Name: quantifying subcellular ubiquitin-proteasome activity in the rodent brain
Uploaded: 2019-05-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain at JoVE.com

이 작품은 농업 및 생명 과학 대학의 시작 기금에 의해 지원되었다 버지니아 공대에서 과학 대학. T.M.는 버지니아 공대의 조지 워싱턴 카버 프로그램에 의해 지원됩니다.

동물 과목을 포함한 모든 절차는 버지니아 폴리 테크닉 대학과 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 설치류 뇌 조직의 수집 및 해부
참고: 이 프로토콜은 다양한 뇌 영역에 적용될 수 있으며 다양한 조직 수집 절차와 함께 사용될 수 있습니다. 아래는 쥐 뇌 조직의 아세포에 대 한 우리의 실험실에서 사용 하...

<ol>
	<li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+system.">The ubiquitin system.</a> Annu Rev Biochem. 67, 425-479 (1998).</li><li>Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+chain+diversity+at+a+glance.">Ubiquitin chain diversity at a glance.</a> Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).</li><li>Ravid, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+degradation+signals+in+the+ubiquitin-proteasome+system.">Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (9), 679-690 (2008).</li><li>Erpapazoglou, Z., Walker, O., Haguenauer-Tsapis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+roles+of+k63-linked+ubiquitin+chains+in+trafficking.">Versatile roles of k63-linked ubiquitin chains in trafficking.</a> Cells. 3 (4), 1027-1088 (2014).</li><li>Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+ubiquitin+chains:+NF-kappaB+signalling,+cell+death+and+beyond.">Linear ubiquitin chains: NF-kappaB signalling, cell death and beyond.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 15 (8), 503-508 (2014).</li><li>Rieser, E., Cordier, S. M., Walczak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+ubiquitination:+a+newly+discovered+regulator+of+cell+signalling.">Linear ubiquitination: a newly discovered regulator of cell signalling.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (2), 94-102 (2013).</li><li>Collins, G. A., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Logic+of+the+26S+Proteasome.">The Logic of the 26S Proteasome.</a> Cell. 169 (5), 792-806 (2017).</li><li>Bhat, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+19S+proteasome+ATPase+Sug1+plays+a+critical+role+in+regulating+MHC+class+II+transcription.">The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription.</a> Molecular Immunology. 45 (8), 2214-2224 (2008).</li><li>Ezhkova, E., Tansey, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasomal+ATPases+link+ubiquitylation+of+histone+H2B+to+methylation+of+histone+H3.">Proteasomal ATPases link ubiquitylation of histone H2B to methylation of histone H3.</a> Molecular Cell. 13 (3), 435-442 (2004).</li><li>Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+system+as+a+critical+regulator+of+synaptic+plasticity+and+long-term+memory+formation.">The ubiquitin-proteasome system as a critical regulator of synaptic plasticity and long-term memory formation.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 105, 107-116 (2013).</li><li>Hegde, A. N., Upadhya, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+pathway+in+health+and+disease+of+the+nervous+system.">The ubiquitin-proteasome pathway in health and disease of the nervous system.</a> Trends in Neuroscience. 30 (11), 587-595 (2007).</li><li>Adori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+distribution+of+components+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+non-diseased+human+and+rat+brain.">Subcellular distribution of components of the ubiquitin-proteasome system in non-diseased human and rat brain.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54 (2), 263-267 (2006).</li><li>Upadhya, S. C., Ding, L., Smith, T. K., Hegde, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+proteasome+activity+in+the+nucleus+and+the+synaptic+terminals.">Differential regulation of proteasome activity in the nucleus and the synaptic terminals.</a> Neurochemistry International. 48 (4), 296-305 (2006).</li><li>Enenkel, C., Lehmann, A., Kloetzel, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+distribution+of+proteasomes+implicates+a+major+location+of+protein+degradation+in+the+nuclear+envelope-ER+network+in+yeast.">Subcellular distribution of proteasomes implicates a major location of protein degradation in the nuclear envelope-ER network in yeast.</a> EMBO Journal. 17 (21), 6144-6154 (1998).</li><li>Jarome, T. J., Kwapis, J. L., Ruenzel, W. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII,+but+not+protein+kinase+A,+regulates+Rpt6+phosphorylation+and+proteasome+activity+during+the+formation+of+long-term+memories.">CaMKII, but not protein kinase A, regulates Rpt6 phosphorylation and proteasome activity during the formation of long-term memories.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 7, 115 (2013).</li><li>Jarome, T. J., Werner, C. T., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+dependent+protein+degradation+is+critical+for+the+formation+and+stability+of+fear+memory+in+the+amygdala.">Activity dependent protein degradation is critical for the formation and stability of fear memory in the amygdala.</a> PLoS One. 6 (9), e24349 (2011).</li><li>Lopez-Salon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+cascade+is+required+for+mammalian+long-term+memory+formation.">The ubiquitin-proteasome cascade is required for mammalian long-term memory formation.</a> European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1820-1826 (2001).</li><li>Reis, D. S., Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+formation+for+trace+fear+conditioning+requires+ubiquitin-proteasome+mediated+protein+degradation+in+the+prefrontal+cortex.">Memory formation for trace fear conditioning requires ubiquitin-proteasome mediated protein degradation in the prefrontal cortex.</a> Frontiers in Behavior Neuroscience. 7, 150 (2013).</li><li>Rosenberg, T., Elkobi, A., Rosenblum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mAChR-dependent+decrease+in+proteasome+activity+in+the+gustatory+cortex+is+necessary+for+novel+taste+learning.">mAChR-dependent decrease in proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for novel taste learning.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 135, 115-124 (2016).</li><li>Rosenberg, T., Elkobi, A., Dieterich, D. C., Rosenblum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDAR-dependent+proteasome+activity+in+the+gustatory+cortex+is+necessary+for+conditioned+taste+aversion.">NMDAR-dependent proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for conditioned taste aversion.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 130, 7-16 (2016).</li><li>Orsi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+subcellular+changes+in+proteasome+activity+and+linkage-specific+protein+polyubiquitination+in+the+amygdala+during+the+consolidation+and+reconsolidation+of+a+fear+memory.">Distinct subcellular changes in proteasome activity and linkage-specific protein polyubiquitination in the amygdala during the consolidation and reconsolidation of a fear memory.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 157, 1-11 (2019).</li><li>Cullen, P. K., Ferrara, N. C., Pullins, S. E., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context+memory+formation+requires+activity-dependent+protein+degradation+in+the+hippocampus.">Context memory formation requires activity-dependent protein degradation in the hippocampus.</a> Learning and Memory. 24 (11), 589-596 (2017).</li><li>Jarome, T. J., Ferrara, N. C., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII+regulates+proteasome+phosphorylation+and+activity+and+promotes+memory+destabilization+following+retrieval.">CaMKII regulates proteasome phosphorylation and activity and promotes memory destabilization following retrieval.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 128, 103-109 (2016).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+protein+degradation+underlies+destabilization+of+retrieved+fear+memory.">Synaptic protein degradation underlies destabilization of retrieved fear memory.</a> Science. 319 (5867), 1253-1256 (2008).</li><li>Dunah, A. W., Standaert, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D1+receptor-dependent+trafficking+of+striatal+NMDA+glutamate+receptors+to+the+postsynaptic+membrane.">Dopamine D1 receptor-dependent trafficking of striatal NMDA glutamate receptors to the postsynaptic membrane.</a> Journal of Neuroscience. 21 (15), 5546-5558 (2001).</li><li>Kelly, P. T., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+proteins.+Characterization+of+tubulin+and+actin+and+identification+of+a+distinct+postsynaptic+density+polypeptide.">Synaptic proteins. Characterization of tubulin and actin and identification of a distinct postsynaptic density polypeptide.</a> Journal of Cell Biology. 79 (1), 173-183 (1978).</li><li>Mengual, E., Arizti, P., Rodrigo, J., Gimenez-Amaya, J. M., Castano, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+distribution+and+electron+microscopic+subcellular+localization+of+the+proteasome+in+the+rat+CNS.">Immunohistochemical distribution and electron microscopic subcellular localization of the proteasome in the rat CNS.</a> Journal of Neuroscience. 16 (20), 6331-6341 (1996).</li></ol>

여기에서, 우리는 동일 동물에 있는 다른 세포 내 구획에 걸쳐 유비퀴틴-proteasome 활동의 변경을 정량화하는 효율적인 방법을 보여줍니다. 현재, 유비퀴틴-프로테아좀 시스템의 활성에서 세포외 변화를 측정하는 대부분의 시도는 샘플당 단일 구획으로 제한되어 실험을 반복할 필요가 있다. 이것은 상당한 비용과 동물의 생명의 손실로 이어집니다. 우리의 프로토콜은 반구를 분할하여이 문제를 완?...

유비퀴틴-프로테아좀 시스템(UPS)은 세포 1에서 대부분의 수명이 짧은 단백질의 분해를 제어하는 상호 연결된 단백질구조및 리가제의 복잡한 네트워크입니다. 이 시스템에서, 단백질은 작은 수정기 유비퀴틴에 의해 분해 또는 다른 세포 과정 / 운명에 대한 표시되어 있습니다. 표적 단백질은 7개의 리신(K) 부위(K6, K11, K27, K29, K33, K48 및 K63) 또는 이전 유비퀴틴 2에서 N-말단 메티오닌(M1; 선형으로 알려진) 중하나에서 함께 연결할 수 있는 1-7 유비퀴틴 변형을 획득할 수 있다. 이들 폴리비퀴틴 태그 중 일부는 분해 특이적(K48) 3이며, 다른 것들은 단백질 분해 과정(M1)4,5,6과크게 독립적이다. 따라서, 단백질 유비퀴틴화 과정은 믿을 수 없을 만큼 복잡하며 특정 폴리유비퀴틴 태그의 변화를 정량화하는 능력은 궁극적으로 세포 기능의 변형이 주어진 역할을 이해하는 데 매우 중요하다. 이 시스템의 연구를 더욱 복잡하게 하는, 프로테아좀은 UPS 7의 촉매구조인데, 둘 다 단백질을 저하시키지만 또한 다른 비단백질분해 과정에 관여할 수 있다8,9. 당연히 그 때, 그것의 처음 발견 부터, 정상 및 비정상적인 유비퀴틴-proteasome 활동은 많은 신경학상, 신경 퇴행성 및 정신병학을 포함하여 장기 기억 형성 및 각종 질병 국가에 연루되었습니다 장애10,11. 그 결과, 뇌에서 UPS 활동을 효과적이고 효율적으로 정량화할 수 있는 방법은 궁극적으로 이 시스템이 질병 상태에서 어떻게 dysregulated되는지 이해하고 유비퀴틴 및/또는 프로테아좀 기능.
쥐와 마우스에서 뇌 조직에서 유비퀴틴-프로테아솜 활성을 정량화하는 데 많은 문제가 있는데, 이는 1) 유비퀴틴 수정의 다양성, 및 2) 분포 및 세포 외 구획에 걸쳐 작동하는 UPS의 차동 조절12,13,14. 예를 들어, 기억 형성 동안 뇌에서 유비퀴틴-프로테아좀 기능의 초기 많은 데모는 전체 세포 용해및 단백질 유비퀴틴화 및 프로테아좀 활성 모두에서 시간 의존적 증가를 나타내었으며,15, 16세 , 17세 , 18세 , 19세 , 20. 그러나, 우리는 최근에 유비퀴틴 - proteasome 활동이 학습에 대한 응답으로 세포 외 구획에 걸쳐 광범위하게 변화한다는 것을 발견했으며, 일부 지역에서는 동시 증가와 다른 지역의 감소, 크게 다른 패턴이 있습니다. 이전에 전체 세포에서 보고 된 것에서21. 이것은 다른 세포 구획에 걸쳐 UPS 활동의 변화의 기여를 해리 할 수 없기 때문에 전체 세포 접근법의 한계와 일치합니다. 최근 연구는 학습에 대한 응답으로 시냅스에서 특히 UPS를 연구하기 위해 시냅스 분획 프로토콜을 채택했지만22,23,24,사용되는 방법은 측정 할 수있는 능력을 폐색 같은 동물에 핵 및 세포질 유비퀴틴 - 프로 테아좀 변화. 이로 인해 불필요한 실험을 여러 번 반복하여 각각다른 세포내 분획을 수집해야 합니다. 이것은 동물의 생명을 더 큰 손실귀착할 뿐 아니라, 주어진 사건에 응하여 다른 세포 외 구획에 걸쳐 UPS 활동을 직접 비교하는 기능을 제거하거나 특정 질병 상태 도중. 유비퀴틴과 프로테아좀의 단백질 표적이 세포 전체에 걸쳐 광범위하게 다르다는 점을 고려할 때, 유비퀴틴-프로테아좀 신호가 뚜렷한 세포외 구획에서 어떻게 다른지 이해하는 것은 UPS의 기능적 역할을 식별하는 데 매우 중요합니다. 기억 형성 및 신경 학 동안 뇌, 신경 퇴행 성 및 정신 장애.
이러한 필요성을 해결하기 위해, 우리는 최근에 핵, 세포질 및 시냅스 분획이 동일한 동물21에서주어진 뇌 영역에 대해 수집 될 수있는 절차를 개발했습니다. 또한 동일한 샘플에서 여러 세포 외 분획을 수집하여 얻을 수 있는 제한된 양의 단백질을 고려하여 이전에 확립된 프로토콜을 최적화하여 시험관내 프로테아좀 활성 및 연계 성 활성을 분석했습니다. 설치류 뇌 조직에서 수집 된 lysed 세포에서 단백질 유비퀴틴. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 쥐의 측측 편도체에서 핵과 세포질및 시냅스에서 proteasome 활성, K48, K63, M1 및 전반적인 단백질 폴리유비퀴틴화 수준에서 학습 의존적 변화를 수집하고 직접 비교할 수 있었습니다. 여기에서는 UPS가 장기 기억 형성 및 다양한 질병 상태에 어떻게 관여하는지에 대한 이해를 크게 향상시킬 수 있는 절차(그림 1)를 자세히 설명합니다. 그러나, 당사의 프로토콜에서 논의된 시험관 내 프로테아솜 활성은 널리 사용되고 있지만, 완전한 26S 프로테아솜 복합체의 활성을 직접적으로 측정하지 않는다는 점에 유의해야 한다. 오히려, 이 분석은 20S 코어의 활성을 측정하며, 이는 전체 26S 프로테아솜 컴플렉스와 는 반대로 코어 자체의 활동을 이해하는 프록시역할을 할 수 밖에 없다는 것을 의미합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:878px;" width="878">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">0.5M EDTA</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">15575020</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">20S Proteasome Activity Kit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>APT280</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">ATP</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">FERR1441</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Beta-actin antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>4967S</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Beta-tubulin antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>2128T</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BioTek Synergy H1 plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>VATECHH1MT3</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN19024280</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">clasto lactacystin b-lactone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L7035</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cryogenic cup</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>033377B</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMSO</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Varous other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">DTT</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">D0632</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Glycerol</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">G5516</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">H3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1791</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">HEPES</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">H3375</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SA48</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">IGEPAL (NP-40)</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">I3021</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">K48 Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab140601</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">K63 Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab179434</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">KCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">P9541</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KONTES tissue grinder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885300-0002</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laemmli sample buffer</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Linear Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Life Sensors</td>
			<td>AB-0130-0100</td>
			<td>Only M1 antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">MgCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">442611</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000213</td>
			<td>Various other manufacturers/models</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">myr-AIP</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-P212-0500</td>
			<td>Carried by Millipore-Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">NaCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">S3014</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Odyssey Fc Imaging System</td>
			<td>LiCor</td>
			<td>2800-02</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Phosphatase Inhibitor</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">524625</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Precision Plus Protein Standard</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>161-0373</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Protease Inhibitor</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">P8340</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PSD95 antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>3450T</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:222px;">SDS</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">L3771</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SS255</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:222px;">Sucrose</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">S0389</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">TBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62938</td>
			<td>Varous other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:50px;width:222px;">Tris</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">T1503</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;">Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;">Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-PW8810</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying subcellular ubiquitin-proteasome activity in the rodent brain

유비퀴틴-프로테아좀 시스템은 진핵생물의 단백질 분해 및 기타 다양한 세포 과정의 주요 조절제입니다. 뇌에서, 유비퀴틴-프로테아좀 활동의 증가는 시냅스 가소성 및 기억 형성에 매우 중요하며, 이 시스템의 비정상적인 변화는 다양한 신경학적, 퇴행성 및 정신 장애와 관련이 있다. 두뇌에 있는 기능을 유비퀴틴 proteasome 공부에 있는 문제점의 한가지는 단백질 표적, 기능적인 역할 및 규칙의 기계장치가 넓게 변화할 수 있는 모든 세포 구획에 존재한다는 것입니다. 그 결과, 동일한 동물 내의 다른 세포 내 구획에서 뇌 유비퀴틴 단백질 표적화 및 프로테아좀 촉매 활성을 직접 비교하는 능력은 UPS가 시냅스 가소성에 기여하는 방법을 완전히 이해하는 데 매우 중요합니다. 기억력과 질병을 앓고 있습니다. 여기에 설명된 방법은 동일한 설치류(쥐) 뇌에서 핵, 세포질 및 조시냅스 분획을 수집한 다음 프로테아좀 촉매 활성의 동시 정량화(간접적으로 프로테아좀 코어의 활성 제공)를 허용합니다. 만) 및 링키지 특이적 유비퀴틴 단백질 태깅. 따라서, 이 방법은 시냅스 가소성, 기억 형성 및 상이한 질병 상태 동안 동일한 동물의 상이한 뇌 영역에서의 유비퀴틴-프로테아좀 활성의 세포내 변화를 직접 비교하는데 사용될 수 있다. 이 방법은 또한 동일한 동물 내의 다른 단백질의 세포내 분포 및 기능을 평가하는데 사용될 수 있다.

여기에 기재된 절차를 사용하여, 핵, 세포질 및 시냅스 분획을 쥐 뇌의 측측편도체로부터 수집하였다(도 1). 개별 분획의 순도는 서쪽 블로팅을 통해 확인되었고, 리세이트에서 농축되거나 고갈되어야 하는 단백질에 대한 항체를 조사했다. 조시냅스 분획이 수집된 제1 반구에서, 후층성 밀도 단백질 95(PSD95)는 세포질에서 더 낮은 수준으로 시냅스,<stro...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain at JoVE.com

Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain

이 프로토콜은 설치류 뇌의 다른 세포 구획에서 유비퀴틴-프로테아좀 시스템(UPS) 활성을 효율적으로 정량화하도록 설계되었습니다. 사용자는 동일한 동물의 핵, 세포질 및 시냅스 분획에서 작동하는 UPS를 검사하여 이러한 복잡한 분석을 수행하는 데 필요한 동물의 수와 시간을 줄일 수 있습니다.

설치류 뇌의 세포외 유비퀴틴-프로테아솜 활동 정량화

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases ...

이 프로토콜은 세포 외 단백질 유비퀴티니션 수준과 설치류 뇌의 proteasome 활동을 측정하여 세포 활동, 학습 또는 질병에 대한 반응으로 유비퀴틴-프로테솜 활동이 어떻게 변하는지 비교합니다. 이 프로토콜은 동일한 설치류 뇌에서 시냅스, 세포질 및 핵 분획을 수집할 수 있습니다. 손실을 최소화, 그것은 작은 조직 수량 및 기본 실험실 장비와 함께 수행 될 수 있습니다.절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생 인 테일러 맥파든 (Taylor McFadden)이 될 것입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 설치류 뇌 조직의 수집 및 해부로 이 절차를 시작합니다. 사용된 반구가 각 실험 그룹의 추출 조건에서 균형을 이루도록 합니다.영하 80도 냉동고에서 관심 지역의 한 반구를 포함하는 1.5 밀리리터 원심분리기 마이크로튜브를 제거하십시오. 메스를 사용하여 냉동 뇌 조직을 2 밀리리터 유리 테플론 균질화제로 옮기. 테플론 튜브에 500 마이크로리터의 리시스 버퍼를 추가합니다.유봉 B를 사용하여, 고체 물질의 가시량이 없을 때까지 15 스트로크로 동일한 조직을 균질화합니다. 각 스트로크 중에 터닝 모션을 사용합니다. 1, 000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 균질화된 샘플을 새로운 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 전달합니다.튜브를 젖은 얼음 위에 놓고 30분 동안 배양합니다. 마이크로 센트심분리기에 튜브를 놓고 섭씨 4도에서 845배g에서 10분간 회전합니다. 완료 후, 조심스럽게 파이펫팅하여 상체를 제거하고 새로운 1.5 밀리리터 미세 원심 분리튜브에 배치.이것은 세포질 분획입니다. 생성된 펠릿에 50마이크로리터의 추출 버퍼를 추가하고 파이펫팅으로 다시 중단합니다. 펠릿을 소용돌이피지 마십시오.재중단 된 펠릿이 들어있는 튜브를 얼음에 놓고 30 분 동안 배양하십시오. 그런 다음 튜브를 20분 동안 21, 섭씨 456회에서 원심분리합니다. 원심 분리에 따라, 조심스럽게 파이펫팅하여 상체를 제거하고 새로운 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브에 배치.이것은 핵 분획입니다. 리시스 버퍼 대신 TEVP 버퍼 500 마이크로리터를 사용하는 것을 제외하고 는 이전과 마찬가지로 관심 영역의 한 반구를 균질화합니다. 1, 000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 균질화된 샘플을 새로운 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브로 이송합니다.샘플을 섭씨 섭씨 4도에서 10분 동안 1, 000배 g에서 원심분리합니다. 상체를 수집하고 1, 000 마이크로 리터 파이펫을 사용하여 새로운 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 전송합니다. 원심 분리는 섭씨 4도에서 10 분 동안 10, 000 배 g에서 샘플을 원심 분리합니다.핵과 큰 파편이 들어있는 원래 펠릿을 폐기하십시오. 새로운 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 상체를 전송합니다. 이것은 세포성 분획입니다.50 마이크로리터의 균질화 버퍼를 펠릿에 추가하고 고체 물질이 보이지 않을 때까지 파이펫팅으로 다시 중단합니다. 원심 분리는 섭씨 4도에서 10 분 동안 20, 000 배 g에서 샘플을 원심 분리합니다. 새로운 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 상체를 전송합니다.이것은 조잡한 시냅토소말 막 분획입니다. 분석기를 설정하려면 플레이트 판독기를 섭씨 37도로 미리 떼어 내고 달리기를 버틸 수 있습니다. 360 나노미터로 발산하고 460 나노미터로 방출합니다.사용되는 96 웰 플레이트가 명확하면 광학 위치를 아래쪽으로 설정합니다. 어두운 96 웰 플레이트를 사용하는 경우 광학 위치를 맨 위로 설정합니다. 30분마다 2시간 씩 스캔하여 운동 실행을 프로그래밍합니다.키트에 제공된 20S 10X 분석 버퍼를 13.5 밀리리터의 초순수로 재구성합니다. 현재 1X 버퍼에 100 밀리머 ATP의 마이크로리터 14개를 추가합니다. 이것은 크게 샘플에서 proteasome 활동을 향상시키고 분석 신뢰성을 향상시킵니다.100 마이크로리터의 DMSO로 키트에 제공된 AMC 표준을 재구성합니다. 표준이 빛에 민감하므로 어두운 또는 저조도 조건에서 AMC 표준을 사용하여 단계를 수행합니다. 높은 값부터 낮은 AMC 농도까지 AMC의 표준 곡선을 만듭니다.이 곡선은 균질화된 샘플에서 프로테아솜 활성의 플레이트 판독기 교정 및 분석에 사용됩니다. DMSO의 65 마이크로 리터와 키트에 제공 된 proteasome 감판을 재구성. 또한 기판이 빛에 민감하기 때문에 어두운 또는 저조도 조건에서이 단계를 수행합니다.그런 다음 20S 분석 버퍼를 사용하여 새로운 1.5 밀리리터 미세 센심 분리기 튜브에서 프로테모성 기판의 1~20 희석을 생성한다. 원하는 시료의 정규화된 양을 96웰 플레이트에 추가합니다. 각 샘플을 복제하여 실행합니다.필요한 샘플의 양은 조직 준비에 따라 다릅니다. 일반적으로, 10 받는 번째 20 마이크로 그램은 모든 세포 전 분획에 대 한 충분 한. 초순수수로 80마이크로리터에 시료의 양량을 잘 불어넣으세요.추가된 양은 추가된 샘플의 양에 따라 다릅니다. 두 개의 별도 우물에 80 마이크로리터의 물을 단독으로 추가합니다. 이들은 분석 공백이 될 것입니다.분석 공백을 포함하여 각각에 20S 분석 버퍼 10 마이크로리터를 추가합니다. 리피터 또는 자동화된 파이펫을 사용하여 우물 전체에서 일관된 분석 볼륨을 보장합니다. 조명을 끄거나 어두운 방으로 들어갑니다.각 표준에 대해 단일 웰을 사용하여 희석된 AMC 표준 100마이크로리터를 모두 새로운 웰에 추가합니다. 어둠 속에서, 리피터 또는 자동화 된 파이펫을 사용하여 10 마이크로 리터의 희석 된 프로테솜 기판을 샘플 및 분석 공백을 포함하지만 AMC 표준은 포함하지 않는 우물에 추가하십시오. 플레이트 판독기에 접시를 넣고 운동 실행을 시작합니다.독특한 연결 별 폴리비퀴틴 항체와 함께 다양한 표준 서양 블로팅 프로토콜을 사용하여 설치류 뇌 조직에서 수집된 다양한 세포 외 분획에서 다양한 폴리비퀴틴 태그의 정량화를 수행한다. 일부 유비퀴틴 웨스턴 블롯 이미지는 뚜렷한 대역의 열을 제공하는 반면 다른 이미지는 명확한 선이 거의 없거나 전혀 없는 얼룩 모양의 패턴을 생성합니다. 이미지 유비퀴틴 웨스턴 블롯의 정량화를 위해 전체 분자 표준 사다리를 확장하는 컬럼 주위에 상자를 그립니다.유비퀴틴 염색이 전체 사다리를 통해 확장되면 상자를 조정합니다. 이것은 lysine 48 수정에 대 한 일반적 이며 세포 전 구획에 걸쳐 광범위 하 게 변화. 마지막으로, 모든 면의 열을 둘러싼 배경의 평균 광학 밀도로 계산되는 배경을 뺍니다.여기에 동일한 동물의 측면 편도체로부터 수집된 다른 분획에서 프로테솜 활성의 정량화가 도시되어 있다. 시험관 내 프로테아솜 활성 분석 동안, 검출된 상대형 형광 단위는 시냅스 분획, 세포질 분획 및 핵 분획에서 분석의 시작부터 끝까지 증가하였다. 프로테모터어 억제제 베타락은 RfUs가 세션 전반에 걸쳐 변화하는 것을 방지했습니다.세포 전 형 차이는 동일한 동물의 측면 편도체에서 프로테솜 활성에서 관찰되었다. 시냅스 분획 내의 활동 감소에 대응하는 대조군을 기준으로 훈련된 동물에서 핵 프로테솜 활성의 증가가 검출되었다. 세포질 균 증액 활성 기준선에 남아.여기에 도시된 링크별 단백질 유비퀴티뉴션의 세포전 차이는 학습 후 같은 동물의 측면 편도체에서 발생한다. 세포질 분획의 감소와 상관되는 학습 후 핵 분획의 전반적인 유비쿼터션이 증가했습니다. 학습 후, 선형 유비쿼터티는 핵 분획에서 증가하지만 세포질 또는 시냅스 분획은 증가하지 않습니다.흥미롭게도, K63 유비퀴티온은 시냅스 분수의 감소와 상관관계가 있는 학습 후 핵 분획이 증가했습니다. 반면 K48 단종은 학습 후 핵 및 세포질 분획에서 증가했지만 시냅스 분획에서는 그렇지 않습니다. 이 프로토콜은 또한 동일한 동물 내의 다른 단백질의 세포 전체 분포 및 기능을 이해하는 데 사용할 수 있습니다.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Neuroscience

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

쥐 두뇌에 동시 fMRI와 전기 생리학

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

연구

신경과학

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

의 활동을 Quantifying CIS</emExplant Electroporation하여 마우스 망막에서> - 규제 요소

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

설치류 중추 신경계에 약물을 직접 심실 배달

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

설치류 중추 신경계의 생체 Optogenetic 자극

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

마우스 뇌의 다양한 지역에서 텔로 머라 제 활동 : 비 방사성 텔로 머라 제는 증폭 프로토콜을 반복 (TRAP) 분석

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

동시 전기 생리 녹화 및 설치류의 뇌에서 억제 에이전트의 마이크로 주사

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

쥐 두뇌에 있는 Microinjections에 대 한 개인화 된 바늘

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

시 냅 스 밀도 Hippocampal 설치류 두뇌 분할 영역에서의 평가

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

녹음 및 Microelectrode 배열에 결합 하는 설치류 뇌 조각에 Epileptiform 활동의 변조

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

가압된 설치류에 폭발을 이용한 Neurotrauma의 효과 중간 대뇌 동맥

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...