Name: quantifying subcellular ubiquitin-proteasome activity in the rodent brain
Uploaded: 2019-05-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av oppstart midler fra College of Agricultural and Life Sciences og College of Science ved Virginia Tech. T.M. støttes av George Washington Carver program ved Virginia Tech.

Alle prosedyrer inkludert dyr har blitt godkjent av Virginia Polytechnic Institute og State University institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC).
1. innsamling og Disseksjon av gnagere Brain tissue
Merk: Denne protokollen kan brukes på en rekke av hjernen regioner og brukes med ulike vev samling prosedyrer. Neden er fremgangsmåten anvendt inne våre laboratorium for subcellulære av rotten hjerne tissue, benytter 8-9 uke gamle mannlig Spr...

<ol>
	<li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+system.">The ubiquitin system.</a> Annu Rev Biochem. 67, 425-479 (1998).</li><li>Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+chain+diversity+at+a+glance.">Ubiquitin chain diversity at a glance.</a> Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).</li><li>Ravid, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+degradation+signals+in+the+ubiquitin-proteasome+system.">Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (9), 679-690 (2008).</li><li>Erpapazoglou, Z., Walker, O., Haguenauer-Tsapis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+roles+of+k63-linked+ubiquitin+chains+in+trafficking.">Versatile roles of k63-linked ubiquitin chains in trafficking.</a> Cells. 3 (4), 1027-1088 (2014).</li><li>Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+ubiquitin+chains:+NF-kappaB+signalling,+cell+death+and+beyond.">Linear ubiquitin chains: NF-kappaB signalling, cell death and beyond.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 15 (8), 503-508 (2014).</li><li>Rieser, E., Cordier, S. M., Walczak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+ubiquitination:+a+newly+discovered+regulator+of+cell+signalling.">Linear ubiquitination: a newly discovered regulator of cell signalling.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (2), 94-102 (2013).</li><li>Collins, G. A., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Logic+of+the+26S+Proteasome.">The Logic of the 26S Proteasome.</a> Cell. 169 (5), 792-806 (2017).</li><li>Bhat, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+19S+proteasome+ATPase+Sug1+plays+a+critical+role+in+regulating+MHC+class+II+transcription.">The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription.</a> Molecular Immunology. 45 (8), 2214-2224 (2008).</li><li>Ezhkova, E., Tansey, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasomal+ATPases+link+ubiquitylation+of+histone+H2B+to+methylation+of+histone+H3.">Proteasomal ATPases link ubiquitylation of histone H2B to methylation of histone H3.</a> Molecular Cell. 13 (3), 435-442 (2004).</li><li>Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+system+as+a+critical+regulator+of+synaptic+plasticity+and+long-term+memory+formation.">The ubiquitin-proteasome system as a critical regulator of synaptic plasticity and long-term memory formation.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 105, 107-116 (2013).</li><li>Hegde, A. N., Upadhya, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+pathway+in+health+and+disease+of+the+nervous+system.">The ubiquitin-proteasome pathway in health and disease of the nervous system.</a> Trends in Neuroscience. 30 (11), 587-595 (2007).</li><li>Adori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+distribution+of+components+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+non-diseased+human+and+rat+brain.">Subcellular distribution of components of the ubiquitin-proteasome system in non-diseased human and rat brain.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54 (2), 263-267 (2006).</li><li>Upadhya, S. C., Ding, L., Smith, T. K., Hegde, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+proteasome+activity+in+the+nucleus+and+the+synaptic+terminals.">Differential regulation of proteasome activity in the nucleus and the synaptic terminals.</a> Neurochemistry International. 48 (4), 296-305 (2006).</li><li>Enenkel, C., Lehmann, A., Kloetzel, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+distribution+of+proteasomes+implicates+a+major+location+of+protein+degradation+in+the+nuclear+envelope-ER+network+in+yeast.">Subcellular distribution of proteasomes implicates a major location of protein degradation in the nuclear envelope-ER network in yeast.</a> EMBO Journal. 17 (21), 6144-6154 (1998).</li><li>Jarome, T. J., Kwapis, J. L., Ruenzel, W. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII,+but+not+protein+kinase+A,+regulates+Rpt6+phosphorylation+and+proteasome+activity+during+the+formation+of+long-term+memories.">CaMKII, but not protein kinase A, regulates Rpt6 phosphorylation and proteasome activity during the formation of long-term memories.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 7, 115 (2013).</li><li>Jarome, T. J., Werner, C. T., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+dependent+protein+degradation+is+critical+for+the+formation+and+stability+of+fear+memory+in+the+amygdala.">Activity dependent protein degradation is critical for the formation and stability of fear memory in the amygdala.</a> PLoS One. 6 (9), e24349 (2011).</li><li>Lopez-Salon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+cascade+is+required+for+mammalian+long-term+memory+formation.">The ubiquitin-proteasome cascade is required for mammalian long-term memory formation.</a> European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1820-1826 (2001).</li><li>Reis, D. S., Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+formation+for+trace+fear+conditioning+requires+ubiquitin-proteasome+mediated+protein+degradation+in+the+prefrontal+cortex.">Memory formation for trace fear conditioning requires ubiquitin-proteasome mediated protein degradation in the prefrontal cortex.</a> Frontiers in Behavior Neuroscience. 7, 150 (2013).</li><li>Rosenberg, T., Elkobi, A., Rosenblum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mAChR-dependent+decrease+in+proteasome+activity+in+the+gustatory+cortex+is+necessary+for+novel+taste+learning.">mAChR-dependent decrease in proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for novel taste learning.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 135, 115-124 (2016).</li><li>Rosenberg, T., Elkobi, A., Dieterich, D. C., Rosenblum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDAR-dependent+proteasome+activity+in+the+gustatory+cortex+is+necessary+for+conditioned+taste+aversion.">NMDAR-dependent proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for conditioned taste aversion.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 130, 7-16 (2016).</li><li>Orsi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+subcellular+changes+in+proteasome+activity+and+linkage-specific+protein+polyubiquitination+in+the+amygdala+during+the+consolidation+and+reconsolidation+of+a+fear+memory.">Distinct subcellular changes in proteasome activity and linkage-specific protein polyubiquitination in the amygdala during the consolidation and reconsolidation of a fear memory.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 157, 1-11 (2019).</li><li>Cullen, P. K., Ferrara, N. C., Pullins, S. E., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context+memory+formation+requires+activity-dependent+protein+degradation+in+the+hippocampus.">Context memory formation requires activity-dependent protein degradation in the hippocampus.</a> Learning and Memory. 24 (11), 589-596 (2017).</li><li>Jarome, T. J., Ferrara, N. C., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII+regulates+proteasome+phosphorylation+and+activity+and+promotes+memory+destabilization+following+retrieval.">CaMKII regulates proteasome phosphorylation and activity and promotes memory destabilization following retrieval.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 128, 103-109 (2016).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+protein+degradation+underlies+destabilization+of+retrieved+fear+memory.">Synaptic protein degradation underlies destabilization of retrieved fear memory.</a> Science. 319 (5867), 1253-1256 (2008).</li><li>Dunah, A. W., Standaert, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D1+receptor-dependent+trafficking+of+striatal+NMDA+glutamate+receptors+to+the+postsynaptic+membrane.">Dopamine D1 receptor-dependent trafficking of striatal NMDA glutamate receptors to the postsynaptic membrane.</a> Journal of Neuroscience. 21 (15), 5546-5558 (2001).</li><li>Kelly, P. T., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+proteins.+Characterization+of+tubulin+and+actin+and+identification+of+a+distinct+postsynaptic+density+polypeptide.">Synaptic proteins. Characterization of tubulin and actin and identification of a distinct postsynaptic density polypeptide.</a> Journal of Cell Biology. 79 (1), 173-183 (1978).</li><li>Mengual, E., Arizti, P., Rodrigo, J., Gimenez-Amaya, J. M., Castano, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+distribution+and+electron+microscopic+subcellular+localization+of+the+proteasome+in+the+rat+CNS.">Immunohistochemical distribution and electron microscopic subcellular localization of the proteasome in the rat CNS.</a> Journal of Neuroscience. 16 (20), 6331-6341 (1996).</li></ol>

Her demonstrerer vi en effektiv metode for kvantifisere endringer i ubiquitin-proteasomet aktivitet på tvers av forskjellige subcellulære rom i det samme dyret. For tiden har de fleste forsøk på å måle subcellulære endringer i aktiviteten til ubiquitin-proteasomet systemet vært begrenset til en enkelt kupé per prøve, noe som resulterer i behovet for å gjenta eksperimenter. Dette fører til betydelige kostnader og tap av dyreliv. Vår protokoll lindrer dette problemet ved å splitte halvkuler, slik at ulike mob...

Ubiquitin-proteasomet system (UPS) er et komplekst nettverk av sammenkoblede proteinstrukturer og ligases som kontrollerer nedbrytning av de fleste kortvarige proteiner i celle1. I dette systemet, proteiner er merket for degradering eller andre cellulære prosesser/skjebne av den lille endrings ubiquitin. Et mål protein kan tilegne seg 1-7 ubiquitin modifikasjoner, som kan koble sammen på en av syv lysin (K) nettsteder (K6, K11, K27, K29, K33, K48 og K63) eller N-Terminal metionin (M1; så kjent som lineær) i forrige ubiquitin2. Noen av disse polyubiquitin kodene er degradering-spesifikke (K48)3, mens andre er i stor grad uavhengig av protein fornedrelse prosessen (M1)4,5,6. Således, proteinet ubiqitinering forarbeide er utrolig innviklet og evnen å kvantifisere endre inne en spesifikk polyubiquitin tag er betenkelig for til slutt forståelse rollen av det gitt modifisering inne Cellular fungerer. Ytterligere kompliserer studiet av dette systemet, proteasomet, som er katalysatoren strukturen i ups7, både forringer proteiner, men kan også være involvert i andre ikke-proteolytiske prosesser8,9. Ikke overraskende da, siden den første oppdagelsen, har normal og avvikende ubiquitin-proteasomet aktivitet vært innblandet i langsiktig minne formasjon og en rekke sykdomstilstander, inkludert mange nevrologiske, nevrodegenerative og psykiatriske lidelser10,11. Som et resultat av dette er metoder som effektivt kan kvantifisere UPS-aktivitet i hjernen, avgjørende for til syvende og sist å forstå hvordan dette systemet dysregulated i sykdomstilstander og den endelige utviklingen av behandlingsalternativer rettet mot ubiquitin og/eller proteasomet fungerer.
Det er en rekke problemer i kvantifisere ubiquitin-proteasomet aktivitet i hjernevevet fra rotter og mus, som er de vanligste modell systemene som brukes til å studere UPS-funksjon, inkludert 1) mangfoldet av ubiquitin modifikasjoner, og 2) distribusjon og differensial regulering av UPS fungerer på tvers av subcellulære rom12,13,14. For eksempel brukte mange av de tidlige demonstrasjoner av ubiquitin-proteasomet funksjon i hjernen under minne formasjon hele celle lysater og indikerte tidsavhengige økninger i både protein ubiqitinering og proteasomet aktivitet15, 16 flere , 17 i , 18 av år , 19 andre priser , 20. men vi har nylig funnet at ubiquitin-proteasomet aktivitet varierte mye over subcellulære avdelinger som svar på læring, med samtidig økning i enkelte regioner og avtar i andre, et mønster som avviker betydelig fra det som tidligere ble rapportert i hele cellen lysater21. Dette er i overensstemmelse med begrensningen av en helt celle tilnærming, ettersom den ikke kan distansere bidraget av endringer i UPS-aktivitet på tvers av forskjellige subcellulære avdelinger. Selv om nyere studier har ansatt Synaptic brøk protokoller for å studere ups spesielt på synapser som svar på læring22,23,24, metodene som brukes tette evnen til å måle kjernefysiske og cytoplasmatiske ubiquitin-proteasomet endringer i samme dyr. Dette resulterer i et unødvendig behov for å gjenta eksperimenter flere ganger, samle en annen subcellulære brøkdel i hver. Dette resulterer ikke bare i et større tap av dyreliv, men det eliminerer muligheten til å sammenligne UPS-aktivitet direkte på tvers av ulike subcellulære avdelinger som svar på en gitt hendelse eller under en bestemt sykdomstilstand. Med tanke på at protein mål av ubiquitin og proteasomet varierer mye gjennom cellen, forstå hvordan ubiquitin-proteasomet signalering varierer i distinkte subcellulære rom er avgjørende for å identifisere den funksjonelle rollen til UPS i hjernen under minne formasjon og nevrologiske, nevrodegenerative og psykiatriske lidelser.
For å møte dette behovet, har vi nylig utviklet en prosedyre der kjernefysiske, cytoplasmatiske og Synaptic fraksjoner kan samles for en gitt hjerne regionen fra samme dyret21. I tillegg, for å gjøre rede for den begrensede mengden protein som kan fås fra å samle flere subcellulære fraksjoner fra samme prøve, optimaliserte vi tidligere etablerte protokoller for å analysen in vitro proteasomet aktivitet og koblings spesifikk protein ubiqitinering i lysert celler samlet inn fra gnager hjernevev. Ved hjelp av denne protokollen, kunne vi samle og direkte sammenligne læring-avhengige endringer i proteasomet aktivitet, K48, K63, M1 og generelle protein polyubiquitination nivåer i kjernen og cytoplasma og på synapser i lateral amygdala av rotter. Her beskriver vi i detalj vår prosedyre (figur 1), noe som kan forbedre vår forståelse av hvordan UPS er involvert i langsiktig minne formasjon og ulike sykdomstilstander. Imidlertid bør det bemerkes at in vitro proteasomet aktivitet diskutert i vår protokoll, mens mye brukt, ikke direkte måle aktiviteten til komplett 26S proteasomet komplekser. Rather, denne analysen måler aktiviteten i 20-årene kjernen, betyr det kan bare tjene som en proxy for å forstå aktiviteten til kjernen i seg selv i motsetning til hele 26S proteasomet kompleks.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:878px;" width="878">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">0.5M EDTA</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">15575020</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">20S Proteasome Activity Kit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>APT280</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">ATP</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">FERR1441</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Beta-actin antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>4967S</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Beta-tubulin antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>2128T</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BioTek Synergy H1 plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>VATECHH1MT3</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN19024280</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">clasto lactacystin b-lactone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L7035</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cryogenic cup</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>033377B</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMSO</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Varous other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">DTT</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">D0632</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Glycerol</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">G5516</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">H3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1791</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">HEPES</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">H3375</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SA48</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">IGEPAL (NP-40)</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">I3021</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">K48 Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab140601</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">K63 Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab179434</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">KCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">P9541</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KONTES tissue grinder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885300-0002</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laemmli sample buffer</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Linear Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Life Sensors</td>
			<td>AB-0130-0100</td>
			<td>Only M1 antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">MgCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">442611</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000213</td>
			<td>Various other manufacturers/models</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">myr-AIP</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-P212-0500</td>
			<td>Carried by Millipore-Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">NaCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">S3014</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Odyssey Fc Imaging System</td>
			<td>LiCor</td>
			<td>2800-02</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Phosphatase Inhibitor</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">524625</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Precision Plus Protein Standard</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>161-0373</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Protease Inhibitor</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">P8340</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PSD95 antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>3450T</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:222px;">SDS</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">L3771</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SS255</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:222px;">Sucrose</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">S0389</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">TBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62938</td>
			<td>Varous other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:50px;width:222px;">Tris</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">T1503</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;">Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;">Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-PW8810</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying subcellular ubiquitin-proteasome activity in the rodent brain

Ubiquitin-proteasomet systemet er en sentral regulator av protein degradering og en rekke andre cellulære prosesser i Landplantenes. I hjernen, økninger i ubiquitin-proteasomet aktivitet er avgjørende for Synaptic plastisitet og minne formasjon og avvikende endringer i dette systemet er forbundet med en rekke nevrologiske, nevrodegenerative og psykiatriske lidelser. Et av problemene i å studere ubiquitin-proteasomet funksjon i hjernen er at det er til stede i alle cellulære rom, der proteinet mål, funksjonell rolle og mekanismer for regulering kan variere mye. Som et resultat, evnen til å direkte sammenligne hjernen ubiquitin protein målretting og proteasomet katalysator i ulike subcellulære rom innenfor samme dyr er avgjørende for fullt ut å forstå hvordan UPS bidrar til Synaptic plastisitet, hukommelse og sykdom. Metoden beskrevet her tillater innsamling av kjernefysiske, cytoplasmatiske og råolje Synaptic fraksjoner fra samme gnager (rotte) hjernen, etterfulgt av samtidige kvantifisering av proteasomet katalysator (indirekte, gi aktivitet av proteasomet kjerne ) og koblings spesifikk ubiquitin protein tagging. Således, metoden kan brukes å direkte sammenligne subcellulære endre inne ubiquitin-proteasomet aktivitet inne annerledes hjerneområder inne det likt dyr i løpet av Synaptic plastisitet, hukommelse formasjon og annerledes sykdommen fastslår. Denne metoden kan også brukes til å vurdere subcellulære fordeling og funksjon av andre proteiner innenfor samme dyr.

Ved hjelp av prosedyren som er beskrevet her, kjernefysiske, cytoplasmatiske og Synaptic fraksjoner ble samlet inn fra lateral amygdala av rotte hjernen (figur 1). Renhet av de enkelte fraksjoner ble bekreftet via vestlig blotting, undersøkelser med antistoffer mot proteiner som skal være beriket eller utarmet i lysat. I den første halvkule der en grov Synaptic brøkdel ble samlet inn, postsynaptic tetthet protein 95 (PSD95) var til stede i Synaptic, men i...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain at JoVE.com

Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain

Denne protokollen er utformet for å effektivt kvantifisere ubiquitin-proteasomet system (UPS) aktivitet i ulike cellulære rom i den gnager hjernen. Brukernes er kjøpedyktig eksamen UPS fungerer inne atomer, cytoplasmatiske og Synaptic brøk inne det likt dyr, slankende beløpet av tid og antallet av dyrene behøvde å utføre disse innviklet analyser.

Kvantifisere Subcellulære Ubiquitin-proteasomet aktivitet i gnager hjernen

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases ...

Denne protokollen måler subcellulære proteinubiquitination nivåer og proteasom aktivitet i gnagerhjernen slik at innenfor sammenligninger av hvordan ubiquitin-proteasom aktivitet endres som svar på cellulær aktivitet, læring eller sykdom. Protokollen tillater innsamling av synaptiske, cytoplasmatiske og kjernefysiske fraksjoner fra samme gnagerhjerne. Minimere tap, det kan utføres med små vev mengder og grunnleggende laboratorieutstyr.Å demonstrere prosedyren vil være Taylor McFadden, en utdannet student fra laboratoriet mitt. Begynn denne prosedyren med innsamling og disseksjon av gnagerhjernevev som beskrevet i tekstprotokollen. Sørg for at den brukte halvkule er motbalansert på tvers av ekstraksjonsforhold for hver eksperimentell gruppe.Fjern 1,5 milliliter sentrifuge mikrorør som inneholder en halvkule av interesseområdet fra minus 80 grader Celsius fryser. Ved hjelp av en skalpell, overføre det frosne hjernevevet til en to milliliter glass Teflon homogenisator. Tilsett 500 mikroliter lysisbuffer til Teflon-røret.Ved hjelp av pestle B, homogenisere det samme vevet med 15 slag til ingen synlig mengde fast materiale er tilstede. Bruk en svingbevegelse under hvert slag. Med en 1000 mikroliter pipette, overfør den homogeniserte prøven til et nytt 1,5 milliliter mikrocentrifugerør.Legg røret på våt is og inkuber i 30 minutter. Plasser røret i mikrocentrifuge og spinn i 10 minutter ved 845 ganger g i fire grader Celsius. Etter ferdigstillelse, fjern forsiktig supernatanten ved å pipettering og legg i et nytt 1,5 milliliter mikrocentrifugerør.Dette er den cytoplasmatiske fraksjonen. Tilsett 50 mikroliter ekstraksjonsbuffer til den resulterende pelleten og gjenoppliving ved pipettering. Pellet må ikke virvles.Plasser røret som inneholder den gjenbrukte pelleten på is og inkuber i 30 minutter. Deretter sentrifugere røret i 20 minutter ved 21, 456 ganger g i fire grader Celsius. Etter sentrifugering fjerner du forsiktig supernatanten ved å pipettering og legg den i et nytt 1,5 milliliter mikrocentrifugerør.Dette er atomfraksjonen. Homogenisere en halvkule av interesseområdet som før, bortsett fra å bruke 500 mikroliter TEVP-buffer i stedet for lysisbuffer. Bruk en 1000 mikroliter pipette, overfør den homogeniserte prøven til et nytt 1,5 milliliter mikrocentrifugerør.Sentrifuger prøven ved 1000 ganger g i 10 minutter ved fire grader Celsius. Samle supernatant og overføre den til en ny 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør ved hjelp av en 1000 mikroliter pipette. Sentrifuger prøven ved 10 000 ganger g i 10 minutter ved fire grader Celsius.Kast den originale pelleten som inneholder kjerner og det store avfallet. Overfør det overnaturante til et nytt 1,5 milliliter mikrocentrifugerør. Dette er den cytosoliske fraksjonen.Tilsett 50 mikroliter homogeniseringsbuffer til pelleten og gjenoppliv ved pipettering til ingen fast materiale er synlig. Sentrifuger prøven ved 20 000 ganger g i 10 minutter ved fire grader Celsius. Overfør det overnaturante til et nytt 1,5 milliliter mikrocentrifugerør.Dette er den rå synaptosomale membranfraksjonen. For å sette opp analysen, prewarm plateleseren til 37 grader Celsius og hold gjennom løpet. Sett eksitasjonen til 360 nanometer og utslipp til 460 nanometer.Hvis den 96 brønnplaten som brukes er klar, setter du optikkposisjonen til bunns. Hvis en mørk 96 brønnplate brukes, sett optikkposisjonen til toppen. Programmer en kinetisk kjøring med en tid på to timer skanning hvert 30.Rekonstituer 20S 10X analysebufferen som følger med settet med 13,5 milliliter ultrarent vann. Legg til 14 mikroliter på 100 millimolar ATP i den nå 1X-bufferen. Dette forbedrer betydelig proteasom aktivitet i prøvene og forbedrer analysens pålitelighet.Rekonstituer AMC-standarden som følger med settet med 100 mikroliter DMSO. Utfør trinn ved hjelp av AMC-standarden i mørket eller under dårlige lysforhold, da standarden er lysfølsom. Lag en standardkurve av AMC fra en serie med høye til lave AMC-konsentrasjoner.Denne kurven vil bli brukt til plateleserkalibrering og analyse av proteasom aktivitet i de homogeniserte prøvene. Rekonstituer proteasomt subtratet som følger med settet med 65 mikroliter DMSO. Utfør også dette trinnet i mørket eller under dårlige lysforhold, da underlaget er lysfølsomt.Deretter oppretter du en en til 20 fortynning av proteasomsubstratet i et nytt 1,5 milliliter mikrocentrifugerør ved hjelp av 20S-analysebufferen. Legg til en normalisert mengde av de ønskede prøvene til en 96 brønnplate. Kjør hvert eksempel i duplikat.Mengden prøve som trengs varierer basert på vevsforberedelse. Vanligvis er 10 til 20 mikrogram tilstrekkelig for enhver subcellulær fraksjon. Ta prøven godt volum til 80 mikroliter med ultrapure vann.Beløpet som legges til, avhenger av volumet av prøven som er lagt til. I to separate brønner, tilsett 80 mikroliter vann alene. Dette vil være analysen blanks.Legg til 10 mikroliter med 20S-analysebuffer til hver brønn, inkludert analysetommer. Bruk en repeater eller automatisert pipette for å sikre konsistent analysevolum på tvers av brønnene. Slå av lysene eller gå inn i et mørkt rom.Legg til alle 100 mikroliter med fortynnede AMC-standarder til en ny brønn ved hjelp av en enkelt brønn for hver standard. I mørket bruker du en repeater eller automatisert pipette til å legge til 10 mikroliter fortynnet proteasomsubstrat til brønner som inneholder prøve- og analysetommer, men ikke AMC-standarden. Plasser platen i plateleseren og start den kinetiske kjøringen.Utfør kvantifisering av ulike polyubiquitin-koder i forskjellige subcellulære fraksjoner samlet inn fra gnagerhjernevev ved hjelp av en rekke standard vestlige blottingprotokoller i kombinasjon med unike linkage-spesifikke polyubiquitin antistoffer. Noen ubiquitin vestlige blot bilder vil gi kolonner av distinkte band mens andre produserer smøre-lignende mønster med få eller ingen klare linjer. For kvantifisering av avbildet ubiquitin vestlige flekker, tegne en boks rundt kolonnen som utvider hele molekylære standarder stigen.Juster boksen hvis ubiquitin farging strekker seg gjennom hele stigen. Dette er vanlig for lysin 48 modifikasjoner og varierer mye på tvers av subcellulære rom. Til slutt trekker du fra bakgrunnen som beregnes som den gjennomsnittlige optiske tettheten av bakgrunnen umiddelbart rundt kolonnen på alle sider.Vist her er kvantifiseringen av proteasom aktivitet i forskjellige fraksjoner samlet fra lateral amygdala av samme dyr. Under in vitro proteasom aktivitetsanalysen økte relative fluorescerende enheter fra begynnelsen til slutten av analysen i den synaptiske fraksjonen, den cytoplasmatiske fraksjonen og atomfraksjonen. Proteasomhemmeren beta-lac forhindret RFUer fra å endre seg over økten.Subcellulære forskjeller ble observert i proteasom aktivitet i lateral amygdala av samme dyr. En økning i kjernefysisk proteasom aktivitet ble oppdaget hos trente dyr i forhold til kontroller som tilsvarte en reduksjon i aktiviteten innenfor den synaptiske fraksjonen. Cytoplasmatisk proteasom aktivitet forble ved baseline.Vist her er subcellulære forskjeller i koblingsspesifikt proteinubiquitination i lateral amygdala av samme dyr etter læring. Det var en økning i total ubiquitination i kjernefysisk fraksjon etter læring som korrelerte med en nedgang i cytoplasmatisk fraksjon. Etter læring økte lineær ubiquitination i kjernefysisk fraksjon, men ikke cytoplasmatiske eller synaptiske fraksjoner.Interessant nok økte K63 ubiquitination i atomfraksjonen etter læring som korrelerte med en reduksjon i den synaptiske fraksjonen. Mens K48 uniquitination økte i kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner etter læring, men ikke i den synaptiske fraksjonen. Denne protokollen kan også brukes til å forstå den subcellulære fordelingen og funksjonen til andre proteiner i samme dyr.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Neuroscience

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Direkte Intraventrikulær Levering av legemidler til gnager Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo optogenetic Stimulering av gnagere sentralnervesystemet

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase aktivitet i de ulike regionene i Mouse Brain: ikke-radioaktive Telomerase Gjenta Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Samtidig Elektro Opptak og Micro-injeksjoner av hemmende midler i gnager Brain

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

Personlig pinner for Microinjections i gnager hjernen

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Evaluering av Synapse tetthet i hippocampus gnager hjernen skiver

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Opptak og modulering Epileptiform aktivitet i gnager hjernen skiver koplet til Microelectrode matriser

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Effekter av Blast-indusert Biografiske filmer på trykksatt gnager midt Cerebral arterier

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...