proteasome system in non-diseased human and rat brain.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54 (2), 263-267 (2006).</li><li>Upadhya, S. C., Ding, L., Smith, T. K., Hegde, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+proteasome+activity+in+the+nucleus+and+the+synaptic+terminals.">Differential regulation of proteasome activity in the nucleus and the synaptic terminals.</a> Neurochemistry International. 48 (4), 296-305 (2006).</li><li>Enenkel, C., Lehmann, A., Kloetzel, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+distribution+of+proteasomes+implicates+a+major+location+of+protein+degradation+in+the+nuclear+envelope-ER+network+in+yeast.">Subcellular distribution of proteasomes implicates a major location of protein degradation in the nuclear envelope-ER network in yeast.</a> EMBO Journal. 17 (21), 6144-6154 (1998).</li><li>Jarome, T. J., Kwapis, J. L., Ruenzel, W. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII,+but+not+protein+kinase+A,+regulates+Rpt6+phosphorylation+and+proteasome+activity+during+the+formation+of+long-term+memories.">CaMKII, but not protein kinase A, regulates Rpt6 phosphorylation and proteasome activity during the formation of long-term memories.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 7, 115 (2013).</li><li>Jarome, T. J., Werner, C. T., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+dependent+protein+degradation+is+critical+for+the+formation+and+stability+of+fear+memory+in+the+amygdala.">Activity dependent protein degradation is critical for the formation and stability of fear memory in the amygdala.</a> PLoS One. 6 (9), e24349 (2011).</li><li>Lopez-Salon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+cascade+is+required+for+mammalian+long-term+memory+formation.">The ubiquitin-proteasome cascade is required for mammalian long-term memory formation.</a> European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1820-1826 (2001).</li><li>Reis, D. S., Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+formation+for+trace+fear+conditioning+requires+ubiquitin-proteasome+mediated+protein+degradation+in+the+prefrontal+cortex.">Memory formation for trace fear conditioning requires ubiquitin-proteasome mediated protein degradation in the prefrontal cortex.</a> Frontiers in Behavior Neuroscience. 7, 150 (2013).</li><li>Rosenberg, T., Elkobi, A., Rosenblum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mAChR-dependent+decrease+in+proteasome+activity+in+the+gustatory+cortex+is+necessary+for+novel+taste+learning.">mAChR-dependent decrease in proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for novel taste learning.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 135, 115-124 (2016).</li><li>Rosenberg, T., Elkobi, A., Dieterich, D. C., Rosenblum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDAR-dependent+proteasome+activity+in+the+gustatory+cortex+is+necessary+for+conditioned+taste+aversion.">NMDAR-dependent proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for conditioned taste aversion.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 130, 7-16 (2016).</li><li>Orsi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+subcellular+changes+in+proteasome+activity+and+linkage-specific+protein+polyubiquitination+in+the+amygdala+during+the+consolidation+and+reconsolidation+of+a+fear+memory.">Distinct subcellular changes in proteasome activity and linkage-specific protein polyubiquitination in the amygdala during the consolidation and reconsolidation of a fear memory.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 157, 1-11 (2019).</li><li>Cullen, P. K., Ferrara, N. C., Pullins, S. E., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context+memory+formation+requires+activity-dependent+protein+degradation+in+the+hippocampus.">Context memory formation requires activity-dependent protein degradation in the hippocampus.</a> Learning and Memory. 24 (11), 589-596 (2017).</li><li>Jarome, T. J., Ferrara, N. C., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII+regulates+proteasome+phosphorylation+and+activity+and+promotes+memory+destabilization+following+retrieval.">CaMKII regulates proteasome phosphorylation and activity and promotes memory destabilization following retrieval.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 128, 103-109 (2016).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+protein+degradation+underlies+destabilization+of+retrieved+fear+memory.">Synaptic protein degradation underlies destabilization of retrieved fear memory.</a> Science. 319 (5867), 1253-1256 (2008).</li><li>Dunah, A. W., Standaert, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D1+receptor-dependent+trafficking+of+striatal+NMDA+glutamate+receptors+to+the+postsynaptic+membrane.">Dopamine D1 receptor-dependent trafficking of striatal NMDA glutamate receptors to the postsynaptic membrane.</a> Journal of Neuroscience. 21 (15), 5546-5558 (2001).</li><li>Kelly, P. T., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+proteins.+Characterization+of+tubulin+and+actin+and+identification+of+a+distinct+postsynaptic+density+polypeptide.">Synaptic proteins. Characterization of tubulin and actin and identification of a distinct postsynaptic density polypeptide.</a> Journal of Cell Biology. 79 (1), 173-183 (1978).</li><li>Mengual, E., Arizti, P., Rodrigo, J., Gimenez-Amaya, J. M., Castano, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+distribution+and+electron+microscopic+subcellular+localization+of+the+proteasome+in+the+rat+CNS.">Immunohistochemical distribution and electron microscopic subcellular localization of the proteasome in the rat CNS.</a> Journal of Neuroscience. 16 (20), 6331-6341 (1996).</li></ol>

Ici, nous démontrons une méthode efficace pour quantifier des changements dans l'activité ubiquitine-protéasome à travers différents compartiments subcellulaires dans le même animal. À l'heure actuelle, la plupart des tentatives de mesure des changements subcellulaires dans l'activité du système ubiquitine-protéasome ont été limitées à un seul compartiment par échantillon, ce qui a entraîné la nécessité de répéter des expériences. Cela entraîne des coûts importants et des pertes de vies animales....

Le système ubiquitine-protéasome (UPS) est un réseau complexe de structures et de ligases de protéines interconnectées qui contrôle la dégradation de la plupart des protéines de courte durée dans les cellules1. Dans ce système, les protéines sont marquées pour la dégradation ou d'autres processus cellulaires / destins par le petit modificateur ubiquitine. Une protéine cible peut acquérir 1-7 modifications d'ubiquitine, qui peuvent relier ensemble à l'un des sept sites de lysine (K) (K6, K11, K27, K29, K33, K48 et K63) ou la méthionine N-terminale (M1; aussi connu sous le nom linéaire) dans l'ubiquitine précédente2. Certaines de ces étiquettes de polyubiquitine sont spécifiques à la dégradation (K48)3, tandis que d'autres sont largement indépendantes du processus de dégradation des protéines (M1)4,5,6. Ainsi, le processus d'ubiquitination des protéines est incroyablement complexe et la capacité de quantifier les changements dans une étiquette spécifique de polyubiquitine est essentielle pour comprendre en fin de compte le rôle de cette modification donnée dans le fonctionnement cellulaire. Compliquant encore l'étude de ce système, le protéasome, qui est la structure catalytique de l'UPS7, les deux dégrade ntlifient les protéines, mais peut également être impliqué dans d'autres processus non protéolytiques8,9. Il n'est donc pas surprenant que, depuis sa découverte initiale, l'activité normale et aberrante ubiquitine-protéasome ait été impliquée dans la formation à long terme de mémoire et une série d'états de la maladie, y compris beaucoup neurologique, neurodégénérative et psychiatrique troubles10,11. En conséquence, les méthodes qui peuvent quantifier efficacement et efficacement l'activité UPS dans le cerveau sont essentielles pour comprendre en fin de compte comment ce système est dysrégulé dans les états de la maladie et le développement éventuel d'options de traitement ciblant l'ubiquitine et / ou protéasome fonctionnement.
Il y a un certain nombre de questions dans la quantification de l'activité ubiquitine-protéasome dans les tissus cérébraux des rats et des souris, qui sont les systèmes modèles les plus communs utilisés pour étudier la fonction d'UPS, y compris 1) la diversité des modifications d'ubiquitin, et 2) la distribution et régulation différentielle du fonctionnement d'UPS entre les compartiments subcellulaires12,13,14. Par exemple, bon nombre des premières démonstrations de la fonction ubiquitine-protéasome dans le cerveau pendant la formation de mémoire ont utilisé des lysates de cellules entières et ont indiqué des augmentations de temps-dépendantes dans l'ubiquitination de protéine et l'activité protéasome15, 16 Annonces , 17 Annonces , 18 ans, états-unis qui , 19 ans, états-unis qui , 20. Cependant, nous avons récemment constaté que l'activité ubiquitine-protéasome variait considérablement d'un compartiment subcellulaire à l'autre en réponse à l'apprentissage, avec des augmentations simultanées dans certaines régions et des diminutions dans d'autres, un modèle qui diffère considérablement de ce qui a été précédemment rapporté dans les lysates de cellule entière21. Ceci est compatible avec la limitation d'une approche cellulaire entière, car elle ne peut dissocier la contribution des changements dans l'activité d'UPS dans différents compartiments subcellulaires. Bien que des études plus récentes ont utilisé des protocoles de fraction synaptique pour étudier l'UPS spécifiquement aux synapses en réponse à l'apprentissage22,23,24, les méthodes utilisées occlude la capacité de mesurer changements ubiquitine-protéasome nucléaires et cytoplasmiques chez le même animal. Il en résulte un besoin inutile de répéter des expériences plusieurs fois, la collecte d'une fraction subcellulaire différente dans chacun. Non seulement cela entraîne une plus grande perte de vies animales, mais il élimine la capacité de comparer directement l'activité UPS à travers différents compartiments subcellulaires en réponse à un événement donné ou au cours d'un état de maladie spécifique. Considérant que les cibles protéiques de l'ubiquitine et du protéasome varient considérablement dans l'ensemble de la cellule, il est essentiel de comprendre comment la signalisation ubiquitine-protéasome diffère dans les compartiments subcellulaires distincts pour identifier le rôle fonctionnel de l'UPS dans le cerveau pendant la formation de mémoire et les désordres neurologiques, neurodégénératifs et psychiatriques.
Pour répondre à ce besoin, nous avons récemment mis au point une procédure dans laquelle des fractions nucléaires, cytoplasmiques et synaptiques pourraient être recueillies pour une région du cerveau donnée à partir du même animal21. En outre, pour tenir compte de la quantité limitée de protéines qui peuvent être obtenues à partir de la collecte de plusieurs fractions subcellulaires à partir d'un même échantillon, nous avons optimisé les protocoles précédemment établis pour analyser l'activité protéasome in vitro et lien spécifique l'ubiquitination de protéine dans les cellules lysed s'est rassemblée du tissu de cerveau de rongeur. En utilisant ce protocole, nous avons pu recueillir et comparer directement les changements dépendants de l'apprentissage dans l'activité protéasome, K48, K63, M1 et les niveaux globaux de polyubiquitination de protéine dans le noyau et le cytoplasme et aux synapses dans l'amygdale latérale des rats. Ici, nous décrivons en détail notre procédure ( Figure1), qui pourrait améliorer considérablement notre compréhension de la façon dont l'UPS est impliqué dans la formation de la mémoire à long terme et divers états de la maladie. Cependant, il convient de noter que l'activité protéasome in vitro discutée dans notre protocole, bien que largement utilisée, ne mesure pas directement l'activité des complexes protéasomes complets de 26S. Au contraire, cet analyse mesure l'activité du noyau 20S, ce qui signifie qu'il ne peut servir de proxy que pour comprendre l'activité du noyau lui-même par opposition à l'ensemble du complexe protéasome 26S.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:878px;" width="878">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">0.5M EDTA</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">15575020</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">20S Proteasome Activity Kit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>APT280</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">ATP</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">FERR1441</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Beta-actin antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>4967S</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Beta-tubulin antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>2128T</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BioTek Synergy H1 plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>VATECHH1MT3</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN19024280</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">clasto lactacystin b-lactone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L7035</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cryogenic cup</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>033377B</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMSO</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Varous other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">DTT</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">D0632</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Glycerol</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">G5516</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">H3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1791</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">HEPES</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">H3375</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SA48</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">IGEPAL (NP-40)</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">I3021</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">K48 Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab140601</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">K63 Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab179434</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">KCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">P9541</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KONTES tissue grinder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885300-0002</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laemmli sample buffer</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Linear Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Life Sensors</td>
			<td>AB-0130-0100</td>
			<td>Only M1 antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">MgCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">442611</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000213</td>
			<td>Various other manufacturers/models</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">myr-AIP</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-P212-0500</td>
			<td>Carried by Millipore-Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">NaCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">S3014</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Odyssey Fc Imaging System</td>
			<td>LiCor</td>
			<td>2800-02</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Phosphatase Inhibitor</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">524625</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Precision Plus Protein Standard</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>161-0373</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Protease Inhibitor</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">P8340</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PSD95 antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>3450T</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:222px;">SDS</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">L3771</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SS255</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:222px;">Sucrose</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">S0389</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">TBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62938</td>
			<td>Varous other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:50px;width:222px;">Tris</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">T1503</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;">Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;">Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-PW8810</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying subcellular ubiquitin-proteasome activity in the rodent brain

Le système ubiquitine-protéasome est un régulateur clé de la dégradation des protéines et d'une variété d'autres processus cellulaires chez les eucaryotes. Dans le cerveau, les augmentations de l'activité ubiquitine-protéasome sont critiques pour la plasticité synaptique et la formation de mémoire et les changements aberrants dans ce système sont associés à une série de troubles neurologiques, neurodégénératifs et psychiatriques. L'un des problèmes dans l'étude du fonctionnement de l'ubiquitine-protéasome dans le cerveau est qu'il est présent dans tous les compartiments cellulaires, dans lesquels les cibles protéiques, le rôle fonctionnel et les mécanismes de régulation peuvent varier considérablement. En conséquence, la capacité de comparer directement le ciblage des protéines d'ubiquitine du cerveau et l'activité catalytique protéasome dans différents compartiments sous-cellulaires au sein d'un même animal est essentielle pour bien comprendre comment l'ONDu contribue à la plasticité synaptique, mémoire et la maladie. La méthode décrite ici permet la collecte de fractions synaptiques nucléaires, cytoplasmiques et brutes du même cerveau de rongeur (rat), suivie d'une quantification simultanée de l'activité catalytique protéasome (indirectement, fournissant l'activité du noyau protéasome seulement) et le marquage des protéines d'ubiquitine spécifique au lien. Ainsi, la méthode peut être utilisée pour comparer directement les changements subcellulaires dans l'activité ubiquitine-protéasome dans différentes régions du cerveau dans le même animal au cours de la plasticité synaptique, la formation de la mémoire et différents états de la maladie. Cette méthode peut également être utilisée pour évaluer la distribution subcellulaire et la fonction d'autres protéines au sein d'un même animal.

En utilisant la procédure décrite ici, des fractions nucléaires, cytoplasmiques et synaptiques ont été recueillies à partir de l'amygdale latérale du cerveau du rat (Figure 1). La pureté des fractions individuelles a été confirmée par le ballonnement occidental, sondant avec des anticorps contre des protéines qui devraient être enrichies ou épuisées dans le lysate. Dans le premier hémisphère où une fraction synaptique brute a été recueilli...

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Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain

Ce protocole est conçu pour quantifier efficacement l'activité du système ubiquitine-protéasome (UPS) dans différents compartiments cellulaires du cerveau des rongeurs. Les utilisateurs sont en mesure d'examiner le fonctionnement de l'UPS en fractions nucléaires, cytoplasmiques et synaptiques chez le même animal, ce qui réduit le temps et le nombre d'animaux nécessaires pour effectuer ces analyses complexes.

Quantification de l'activité subcellulaire ubiquitine-protéasome dans le cerveau des rongeurs

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases ...

Ce protocole mesure les niveaux subcellulaires d’ubiquitination de protéine et l’activité protéasome dans le cerveau de rongeur permettant dans les sujets des comparaisons de la façon dont l’activité ubiquitine-protéasome change en réponse à l’activité cellulaire, l’apprentissage, ou la maladie. Le protocole permet la collecte de fractions synaptiques, cytoplasmiques et nucléaires à partir du même cerveau de rongeurs. Minimisant la perte, il pourrait être effectué avec de petites quantités de tissus et de l’équipement de laboratoire de base.Taylor McFadden, un étudiant diplômé de mon laboratoire, démontrera la procédure. Commencez cette procédure par la collecte et la dissection du tissu cérébral de rongeur tel que décrit dans le protocole de texte. Assurez-vous que l’hémisphère utilisé est contrebalé entre les conditions d’extraction pour chaque groupe expérimental.Retirez le microtube de centrifugeuse de 1,5 millilitre contenant un hémisphère de la région d’intérêt du congélateur de moins 80 degrés Celsius. À l’aide d’un scalpel, transférer le tissu cérébral congelé dans un homogénéiseur en téflon en verre de deux millilitres. Ajouter 500 microlitres de tampon de lyse au tube de téflon.À l’aide du pilon B, homogénéiser le même tissu avec 15 coups jusqu’à ce qu’aucune quantité visible de matière solide ne soit présente. Utilisez un mouvement tournant à chaque course. Avec une pipette de 1000 microlitres, transférez l’échantillon homogénéisé dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.Placer le tube sur de la glace humide et incuber pendant 30 minutes. Placer le tube dans la microcentrifugeuse et faire tourner pendant 10 minutes à 845 fois g en quatre degrés Celsius. Après l’achèvement, retirez soigneusement le supernatant par pipetting et placez-le dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.C’est la fraction cytoplasmique. Ajouter 50 microlitres de tampon d’extraction à la pastille qui en résulte et réutiliser par pipetting. Ne pas vortex la pastille.Placez le tube contenant la pastille résuspendée sur la glace et incubez pendant 30 minutes. Puis centrifuger le tube pendant 20 minutes à 21, 456 fois g en quatre degrés Celsius. Après centrifugation, retirer soigneusement le supernatant par pipetting et placer dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.C’est la fraction nucléaire. Homogénéiser un hémisphère de la région d’intérêt comme avant, sauf pour utiliser 500 microlitres de tampon TEVP au lieu de tampon de lyse. À l’aide d’une pipette de 1000 microlitres, transférez l’échantillon homogénéisé dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.Centrifugez l’échantillon à 1000 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Recueillir le supernatant et le transférer dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre à l’aide d’une pipette de 1000 microlitres. Centrifugez l’échantillon à 10 000 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.Jetez la pastille d’origine qui contient les noyaux et les gros débris. Transférer le supernatant dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. C’est la fraction cytosolique.Ajouter 50 microlitres de tampon d’homogénéisation à la pastille et résuspendre par pipetting jusqu’à ce qu’aucun matériau solide n’est visible. Centrifugez l’échantillon à 20 000 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Transférer le supernatant dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.Il s’agit de la fraction de membrane synptosomale brute. Pour configurer l’essai, préchauffer le lecteur de plaque à 37 degrés Celsius et tenir à travers la course. Réglez l’excitation à 360 nanomètres et émission à 460 nanomètres.Si la plaque de puits 96 utilisée est claire, réglez la position optique vers le bas. Si une plaque de puits sombre de 96 est utilisée, réglez la position optique vers le haut. Programmez une course cinétique avec un temps de numérisation de deux heures toutes les 30 minutes.Reconstituer le tampon d’analyse 20S 10X fourni dans le kit avec 13,5 millilitres d’eau ultrapure. Ajouter 14 microlitres de 100 millimolar ATP au tampon maintenant 1X. Cela améliore considérablement l’activité protéasome dans les échantillons et améliore la fiabilité des analyses.Reconstituer la norme AMC fournie dans le kit avec 100 microlitres de DMSO. Effectuez des étapes en utilisant la norme AMC dans l’obscurité ou dans des conditions de faible lumière car la norme est sensible à la lumière. Créez une courbe standard d’AMC à partir d’une série de concentrations élevées à faibles d’AMC.Cette courbe sera utilisée pour l’étalonnage des lecteurs de plaques et l’analyse de l’activité protéasome dans les échantillons homogénéisés. Reconstituer le sous-titre protéasome fourni dans le kit avec 65 microlitres de DMSO. Effectuez également cette étape dans l’obscurité ou dans des conditions de faible lumière car le substrat est sensible à la lumière.Créez ensuite une dilution d’un à 20 du substrat protéasome dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre à l’aide d’un tampon d’essai 20S. Ajouter une quantité normalisée des échantillons désirés à une plaque de puits de 96. Exécutez chaque échantillon en double.La quantité d’échantillon nécessaire varie en fonction de la préparation des tissus. En général, 10 à 20 microgrammes suffisent à toute fraction subcellulaire. Porter le volume du puits de l’échantillon à 80 microlitres avec de l’eau ultrapure.Le montant ajouté dépend du volume d’échantillon ajouté. Dans deux puits distincts, ajouter 80 microlitres d’eau seuls. Ce seront les blancs d’analyse.Ajouter 10 microlitres de tampon d’analyse 20S à chaque puits, y compris les blancs d’essai. Utilisez un répéteur ou une pipette automatisée pour assurer un volume d’analyse constant dans les puits. Éteignez les lumières ou entrez dans une pièce sombre.Ajoutez les 100 microlitres de normes AMC diluées à un nouveau puits à l’aide d’un seul puits pour chaque norme. Dans l’obscurité, utilisez un répéteur ou une pipette automatisée pour ajouter 10 microlitres de substrat protéasome dilué aux puits contenant des blancs d’échantillon et d’essai, mais pas la norme AMC. Placez la plaque dans le lecteur de plaque et commencez la course cinétique.Effectuer la quantification de diverses étiquettes de polyubiquitine dans différentes fractions subcellulaires prélevées dans le tissu cérébral des rongeurs à l’aide d’une variété de protocoles standard de ballonnement occidental en combinaison avec des anticorps uniques en polyubiquitine spécifiques au lien. Certaines images de tache occidentale d’ubiquitine fourniront des colonnes de bandes distinctes tandis que d’autres produisent le modèle de frottis-comme avec peu ou pas de lignes claires. Pour quantifier les taches occidentales d’ubiquitine image, dessinez une boîte autour de la colonne qui prolonge toute l’échelle des normes moléculaires.Ajustez la boîte si la coloration d’ubiquitine s’étend à travers toute l’échelle. Ceci est commun pour la lysine 48 modifications et varie considérablement d’un compartiment subcellulaire à l’autre. Enfin, soustrayez l’arrière-plan qui est calculé comme la densité optique moyenne de l’arrière-plan entourant immédiatement la colonne de tous les côtés.On voit ici la quantification de l’activité protéasome en différentes fractions prélevées sur l’amygdale latérale du même animal. Pendant l’essai in vitro d’activité de protéasome, les unités fluorescentes relatives détectées ont augmenté du début à la fin de l’essai dans la fraction synaptique, la fraction cytoplasmique, et la fraction nucléaire. Le bêta-lac inhibiteur du protéasome a empêché les RFUs de changer tout au long de la session.Des différences subcellulaires ont été observées dans l’activité protéasome dans l’amygdale latérale du même animal. Une augmentation de l’activité de protéasome nucléaire a été détectée chez les animaux formés par rapport aux contrôles qui correspondaient à une diminution de l’activité dans la fraction synaptique. L’activité protéasome cytoplasmique est restée à la ligne de base.On y voit des différences subcellulaires dans l’ubiquitination protéique spécifique au lien dans l’amygdale latérale du même animal après l’apprentissage. Il y avait une augmentation de l’ubiquitination globale dans la fraction nucléaire suivant l’apprentissage qui s’est corrélée avec une diminution de la fraction cytoplasmique. Après l’apprentissage, l’ubiquitination linéaire a augmenté dans la fraction nucléaire mais pas les fractions cytoplasmiques ou synaptiques.Fait intéressant, l’ubiquitination K63 a augmenté dans la fraction nucléaire après l’apprentissage qui s’est corrélé avec une diminution de la fraction synaptique. Alors que l’uniquitination K48 a augmenté dans les fractions nucléaires et cytoplasmiques après l’apprentissage, mais pas dans la fraction synaptique. Ce protocole peut également être utilisé pour comprendre la distribution subcellulaire et la fonction d’autres protéines chez le même animal.

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