Name: quantifying subcellular ubiquitin-proteasome activity in the rodent brain
Uploaded: 2019-05-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch Start-up-Fonds des College of Agricultural and Life Sciences und des College of Science an der Virginia Tech unterstützt. T.M. wird vom George Washington Carver Program an der Virginia Tech unterstützt.

Alle Verfahren einschließlich tierischer Fächer wurden vom Virginia Polytechnic Institute und dem State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt.
1. Sammlung und Zerlegung von Nagetier-Gehirngewebe
HINWEIS: Dieses Protokoll kann auf eine Vielzahl von Gehirnregionen angewendet und mit verschiedenen Gewebeentnahmeverfahren verwendet werden. Unten ist das Verfahren in unserem Labor für subzelluläre von Ratte Hirngewebe...

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	<li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+system.">The ubiquitin system.</a> Annu Rev Biochem. 67, 425-479 (1998).</li><li>Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+chain+diversity+at+a+glance.">Ubiquitin chain diversity at a glance.</a> Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).</li><li>Ravid, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+degradation+signals+in+the+ubiquitin-proteasome+system.">Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (9), 679-690 (2008).</li><li>Erpapazoglou, Z., Walker, O., Haguenauer-Tsapis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+roles+of+k63-linked+ubiquitin+chains+in+trafficking.">Versatile roles of k63-linked ubiquitin chains in trafficking.</a> Cells. 3 (4), 1027-1088 (2014).</li><li>Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+ubiquitin+chains:+NF-kappaB+signalling,+cell+death+and+beyond.">Linear ubiquitin chains: NF-kappaB signalling, cell death and beyond.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 15 (8), 503-508 (2014).</li><li>Rieser, E., Cordier, S. M., Walczak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+ubiquitination:+a+newly+discovered+regulator+of+cell+signalling.">Linear ubiquitination: a newly discovered regulator of cell signalling.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (2), 94-102 (2013).</li><li>Collins, G. A., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Logic+of+the+26S+Proteasome.">The Logic of the 26S Proteasome.</a> Cell. 169 (5), 792-806 (2017).</li><li>Bhat, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+19S+proteasome+ATPase+Sug1+plays+a+critical+role+in+regulating+MHC+class+II+transcription.">The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription.</a> Molecular Immunology. 45 (8), 2214-2224 (2008).</li><li>Ezhkova, E., Tansey, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasomal+ATPases+link+ubiquitylation+of+histone+H2B+to+methylation+of+histone+H3.">Proteasomal ATPases link ubiquitylation of histone H2B to methylation of histone H3.</a> Molecular Cell. 13 (3), 435-442 (2004).</li><li>Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+system+as+a+critical+regulator+of+synaptic+plasticity+and+long-term+memory+formation.">The ubiquitin-proteasome system as a critical regulator of synaptic plasticity and long-term memory formation.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 105, 107-116 (2013).</li><li>Hegde, A. N., Upadhya, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+pathway+in+health+and+disease+of+the+nervous+system.">The ubiquitin-proteasome pathway in health and disease of the nervous system.</a> Trends in Neuroscience. 30 (11), 587-595 (2007).</li><li>Adori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+distribution+of+components+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+non-diseased+human+and+rat+brain.">Subcellular distribution of components of the ubiquitin-proteasome system in non-diseased human and rat brain.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54 (2), 263-267 (2006).</li><li>Upadhya, S. C., Ding, L., Smith, T. K., Hegde, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+proteasome+activity+in+the+nucleus+and+the+synaptic+terminals.">Differential regulation of proteasome activity in the nucleus and the synaptic terminals.</a> Neurochemistry International. 48 (4), 296-305 (2006).</li><li>Enenkel, C., Lehmann, A., Kloetzel, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+distribution+of+proteasomes+implicates+a+major+location+of+protein+degradation+in+the+nuclear+envelope-ER+network+in+yeast.">Subcellular distribution of proteasomes implicates a major location of protein degradation in the nuclear envelope-ER network in yeast.</a> EMBO Journal. 17 (21), 6144-6154 (1998).</li><li>Jarome, T. J., Kwapis, J. L., Ruenzel, W. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII,+but+not+protein+kinase+A,+regulates+Rpt6+phosphorylation+and+proteasome+activity+during+the+formation+of+long-term+memories.">CaMKII, but not protein kinase A, regulates Rpt6 phosphorylation and proteasome activity during the formation of long-term memories.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 7, 115 (2013).</li><li>Jarome, T. J., Werner, C. T., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+dependent+protein+degradation+is+critical+for+the+formation+and+stability+of+fear+memory+in+the+amygdala.">Activity dependent protein degradation is critical for the formation and stability of fear memory in the amygdala.</a> PLoS One. 6 (9), e24349 (2011).</li><li>Lopez-Salon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+cascade+is+required+for+mammalian+long-term+memory+formation.">The ubiquitin-proteasome cascade is required for mammalian long-term memory formation.</a> European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1820-1826 (2001).</li><li>Reis, D. S., Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+formation+for+trace+fear+conditioning+requires+ubiquitin-proteasome+mediated+protein+degradation+in+the+prefrontal+cortex.">Memory formation for trace fear conditioning requires ubiquitin-proteasome mediated protein degradation in the prefrontal cortex.</a> Frontiers in Behavior Neuroscience. 7, 150 (2013).</li><li>Rosenberg, T., Elkobi, A., Rosenblum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mAChR-dependent+decrease+in+proteasome+activity+in+the+gustatory+cortex+is+necessary+for+novel+taste+learning.">mAChR-dependent decrease in proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for novel taste learning.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 135, 115-124 (2016).</li><li>Rosenberg, T., Elkobi, A., Dieterich, D. C., Rosenblum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDAR-dependent+proteasome+activity+in+the+gustatory+cortex+is+necessary+for+conditioned+taste+aversion.">NMDAR-dependent proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for conditioned taste aversion.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 130, 7-16 (2016).</li><li>Orsi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+subcellular+changes+in+proteasome+activity+and+linkage-specific+protein+polyubiquitination+in+the+amygdala+during+the+consolidation+and+reconsolidation+of+a+fear+memory.">Distinct subcellular changes in proteasome activity and linkage-specific protein polyubiquitination in the amygdala during the consolidation and reconsolidation of a fear memory.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 157, 1-11 (2019).</li><li>Cullen, P. K., Ferrara, N. C., Pullins, S. E., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context+memory+formation+requires+activity-dependent+protein+degradation+in+the+hippocampus.">Context memory formation requires activity-dependent protein degradation in the hippocampus.</a> Learning and Memory. 24 (11), 589-596 (2017).</li><li>Jarome, T. J., Ferrara, N. C., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII+regulates+proteasome+phosphorylation+and+activity+and+promotes+memory+destabilization+following+retrieval.">CaMKII regulates proteasome phosphorylation and activity and promotes memory destabilization following retrieval.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 128, 103-109 (2016).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+protein+degradation+underlies+destabilization+of+retrieved+fear+memory.">Synaptic protein degradation underlies destabilization of retrieved fear memory.</a> Science. 319 (5867), 1253-1256 (2008).</li><li>Dunah, A. W., Standaert, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D1+receptor-dependent+trafficking+of+striatal+NMDA+glutamate+receptors+to+the+postsynaptic+membrane.">Dopamine D1 receptor-dependent trafficking of striatal NMDA glutamate receptors to the postsynaptic membrane.</a> Journal of Neuroscience. 21 (15), 5546-5558 (2001).</li><li>Kelly, P. T., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+proteins.+Characterization+of+tubulin+and+actin+and+identification+of+a+distinct+postsynaptic+density+polypeptide.">Synaptic proteins. Characterization of tubulin and actin and identification of a distinct postsynaptic density polypeptide.</a> Journal of Cell Biology. 79 (1), 173-183 (1978).</li><li>Mengual, E., Arizti, P., Rodrigo, J., Gimenez-Amaya, J. M., Castano, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+distribution+and+electron+microscopic+subcellular+localization+of+the+proteasome+in+the+rat+CNS.">Immunohistochemical distribution and electron microscopic subcellular localization of the proteasome in the rat CNS.</a> Journal of Neuroscience. 16 (20), 6331-6341 (1996).</li></ol>

Hier zeigen wir eine effiziente Methode zur Quantifizierung von Veränderungen der Ubiquitin-Proteasom-Aktivität in verschiedenen subzellulären Kompartimenten im selben Tier. Derzeit sind die meisten Versuche zur Messung subzellulärer Aktivitätsänderungen des Ubiquitin-Proteasom-Systems auf ein einziges Fach pro Probe beschränkt, was dazu führt, dass Experimente wiederholt werden müssen. Dies führt zu erheblichen Kosten und Verlusten an Tierleben. Unser Protokoll lindert dieses Problem, indem es Hemisphären spa...

Das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) ist ein komplexes Netzwerk miteinander verbundener Proteinstrukturen und Ligasen, das den Abbau der meisten kurzlebigen Proteine in Zellen1steuert. In diesem System werden Proteine durch den kleinen Modifikator Ubiquitin für Abbau oder andere zelluläre Prozesse/Fates markiert. Ein Zielprotein kann 1-7 Ubiquitin-Modifikationen erwerben, die an einem von sieben Lysin(K)-Standorten (K6, K11, K27, K29, K33, K48 und K63) oder dem N-Terminal Methionin (M1; bekannt als linear) im vorherigen Ubiquitin2miteinander verknüpft werden können. Einige dieser Polyubiquitin-Tags sind abbauspezifisch (K48)3, während andere weitgehend unabhängig vom Proteinabbauprozess (M1)4,5,6sind. Daher ist der Protein-Ubiquitinationsprozess unglaublich komplex und die Fähigkeit, Veränderungen in einem bestimmten Polyubiquitin-Tag zu quantifizieren, ist entscheidend für das letztendliche Verständnis der Rolle dieser gegebenen Veränderung in der zellulären Funktion. Erschwerend kommt hinzu, dass die Untersuchung dieses Systems, das Proteasom,die katalytische Struktur der USV 7, sowohl Proteine abbaut, als auch aber auch an anderen nicht-proteolytischen Prozessen beteiligt sein kann8,9. Es überrascht nicht, dass seit seiner ersten Entdeckung eine normale und abnorme ubiquitin-proteasomische Aktivität in die Langzeitgedächtnisbildung und eine Vielzahl von Krankheitszuständen verwickelt ist, darunter viele neurologische, neurodegenerative und psychiatrische Störungen10,11. Infolgedessen sind Methoden, die die USS-Aktivität im Gehirn effektiv und effizient quantifizieren können, entscheidend für das letztendliche Verständnis, wie dieses System in Krankheitszuständen dysreguliert ist, und die letztendliche Entwicklung von Behandlungsmöglichkeiten, die auf Ubiquitin und/oder proteasom funktionadieren.
Es gibt eine Reihe von Problemen bei der Quantifizierung der Ubiquitin-Proteasom-Aktivität im Hirngewebe von Ratten und Mäusen, die die häufigsten Modellsysteme sind, die verwendet werden, um die UPS-Funktion zu untersuchen, einschließlich 1) die Vielfalt der Ubiquitin-Modifikationen und 2) Die Verteilung und Differenzregelung der USUs-Funktion über subzelluläre Kompartimente12,13,14. Zum Beispiel verwendeten viele der frühen Demonstrationen der Ubiquitin-Proteasom-Funktion im Gehirn während der Gedächtnisbildung ganze Zelllysate und deuteten auf eine zeitabhängige Zunahme sowohl der Protein-Ubiquitination als auch der Proteasomenaktivität15, 16 , 17 , 18 , 19 , 20. Vor kurzem stellten wir jedoch fest, dass die Ubiquitin-Proteasomen-Aktivität in den subzellulären Fächern als Reaktion auf das Lernen sehr unterschiedlich war, wobei in einigen Regionen gleichzeitig zunimmt und in anderen ein Muster abnimmt, das sich erheblich unterscheidet. von dem, was zuvor in ganzen Zelllysaten berichtet wurde21. Dies steht im Einklang mit der Einschränkung eines gesamten Zellansatzes, da er den Beitrag von Änderungen der USB-Aktivität über verschiedene subzelluläre Kompartimente hinweg nicht trennen kann. Obwohl neuere Studien synaptische Bruchprotokolle verwendet haben, um die USV speziell an Synapsen als Reaktion auf das Lernen22,23,24zu studieren, schließen die angewandten Methoden die Fähigkeit zur Messung kerntechnische und zytoplasmatische Ubiquitin-Proteasom-Veränderungen im selben Tier. Dies führt zu einer unnötigen Notwendigkeit, Experimente mehrmals zu wiederholen, wobei jeweils eine andere subzelluläre Fraktion gesammelt wird. Dies führt nicht nur zu einem größeren Verlust von Tierleben, sondern eliminiert auch die Möglichkeit, DIE USV-Aktivität in verschiedenen subzellulären Abteilungen als Reaktion auf ein bestimmtes Ereignis oder während eines bestimmten Krankheitszustands direkt zu vergleichen. Wenn man bedenkt, dass die Proteinziele von Ubiquitin und dem Proteasom in der Zelle sehr unterschiedlich sind, ist es entscheidend zu verstehen, wie sich die Ubiquitin-Proteasome-Signalisierung in verschiedenen subzellulären Kompartimenten unterscheidet, um die funktionelle Rolle der USB in der Gedächtnisbildung und neurologische, neurodegenerative und psychiatrische Störungen.
Um diesem Bedarf gerecht zu werden, haben wir vor kurzem ein Verfahren entwickelt, bei dem kerntechnische, zytoplasmatische und synaptische Fraktionen für eine bestimmte Hirnregion desselben Tieres gesammelt werden könnten21. Um die begrenzte Menge an Protein zu berücksichtigen, die aus der Entnahme mehrerer subzellulärer Fraktionen aus derselben Probe gewonnen werden kann, haben wir zuvor etablierte Protokolle optimiert, um die In-vitro-Proteasomaktivität und die linkage-spezifische Protein-Ubiquitination in lysierten Zellen aus Nagetier-Gehirngewebe gesammelt. Mit diesem Protokoll konnten wir lernabhängige Veränderungen der Proteasomaktivität K48, K63, M1 und der gesamten Proteinpolyubiquitination im Kern und Zytoplasma sowie an Synapsen in der lateralen Amygdala von Ratten sammeln und direkt vergleichen. Hier beschreiben wir detailliert unser Verfahren (Abbildung 1), das unser Verständnis davon, wie die USV an der Langzeitgedächtnisbildung und verschiedenen Krankheitszuständen beteiligt ist, erheblich verbessern könnte. Es sollte jedoch darauf hingewiesen werden, dass die in unserem Protokoll diskutierte In-vitro-Proteasomaktivität zwar weit verbreitet ist, aber die Aktivität vollständiger 26S-Proteasomkomplexe nicht direkt misst. Vielmehr misst dieser Assay die Aktivität des 20S-Kerns, d. h. er kann nur als Proxy dienen, um die Aktivität des Kerns selbst im Gegensatz zum gesamten 26S-Proteasom-Komplex zu verstehen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:878px;" width="878">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">0.5M EDTA</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">15575020</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">20S Proteasome Activity Kit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>APT280</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">ATP</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">FERR1441</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Beta-actin antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>4967S</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Beta-tubulin antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>2128T</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BioTek Synergy H1 plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>VATECHH1MT3</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN19024280</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">clasto lactacystin b-lactone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L7035</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cryogenic cup</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>033377B</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMSO</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Varous other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">DTT</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">D0632</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Glycerol</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">G5516</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">H3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1791</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">HEPES</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">H3375</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SA48</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">IGEPAL (NP-40)</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">I3021</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">K48 Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab140601</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">K63 Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab179434</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">KCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">P9541</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KONTES tissue grinder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885300-0002</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laemmli sample buffer</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Linear Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Life Sensors</td>
			<td>AB-0130-0100</td>
			<td>Only M1 antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">MgCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">442611</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000213</td>
			<td>Various other manufacturers/models</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">myr-AIP</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-P212-0500</td>
			<td>Carried by Millipore-Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">NaCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">S3014</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Odyssey Fc Imaging System</td>
			<td>LiCor</td>
			<td>2800-02</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Phosphatase Inhibitor</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">524625</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Precision Plus Protein Standard</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>161-0373</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Protease Inhibitor</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">P8340</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PSD95 antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>3450T</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:222px;">SDS</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">L3771</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SS255</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:222px;">Sucrose</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">S0389</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">TBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62938</td>
			<td>Varous other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:50px;width:222px;">Tris</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">T1503</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;">Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;">Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-PW8810</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying subcellular ubiquitin-proteasome activity in the rodent brain

Das Ubiquitin-Proteasom-System ist ein wichtiger Regulator des Proteinabbaus und einer Vielzahl anderer zellulärer Prozesse in Eukaryoten. Im Gehirn, Erhöhung enrubisiert-proteasom Aktivität sind entscheidend für synaptische Plastizität und Gedächtnisbildung und aberrante Veränderungen in diesem System sind mit einer Vielzahl von neurologischen, neurodegenerativen und psychiatrischen Störungen verbunden. Eines der Probleme bei der Untersuchung der Ubiquitin-Proteasom-Funktion im Gehirn ist, dass es in allen zellulären Kompartimenten vorhanden ist, in denen die Proteinziele, die funktionelle Rolle und die Regulationsmechanismen sehr unterschiedlich sein können. Infolgedessen ist die Fähigkeit, das Gehirn-Ubiquitin-Protein-Targeting und die katalytische Aktivität des Proteasomen in verschiedenen subzellulären Kompartimenten innerhalb desselben Tieres direkt zu vergleichen, entscheidend für das vollständige Verständnis, wie die USV zur synaptischen Plastizität beiträgt. Gedächtnis und Krankheit. Die hier beschriebene Methode ermöglicht die Entnahme von kerntechnischen, zytoplasmatischen und rohen synaptischen Fraktionen aus demselben Nagetier (Ratten)-Gehirn, gefolgt von einer gleichzeitigen Quantifizierung der proteasomkatalytischen Aktivität (indirekt, die Aktivität des Proteasomkerns bereitstellt). ) und linkage-spezifische Ubiquitin-Protein-Tagging. So kann die Methode verwendet werden, um subzelluläre Veränderungen in der Ubiquitin-Proteasom-Aktivität in verschiedenen Hirnregionen im selben Tier während der synaptischen Plastizität, Gedächtnisbildung und verschiedenen Krankheitszuständen direkt zu vergleichen. Diese Methode kann auch verwendet werden, um die subzelluläre Verteilung und Funktion anderer Proteine innerhalb desselben Tieres zu bewerten.

Mit dem hier beschriebenen Verfahren wurden kernnukleare, zytoplasmatische und synaptische Fraktionen aus der lateralen Amygdala des Rattenhirns (Abbildung1) entnommen. Die Reinheit der einzelnen Fraktionen wurde durch Western Blotting bestätigt, wobei Antikörper gegen Proteine untersucht wurden, die im Lysat angereichert oder erschöpft werden sollten. In der ersten Hemisphäre, auf der eine grobe synaptische Fraktion gesammelt wurde, war das postsynaptisc...

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Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Aktivität des Ubiquitin-Proteasom-Systems (UPS) in verschiedenen zellulären Kompartimenten des Nagetierhirns effizient zu quantifizieren. Anwender sind in der Lage, die USB-Funktion in nuklearen, zytoplasmatischen und synaptischen Fraktionen bei demselben Tier zu untersuchen, wodurch die Zeit und Anzahl der Tiere, die für die Durchführung dieser komplexen Analysen benötigt werden, reduziert wird.

Quantifizierung subzellulärer Ubiquitin-Proteasom-Aktivität im Nagetierhirn

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases ...

Dieses Protokoll misst subzelluläre Protein-Ubiquitinationsspiegel und Proteasome-Aktivität im Nagetier-Gehirn ermöglicht innerhalb der Probanden Vergleiche darüber, wie sich die ubiquitin-proteasome Aktivität als Reaktion auf zelluläre Aktivität, Lernen oder Krankheit ändert. Das Protokoll ermöglicht die Sammlung von synaptischen, zytoplasmatischen und nuklearen Fraktionen aus demselben Nagetiergehirn. Minimierung des Verlustes, es könnte mit kleinen Gewebemengen und grundlegende Laborausrüstung durchgeführt werden.Demonstriert wird das Verfahren von Taylor McFadden, einem Doktoranden aus meinem Labor. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Sammlung und Zerlegung von Nagetier-Hirngewebe, wie im Textprotokoll beschrieben. Stellen Sie sicher, dass die verwendete Hemisphäre für jede Versuchsgruppe über die Extraktionsbedingungen hinweg gegenausgeglichen ist.Entfernen Sie das 1,5 Milliliter Zentrifugen-Mikrorohr, das eine Hemisphäre der Interessenregion enthält, aus dem Gefrierschrank von minus 80 Grad Celsius. Mit einem Skalpell das gefrorene Hirngewebe auf einen Zwei-Milliliter-Glas-Teflon-Homogenisator übertragen. Fügen Sie dem Teflonrohr 500 Mikroliter Lysepuffer hinzu.Mit dem Stößel B homogenisieren Sie das gleiche Gewebe mit 15 Strichen, bis keine sichtbare Menge an festem Material vorhanden ist. Verwenden Sie bei jedem Hub eine Drehbewegung. Mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette die homogenisierte Probe in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr übertragen.Legen Sie die Röhre auf nasses Eis und inkubieren Sie für 30 Minuten. Die Röhre in die Mikrozentrifuge geben und 10 Minuten bei 845 mal g bei vier Grad Celsius drehen. Nach Derfertigstellung den Überstand vorsichtig durch Pipettieren entfernen und in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr geben.Dies ist die zytoplasmatische Fraktion. Fügen Sie dem resultierenden Pellet 50 Mikroliter Extraktionspuffer hinzu und setzen Sie es durch Pipettieren wieder auf. Wirbeln Sie das Pellet nicht.Das Rohr mit dem resuspendierten Pellet auf Eis legen und 30 Minuten inkubieren. Dann zentrifugieren Sie das Rohr für 20 Minuten bei 21, 456 mal g in vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation den Überstand vorsichtig durch Pipettieren entfernen und in ein neues 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr geben.Das ist die kerntechnische Fraktion. Homogenisieren Sie eine Hemisphäre der Region von Interesse wie zuvor, außer 500 Mikroliter TEVP-Puffer anstelle von Lysepuffer zu verwenden. Mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette die homogenisierte Probe in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr übertragen.Zentrifuge die Probe bei 1 000 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrieren. Sammeln Sie den Überstand und übertragen Sie ihn mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr. Zentrifugieren Sie die Probe bei 10.000 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.Entsorgen Sie das ursprüngliche Pellet, das Kerne und die großen Trümmer enthält. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr. Dies ist die zytosolische Fraktion.Fügen Sie dem Pellet 50 Mikroliter Homogenisierungspuffer hinzu und setzen Sie es durch Pipettieren wieder auf, bis kein festes Material sichtbar ist. Zentrifugieren Sie die Probe bei 20.000 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr.Dies ist die grobe synaptosomale Membranfraktion. Um den Test einzurichten, den Plattenleser auf 37 Grad Celsius vorwärmen und durch den Lauf halten. Stellen Sie die Anregung auf 360 Nanometer und die Emission auf 460 Nanometer ein.Wenn die verwendete 96-Wellplatte klar ist, stellen Sie die Optikposition auf unten ein. Wenn eine dunkle 96-Well-Platte verwendet wird, stellen Sie die Optikposition nach oben ein. Programmieren Sie einen kinetischen Lauf mit einer Zeit von zwei Stunden, die alle 30 Minuten gescannt werden.Rekonstituieren Sie den im Kit enthaltenen 20S 10X-Assaypuffer mit 13,5 Milliliter Reinstwasser. Fügen Sie 14 Mikroliter 100 Millimolar ATP in den jetzt 1X Puffer. Dies verbessert die Proteasomaktivität in den Proben erheblich und verbessert die Zuverlässigkeit des Assays.Rekonstituieren Sie den im Kit enthaltenen AMC-Standard mit 100 Mikroliter DMSO. Führen Sie Schritte mit dem AMC-Standard bei Dunkelheit oder bei schlechten Lichtverhältnissen durch, da der Standard lichtempfindlich ist. Erstellen Sie eine Standardkurve von AMC aus einer Reihe von hohen bis niedrigen AMC-Konzentrationen.Diese Kurve wird für die Kalibrierung des Plattenlesers und die Analyse der Proteasomenaktivität in den homogenisierten Proben verwendet. Rekonstituieren Sie das im Kit enthaltene Proteasomensubtrat mit 65 Mikroliter DMSO. Führen Sie diesen Schritt auch bei Dunkelheit oder bei schlechten Lichtverhältnissen durch, da das Substrat lichtempfindlich ist.Dann erstellen Sie eine einbis 20 Verdünnung des Proteasomensubstrats in einem neuen 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr mit 20S Assaypuffer. Fügen Sie eine normalisierte Menge der gewünschten Proben zu einer 96-Well-Platte hinzu. Führen Sie jedes Beispiel in doppelter Ausführung aus.Die benötigte Probenmenge variiert je nach Gewebevorbereitung. Im Allgemeinen reichen 10 bis 20 Mikrogramm für jede subzelluläre Fraktion. Bringen Sie die Probe gut Volumen auf 80 Mikroliter mit reinem Wasser.Der hinzugefügte Betrag hängt vom Volumen der hinzugefügten Probe ab. In zwei separaten Brunnen, fügen Sie 80 Mikroliter Wasser allein. Dies werden die Test-Rohlinge sein.Fügen Sie 10 Mikroliter 20S Assay-Puffer zu jedem Brunnen einschließlich Assay-Rohlinge hinzu. Verwenden Sie einen Repeater oder eine automatisierte Pipette, um ein konsistentes Assayvolumen in den Brunnen zu gewährleisten. Schalten Sie die Lichter aus oder betreten Sie einen dunklen Raum.Fügen Sie alle 100 Mikroliter verdünnter AMC-Standards zu einem neuen Brunnen hinzu, indem Sie für jeden Standard einen einzigen Brunnen verwenden. Verwenden Sie im Dunkeln einen Repeater oder eine automatisierte Pipette, um 10 Mikroliter verdünntes Proteasossubstrat in Brunnen mit Proben- und Assayrohlingen, aber nicht in den AMC-Standard hinzuzufügen. Legen Sie die Platte in den Plattenleser und starten Sie den kinetischen Lauf.Quantifizierung verschiedener Polyubiquitin-Tags in verschiedenen subzellulären Fraktionen, die aus Nagetier-Gehirngewebe gesammelt wurden, mit einer Vielzahl von Standard-Western-Blotting-Protokollen in Kombination mit einzigartigen linkage-spezifischen Polyubiquitin-Antikörpern. Einige ubiquitin Western Blot Bilder werden Spalten von unterschiedlichen Bändern bieten, während andere schmierartige Muster mit wenigen oder gar keinen klaren Linien erzeugen. Zur Quantifizierung der abgebildeten Ubiquitin Western Blots, zeichnen Sie eine Box um die Säule, die die gesamte molekulare Standards Leiter erweitert.Passen Sie die Box an, wenn sich die Ubiquitinfärbung über die gesamte Leiter erstreckt. Dies ist üblich für Lysin 48 Modifikationen und variiert stark in subzellulären Fächern. Schließlich subtrahieren Sie den Hintergrund, der als mittlere optische Dichte des Hintergrunds berechnet wird, der die Spalte auf allen Seiten unmittelbar umgibt.Hier ist die Quantifizierung der Proteasomaktivität in verschiedenen Fraktionen zu sehen, die aus der lateralen Amygdala desselben Tieres gesammelt wurden. Während des In-vitro-Proteasomen-Aktivitätstests stiegen die vom Anfang bis zum Ende des Tests nachgewiesenen relativen fluoreszierenden Einheiten in der synaptischen Fraktion, der zytoplasmatischen Fraktion und der Kernfraktion. Der Proteasomen-Inhibitor Beta-Lac verhinderte, dass sich die RFUs während der Sitzung änderten.Subzelluläre Unterschiede wurden bei der Proteasomaktivität in der lateralen Amygdala desselben Tieres beobachtet. Bei ausgebildeten Tieren wurde eine Zunahme der nuklearen Proteasomaktivität im Vergleich zu Kontrollen festgestellt, die einer Abnahme der Aktivität innerhalb der synaptischen Fraktion entsprachen. Die zytoplasmatische Proteasomaktivität blieb an der Ausgangsbasis.Hier sind subzelluläre Unterschiede in der linkagespezifischen Protein-Ubiquitination in der lateralen Amygdala desselben Tieres nach dem Lernen zu sehen. Nach dem Lernen, der mit einer Abnahme der zytoplasmatischen Fraktion korrelierte, stieg die Gesamtubiquitination in der Kernfraktion. Nach dem Lernen nahm die lineare Ubiquitination in der Kernfraktion zu, nicht aber in zytoplasmatischen oder synaptischen Fraktionen.Interessanterweise nahm die K63-Ubiquitination in der Kernfraktion nach dem Lernen zu, das mit einer Abnahme der synaptischen Fraktion korrelierte. Während Die K48-Uniquitination in den kerntechnischen und zytoplasmatischen Fraktionen nach dem Lernen, aber nicht in der synaptischen Fraktion zunahm. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um die subzelluläre Verteilung und Funktion anderer Proteine innerhalb desselben Tieres zu verstehen.

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Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

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To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

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Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

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Die Quantifizierung der Aktivität von Cis-Regulatorische Elemente in der Maus Retina durch Explantation Elektroporation

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Direkt Intraventrikuläre Abgabe von Arzneimitteln an die Nager Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

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In vivo optogenetische Stimulation des Nager Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

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Telomerase-Aktivität in den verschiedenen Regionen der Maus Gehirn: Nicht-radioaktive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP)-Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Gleichzeitige Elektrophysiologische Aufzeichnung und Micro-Injektionen von Hemmstoffe im Gehirn von Nagetieren

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

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Bewertung der Synapse Dichte im Hippokampus Nagetier Gehirnscheiben

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Aufnahme und Modulation der Epileptiformen Aktivität in Nagetier Gehirnscheiben gekoppelt mit Mikroelektrode Arrays

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Auswirkungen der Explosion-induzierte Neurotrauma auf Druck Nagetier mittlerer Hirnarterien

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...