Name: quantifying subcellular ubiquitin-proteasome activity in the rodent brain
Uploaded: 2019-05-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por fundos de arranque da faculdade de ciências agrícolas e da vida e do colégio de Ciências da Virginia Tech. o TM é apoiado pelo programa George Washington Carver na Virginia Tech.

Todos os procedimentos, incluindo os sujeitos animais, foram aprovados pelo Instituto Politécnico da Virgínia e pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade Estadual (IACUC).
1. coleta e dissecção do tecido cerebral de roedores
Nota: Este protocolo pode ser aplicado a uma variedade de regiões do cérebro e usado com vários procedimentos da coleção do tecido. Abaixo está o procedimento utilizado em nosso laboratório...

<ol>
	<li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+system.">The ubiquitin system.</a> Annu Rev Biochem. 67, 425-479 (1998).</li><li>Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+chain+diversity+at+a+glance.">Ubiquitin chain diversity at a glance.</a> Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).</li><li>Ravid, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+degradation+signals+in+the+ubiquitin-proteasome+system.">Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (9), 679-690 (2008).</li><li>Erpapazoglou, Z., Walker, O., Haguenauer-Tsapis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+roles+of+k63-linked+ubiquitin+chains+in+trafficking.">Versatile roles of k63-linked ubiquitin chains in trafficking.</a> Cells. 3 (4), 1027-1088 (2014).</li><li>Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+ubiquitin+chains:+NF-kappaB+signalling,+cell+death+and+beyond.">Linear ubiquitin chains: NF-kappaB signalling, cell death and beyond.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 15 (8), 503-508 (2014).</li><li>Rieser, E., Cordier, S. M., Walczak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+ubiquitination:+a+newly+discovered+regulator+of+cell+signalling.">Linear ubiquitination: a newly discovered regulator of cell signalling.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (2), 94-102 (2013).</li><li>Collins, G. A., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Logic+of+the+26S+Proteasome.">The Logic of the 26S Proteasome.</a> Cell. 169 (5), 792-806 (2017).</li><li>Bhat, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+19S+proteasome+ATPase+Sug1+plays+a+critical+role+in+regulating+MHC+class+II+transcription.">The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription.</a> Molecular Immunology. 45 (8), 2214-2224 (2008).</li><li>Ezhkova, E., Tansey, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasomal+ATPases+link+ubiquitylation+of+histone+H2B+to+methylation+of+histone+H3.">Proteasomal ATPases link ubiquitylation of histone H2B to methylation of histone H3.</a> Molecular Cell. 13 (3), 435-442 (2004).</li><li>Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+system+as+a+critical+regulator+of+synaptic+plasticity+and+long-term+memory+formation.">The ubiquitin-proteasome system as a critical regulator of synaptic plasticity and long-term memory formation.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 105, 107-116 (2013).</li><li>Hegde, A. N., Upadhya, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+pathway+in+health+and+disease+of+the+nervous+system.">The ubiquitin-proteasome pathway in health and disease of the nervous system.</a> Trends in Neuroscience. 30 (11), 587-595 (2007).</li><li>Adori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+distribution+of+components+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+non-diseased+human+and+rat+brain.">Subcellular distribution of components of the ubiquitin-proteasome system in non-diseased human and rat brain.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54 (2), 263-267 (2006).</li><li>Upadhya, S. C., Ding, L., Smith, T. K., Hegde, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+proteasome+activity+in+the+nucleus+and+the+synaptic+terminals.">Differential regulation of proteasome activity in the nucleus and the synaptic terminals.</a> Neurochemistry International. 48 (4), 296-305 (2006).</li><li>Enenkel, C., Lehmann, A., Kloetzel, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+distribution+of+proteasomes+implicates+a+major+location+of+protein+degradation+in+the+nuclear+envelope-ER+network+in+yeast.">Subcellular distribution of proteasomes implicates a major location of protein degradation in the nuclear envelope-ER network in yeast.</a> EMBO Journal. 17 (21), 6144-6154 (1998).</li><li>Jarome, T. J., Kwapis, J. L., Ruenzel, W. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII,+but+not+protein+kinase+A,+regulates+Rpt6+phosphorylation+and+proteasome+activity+during+the+formation+of+long-term+memories.">CaMKII, but not protein kinase A, regulates Rpt6 phosphorylation and proteasome activity during the formation of long-term memories.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 7, 115 (2013).</li><li>Jarome, T. J., Werner, C. T., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+dependent+protein+degradation+is+critical+for+the+formation+and+stability+of+fear+memory+in+the+amygdala.">Activity dependent protein degradation is critical for the formation and stability of fear memory in the amygdala.</a> PLoS One. 6 (9), e24349 (2011).</li><li>Lopez-Salon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+cascade+is+required+for+mammalian+long-term+memory+formation.">The ubiquitin-proteasome cascade is required for mammalian long-term memory formation.</a> European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1820-1826 (2001).</li><li>Reis, D. S., Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+formation+for+trace+fear+conditioning+requires+ubiquitin-proteasome+mediated+protein+degradation+in+the+prefrontal+cortex.">Memory formation for trace fear conditioning requires ubiquitin-proteasome mediated protein degradation in the prefrontal cortex.</a> Frontiers in Behavior Neuroscience. 7, 150 (2013).</li><li>Rosenberg, T., Elkobi, A., Rosenblum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mAChR-dependent+decrease+in+proteasome+activity+in+the+gustatory+cortex+is+necessary+for+novel+taste+learning.">mAChR-dependent decrease in proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for novel taste learning.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 135, 115-124 (2016).</li><li>Rosenberg, T., Elkobi, A., Dieterich, D. C., Rosenblum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDAR-dependent+proteasome+activity+in+the+gustatory+cortex+is+necessary+for+conditioned+taste+aversion.">NMDAR-dependent proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for conditioned taste aversion.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 130, 7-16 (2016).</li><li>Orsi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+subcellular+changes+in+proteasome+activity+and+linkage-specific+protein+polyubiquitination+in+the+amygdala+during+the+consolidation+and+reconsolidation+of+a+fear+memory.">Distinct subcellular changes in proteasome activity and linkage-specific protein polyubiquitination in the amygdala during the consolidation and reconsolidation of a fear memory.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 157, 1-11 (2019).</li><li>Cullen, P. K., Ferrara, N. C., Pullins, S. E., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context+memory+formation+requires+activity-dependent+protein+degradation+in+the+hippocampus.">Context memory formation requires activity-dependent protein degradation in the hippocampus.</a> Learning and Memory. 24 (11), 589-596 (2017).</li><li>Jarome, T. J., Ferrara, N. C., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII+regulates+proteasome+phosphorylation+and+activity+and+promotes+memory+destabilization+following+retrieval.">CaMKII regulates proteasome phosphorylation and activity and promotes memory destabilization following retrieval.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 128, 103-109 (2016).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+protein+degradation+underlies+destabilization+of+retrieved+fear+memory.">Synaptic protein degradation underlies destabilization of retrieved fear memory.</a> Science. 319 (5867), 1253-1256 (2008).</li><li>Dunah, A. W., Standaert, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D1+receptor-dependent+trafficking+of+striatal+NMDA+glutamate+receptors+to+the+postsynaptic+membrane.">Dopamine D1 receptor-dependent trafficking of striatal NMDA glutamate receptors to the postsynaptic membrane.</a> Journal of Neuroscience. 21 (15), 5546-5558 (2001).</li><li>Kelly, P. T., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+proteins.+Characterization+of+tubulin+and+actin+and+identification+of+a+distinct+postsynaptic+density+polypeptide.">Synaptic proteins. Characterization of tubulin and actin and identification of a distinct postsynaptic density polypeptide.</a> Journal of Cell Biology. 79 (1), 173-183 (1978).</li><li>Mengual, E., Arizti, P., Rodrigo, J., Gimenez-Amaya, J. M., Castano, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+distribution+and+electron+microscopic+subcellular+localization+of+the+proteasome+in+the+rat+CNS.">Immunohistochemical distribution and electron microscopic subcellular localization of the proteasome in the rat CNS.</a> Journal of Neuroscience. 16 (20), 6331-6341 (1996).</li></ol>

Aqui, Nós demonstramos um método eficiente para quantificar mudanças na atividade do ubiquitin-proteasome através dos compartimentos subcellular diferentes no mesmo animal. Atualmente, a maioria das tentativas de medir as alterações subcelulares na atividade do sistema ubiquitina-proteasome tem se limitado a um único compartimento por amostra, resultando na necessidade de repetição de experimentos. Isso leva a custos significativos e perda de vida animal. Nosso protocolo alivia esse problema dividindo os hemisf?...

O sistema de ubiquitina-proteasome (UPS) é uma complexa rede de estruturas proteicas interconectadas e ligases que controla a degradação da maioria das proteínas de vida curta nas células1. Neste sistema, as proteínas são marcadas para a degradação ou outros processos/destinos celulares pelo pequeno modificador ubiquitina. Uma proteína alvo pode adquirir 1-7 modificações de ubiquitina, que podem se unir em um dos sete sítios de lisina (K) (K6, K11, K27, K29, K33, K48 e K63) ou o N-terminal metionina (M1; conhecido como linear) na ubiquitina anterior2. Algumas dessas tags de poliubiquitina são específicas da degradação (K48)3, enquanto outras são em grande parte independentes do processo de degradação da proteína (M1)4,5,6. Assim, o processo de ubiquitinação de proteínas é incrivelmente complexo e a capacidade de quantificar as alterações em uma tag de poliubiquitina específica é fundamental para finalmente entender o papel dessa modificação dada no funcionamento celular. Complicando ainda mais o estudo deste sistema, o proteasome, que é a estrutura catalítica do UPS7, ambos degrada proteínas, mas também pode estar envolvido em outros processos não proteolíticos8,9. Não surprisingly então, desde que sua descoberta inicial, atividade normal e aberrante do ubiquitin-proteasome foi implicada na formação a longo prazo da memória e em uma variedade de Estados da doença, incluindo muitos neurológicos, neurodegenerativas e psiquiátricas distúrbios10,11. Como resultado, os métodos que podem efetivamente e eficientemente quantificar a atividade da UPS no cérebro são essenciais para finalmente compreender como este sistema é desregulado nos Estados de doença e o eventual desenvolvimento de opções de tratamento visando ubiquitina e/ou funcionamento do Proteassoma.
Há um número de edições em quantificar a atividade do ubiquitin-proteasome no tecido de cérebro dos ratos e dos ratos, que são os sistemas modelo os mais comuns usados para estudar a função do UPS, incluindo 1) a diversidade de modificações do ubiquitin, e 2) distribuição e regulação diferencial da UPS funcionando em compartimentos subcelulares12,13,14. Por exemplo, muitas das primeiras manifestações da função de ubiquitina-Proteassoma no cérebro durante a formação da memória usaram lisados de células inteiras e indicaram aumentos dependentes do tempo em ambas as proteínas ubiquitinação e Proteassoma atividade15, 16 anos de , 17 anos de , 18 anos de , 19 anos de , 20. no entanto, descobrimos recentemente que a atividade ubiquitina-proteasome variou amplamente entre os compartimentos subcelulares em resposta à aprendizagem, com aumentos simultâneos em algumas regiões e diminui em outros, um padrão que difere significativamente do que foi relatado previamente em lysates inteiros da pilha21. Isso é consistente com a limitação de uma abordagem de célula inteira, pois não pode dissociar a contribuição de mudanças na atividade da UPS em diferentes compartimentos subcelulares. Embora estudos mais recentes tenham empregado protocolos de fração sináptica para estudar a UPS especificamente em sinapses em resposta à aprendizagem22,23,24, os métodos utilizados oclusam a capacidade de medir alterações de ubiquitina-proteasome nucleares e citoplasmáticas no mesmo animal. Isso resulta em uma necessidade desnecessária de repetir experimentos várias vezes, coletando uma fração subcelular diferente em cada um. Não só isso resulta em uma maior perda de vida animal, mas elimina a capacidade de comparar diretamente a atividade da UPS em diferentes compartimentos subcelulares em resposta a um determinado evento ou durante um estado de doença específica. Considerando que os alvos proteicos da ubiquitina e do Proteassoma variam amplamente em toda a célula, compreender como a sinalização de ubiquitina-Proteassoma difere em compartimentos subcelulares distintos é fundamental para identificar o papel funcional da UPS na cérebro durante a formação da memória e desordens neurológicas, neurodegenerativas e psiquiátricas.
Para abordar esta necessidade, nós desenvolvemos recentemente um procedimento em que as frações nucleares, cytoplasmic e sináptica poderiam ser coletadas para uma determinada região do cérebro do mesmo animal21. Adicionalmente, para dar conta da quantidade limitada de proteínas que podem ser obtidas a partir da coleta de múltiplas frações subcelulares da mesma amostra, otimizamos protocolos previamente estabelecidos para o ensaio de atividade Proteassoma in vitro e ligação específica ubiquitinação da proteína em pilhas lysed coletadas do tecido de cérebro do roedor. Utilizando este protocolo, pudemos coletar e comparar diretamente as mudanças dependentes da aprendizagem na atividade Proteassoma, K48, K63, M1 e níveis globais de poliubiquitinação protéica no núcleo e citoplasma e nas sinapses na amígdala lateral de ratos. Aqui, descrevemos detalhadamente nosso procedimento (Figura 1), o que pode melhorar significativamente nossa compreensão de como a UPS está envolvida na formação de memória de longo prazo e em vários Estados de doenças. Entretanto, deve-se notar que a atividade de Proteassoma in vitro discutida em nosso protocolo, embora amplamente utilizada, não mede diretamente a atividade de complexos completos de Proteassoma 26S. Em vez disso, este ensaio mede a atividade do núcleo 20s, o que significa que só pode servir como um proxy para entender a atividade do núcleo em si, em oposição ao complexo de todo o Proteassoma 26S.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:878px;" width="878">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">0.5M EDTA</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">15575020</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">20S Proteasome Activity Kit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>APT280</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">ATP</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">FERR1441</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Beta-actin antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>4967S</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Beta-tubulin antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>2128T</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BioTek Synergy H1 plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>VATECHH1MT3</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN19024280</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">clasto lactacystin b-lactone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L7035</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cryogenic cup</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>033377B</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMSO</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Varous other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">DTT</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">D0632</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Glycerol</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">G5516</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">H3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1791</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">HEPES</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">H3375</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SA48</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">IGEPAL (NP-40)</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">I3021</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">K48 Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab140601</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">K63 Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab179434</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">KCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">P9541</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KONTES tissue grinder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885300-0002</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laemmli sample buffer</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Linear Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Life Sensors</td>
			<td>AB-0130-0100</td>
			<td>Only M1 antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">MgCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">442611</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000213</td>
			<td>Various other manufacturers/models</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">myr-AIP</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-P212-0500</td>
			<td>Carried by Millipore-Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">NaCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">S3014</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Odyssey Fc Imaging System</td>
			<td>LiCor</td>
			<td>2800-02</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Phosphatase Inhibitor</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">524625</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Precision Plus Protein Standard</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>161-0373</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Protease Inhibitor</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">P8340</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PSD95 antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>3450T</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:222px;">SDS</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">L3771</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SS255</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:222px;">Sucrose</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">S0389</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">TBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62938</td>
			<td>Varous other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:50px;width:222px;">Tris</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">T1503</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;">Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;">Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-PW8810</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying subcellular ubiquitin-proteasome activity in the rodent brain

O sistema do ubiquitin-proteasome é um regulador chave da degradação da proteína e de uma variedade de outros processos celulares nos eukaryotes. No cérebro, aumentos na atividade de ubiquitina-proteasome são críticos para a formação de plasticidade sináptica e memória e alterações aberrantes neste sistema estão associados a uma variedade de distúrbios neurológicos, neurodegenerativos e psiquiátricos. Um dos problemas no estudo do funcionamento do ubiquitina-proteasome no cérebro é que ele está presente em todos os compartimentos celulares, nos quais as metas proteicas, o papel funcional e os mecanismos de regulação podem variar muito. Como resultado, a capacidade de comparar diretamente a segmentação de proteínas de ubiquitina cerebral e a atividade catalítica de Proteassoma em diferentes compartimentos subcelulares dentro do mesmo animal é fundamental para compreender plenamente como a UPS contribui para a plasticidade sináptica, memória e doença. O método descrito aqui permite a coleta de frações sinápticas nucleares, citoplasmáticas e brutas do mesmo cérebro de roedores (Rat), seguidas pela quantificação simultânea da atividade catalítica do Proteassoma (indiretamente, proporcionando atividade do núcleo Proteassoma apenas) e marcação de proteínas de ubiquitina específica de ligação. Assim, o método pode ser usado para comparar diretamente as mudanças subcelulares na atividade do ubiquitin-proteasome em regiões diferentes do cérebro no mesmo animal durante a plasticidade sináptica, a formação da memória e Estados diferentes da doença. Este método também pode ser utilizado para avaliar a distribuição subcelular e a função de outras proteínas dentro do mesmo animal.

Usando o procedimento descrito aqui, frações nucleares, citoplasmáticas e sinápticas foram coletadas da amígdala lateral do cérebro de rato (Figura 1). A pureza das frações individuais foi confirmada via Western blotting, sondagem com anticorpos contra proteínas que devem ser enriquecidas ou esgotadas no lisado. No primeiro hemisfério onde foi coletada uma fração sináptica bruta, a proteína de densidade pós-sináptica 95 (PSD95) estava presente...

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Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain

Este protocolo é projetado para quantificar eficientemente a atividade do sistema de ubiquitina-proteasome (UPS) em diferentes compartimentos celulares do cérebro de roedores. Os usuários podem examinar o funcionamento da UPS em frações nucleares, citoplasmáticas e sinápticas no mesmo animal, reduzindo a quantidade de tempo e o número de animais necessários para realizar essas análises complexas.

Quantificando a ubiquitina subcelular-atividade de proteasome no cérebro de roedores

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases ...

Este protocolo mede os níveis de ubiquização de proteínas subcelulares e a atividade proteasome no cérebro dos roedores, permitindo que, entre os sujeitos, comparações de como a atividade ubiquitina-proteasome muda em resposta à atividade celular, aprendizagem ou doença. O protocolo permite a coleta de frações sinápticas, citoplasmáticas e nucleares do mesmo cérebro de roedores. Minimizando a perda, poderia ser realizada com pequenas quantidades de tecido e equipamentos básicos de laboratório.Demonstrando o procedimento será Taylor McFadden, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório. Inicie este procedimento com coleta e dissecção do tecido cerebral de roedores conforme descrito no protocolo de texto. Certifique-se de que o hemisfério utilizado seja contra-equilibrado em todas as condições de extração para cada grupo experimental.Remova o microtubo centrífugas de 1,5 mililitro contendo um hemisfério da região de interesse do congelador de menos 80 graus Celsius. Usando um bisturi, transfira o tecido cerebral congelado para um homogeneizador de teflon de vidro de dois mililitros. Adicione 500 microliters de tampão de lise ao tubo de Teflon.Utilizando pilão B, homogeneize o mesmo tecido com 15 derrames até que não haja quantidade visível de material sólido. Use um movimento de giro durante cada golpe. Com uma pipeta de 1.000 microliter, transfira a amostra homogeneizada para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Coloque o tubo no gelo molhado e incubar por 30 minutos. Coloque o tubo no microcentrifuuge e gire por 10 minutos a 845 vezes g em quatro graus Celsius. Após a conclusão, remova cuidadosamente o supernatante por pipetação e coloque em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Esta é a fração citoplasmática. Adicione 50 microliters de tampão de extração à pelota resultante e resuspend por pipetação. Não vórtice a pelota.Coloque o tubo contendo a pelota resuspended no gelo e incubar por 30 minutos. Em seguida, centrifugar o tubo por 20 minutos a 21.456 vezes g em quatro graus Celsius. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o supernatante por pipetação e coloque em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Esta é a fração nuclear. Homogeneize um hemisfério da região de interesse como antes, exceto para usar 500 microliters de tampão TEVP em vez de tampão de lise. Usando uma pipeta de 1.000 microliter, transfira a amostra homogeneizada para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Centrifugar a amostra a 1.000 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Colete o supernascer e transfira-o para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro usando uma pipeta de 1.000 microliter. Centrifugar a amostra a 10.000 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius.Descarte a pelota original que contém núcleos e os grandes detritos. Transfira o supernatante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Esta é a fração citosórica.Adicione 50 microliters de tampão de homogeneização à pelota e resuspend por pipetação até que nenhum material sólido seja visível. Centrifugar a amostra a 20.000 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Transfira o supernatante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Esta é a fração de membrana sinaptosômica bruta. Para configurar o ensaio, pré-aquecimento o leitor de placas a 37 graus Celsius e segurar durante a corrida. Defina a excitação para 360 nanômetros e emissão para 460 nanômetros.Se a placa 96 bem utilizada estiver clara, ajuste a posição óptica para baixo. Se uma placa escura de 96 poços for usada, ajuste a posição óptica para cima. Programe uma corrida cinética com um tempo de duas horas de varredura a cada 30 minutos.Reconstitua o tampão de ensaio 20S 10X fornecido no kit com 13,5 mililitros de água ultrapura. Adicione 14 microliters de 100 mililitros ATP ao agora 1X buffer. Isso melhora significativamente a atividade proteasome nas amostras e melhora a confiabilidade do ensaio.Reconstitua o padrão AMC fornecido no kit com 100 microliters de DMSO. Execute etapas usando o padrão AMC no escuro ou sob condições de baixa luz, pois o padrão é sensível à luz. Crie uma curva padrão de AMC a partir de uma série de concentrações altas a baixas de AMC.Esta curva será utilizada para calibração do leitor de placas e análise da atividade proteasome nas amostras homogeneizadas. Reconstitua o subtrato proteasome fornecido no kit com 65 microliters de DMSO. Também realize esta etapa no escuro ou sob condições de baixa luz, pois o substrato é sensível à luz.Em seguida, crie uma diluição de 1 a 20 do substrato proteasome em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro usando tampão de ensaio 20S. Adicione uma quantidade normalizada das amostras desejadas a uma placa de 96 poços. Execute cada amostra em duplicata.A quantidade de amostra necessária varia de acordo com a preparação do tecido. Geralmente, 10 a 20 microgramas são suficientes para qualquer fração subcelular. Leve o volume do poço da amostra para 80 microliters com água ultrapura.A quantidade adicionada depende do volume da amostra adicionada. Em dois poços separados, adicione 80 microliters de água sozinho. Estes serão os ensaios em branco.Adicione 10 microliters de tampão de ensaio 20S a cada poço, incluindo os espaços em branco de ensaio. Use uma pipeta repetidor ou automatizada para garantir um volume de ensaio consistente nos poços. Desligue as luzes ou entre em uma sala escura.Adicione todos os 100 microliters de padrões AMC diluídos a um novo poço usando um único poço para cada padrão. No escuro, use uma pipeta repetidor ou automatizada para adicionar 10 microliters de substrato proteasome diluído a poços contendo amostras e ensaios em branco, mas não o padrão AMC. Coloque a placa no leitor de placas e inicie a corrida cinética.Realize a quantificação de diversas etiquetas de poliubiquitina em diferentes frações subcelulares coletadas do tecido cerebral de roedores usando uma variedade de protocolos de manchas ocidentais padrão em combinação com anticorpos de poliudicequitina específicos de ligação única. Algumas imagens de manchas ocidentais fornecerão colunas de bandas distintas, enquanto outras produzem padrão semelhante a manchas com poucas ou nenhuma linha clara. Para quantificação de manchas ocidentais de ubiquitina imagem, desenhe uma caixa ao redor da coluna que estende toda a escada de padrões moleculares.Ajuste a caixa se a coloração da ubiquitina se estender por toda a escada. Isso é comum para modificações de lysina 48 e varia amplamente entre compartimentos subcelulares. Finalmente, subtraia o fundo que é calculado como a densidade óptica média do fundo imediatamente em torno da coluna em todos os lados.Aqui mostrada a quantificação da atividade proteasome em diferentes frações coletadas da amígdala lateral do mesmo animal. Durante o ensaio de atividade proteasome in vitro, unidades fluorescentes relativas detectadas aumentaram do início ao fim do ensaio na fração sináptica, na fração citoplasmática e na fração nuclear. O inibidor proteasome beta-lac impediu que as RFUs mudassem ao longo da sessão.Diferenças subcelulares foram observadas na atividade proteasome na amígdala lateral do mesmo animal. Foi detectado um aumento da atividade proteasome nuclear em animais treinados em relação aos controles que corresponderam a uma diminuição da atividade dentro da fração sináptica. A atividade proteasome citoplasmática permaneceu na linha de base.Aqui são mostradas diferenças subcelulares na ubiquitina proteica específica da ligação na amígdala lateral do mesmo animal após o aprendizado. Houve um aumento da ubiquitina geral na fração nuclear após o aprendizado que se correlacionava com uma diminuição da fração citoplasmática. Após o aprendizado, a ubiquitina linear aumentou na fração nuclear, mas não frações citoplasmáticas ou sinápticas.Curiosamente, a ubiquização K63 aumentou na fração nuclear após o aprendizado que se correlacionava com uma diminuição da fração sináptica. Considerando que a uniquitina K48 aumentou nas frações nucleares e citoplasmáticas após o aprendizado, mas não na fração sináptica. Este protocolo também pode ser usado para entender a distribuição subcelular e função de outras proteínas dentro do mesmo animal.

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Translation: RNA to Protein

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Neurociência

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

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Entrega intraventricular direta de medicamentos para o Sistema Nervoso Central Rodent

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Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

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A atividade da telomerase nas diversas regiões de cérebro de camundongo: A telomerase não-radioativo Repetir Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Gravação simultânea eletrofisiológica e micro-injeções de agentes inibidores no cérebro do roedor

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

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Avaliação da densidade de sinapse em fatias Hippocampal cérebro de roedor

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

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Gravação e modulação da atividade epileptiforme em fatias de cérebro de roedor acoplado para matrizes de microeletrodos

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Efeitos de Neurotrauma induzida por explosão em roedores pressurizado artérias cerebrais de médio

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