Name: quantifying subcellular ubiquitin-proteasome activity in the rodent brain
Uploaded: 2019-05-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain at JoVE.com

Эта работа была поддержана стартап средств из колледжа сельскохозяйственных и наук о жизни и колледж науки в Вирджинии Tech. T.M. поддерживается Джордж Вашингтон Карвер программы в Вирджинии Tech.

Все процедуры, включая животных субъектов были одобрены Политехнический институт Вирджинии и Государственного университета институционального ухода за животными и использования комитета (IACUC).
1. Сбор и вскрытие тканей грызунов мозга
ПРИМЕЧАНИЕ: ...

<ol>
	<li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+system.">The ubiquitin system.</a> Annu Rev Biochem. 67, 425-479 (1998).</li><li>Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+chain+diversity+at+a+glance.">Ubiquitin chain diversity at a glance.</a> Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).</li><li>Ravid, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+degradation+signals+in+the+ubiquitin-proteasome+system.">Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (9), 679-690 (2008).</li><li>Erpapazoglou, Z., Walker, O., Haguenauer-Tsapis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+roles+of+k63-linked+ubiquitin+chains+in+trafficking.">Versatile roles of k63-linked ubiquitin chains in trafficking.</a> Cells. 3 (4), 1027-1088 (2014).</li><li>Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+ubiquitin+chains:+NF-kappaB+signalling,+cell+death+and+beyond.">Linear ubiquitin chains: NF-kappaB signalling, cell death and beyond.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 15 (8), 503-508 (2014).</li><li>Rieser, E., Cordier, S. M., Walczak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+ubiquitination:+a+newly+discovered+regulator+of+cell+signalling.">Linear ubiquitination: a newly discovered regulator of cell signalling.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (2), 94-102 (2013).</li><li>Collins, G. A., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Logic+of+the+26S+Proteasome.">The Logic of the 26S Proteasome.</a> Cell. 169 (5), 792-806 (2017).</li><li>Bhat, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+19S+proteasome+ATPase+Sug1+plays+a+critical+role+in+regulating+MHC+class+II+transcription.">The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription.</a> Molecular Immunology. 45 (8), 2214-2224 (2008).</li><li>Ezhkova, E., Tansey, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasomal+ATPases+link+ubiquitylation+of+histone+H2B+to+methylation+of+histone+H3.">Proteasomal ATPases link ubiquitylation of histone H2B to methylation of histone H3.</a> Molecular Cell. 13 (3), 435-442 (2004).</li><li>Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+system+as+a+critical+regulator+of+synaptic+plasticity+and+long-term+memory+formation.">The ubiquitin-proteasome system as a critical regulator of synaptic plasticity and long-term memory formation.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 105, 107-116 (2013).</li><li>Hegde, A. N., Upadhya, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+pathway+in+health+and+disease+of+the+nervous+system.">The ubiquitin-proteasome pathway in health and disease of the nervous system.</a> Trends in Neuroscience. 30 (11), 587-595 (2007).</li><li>Adori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+distribution+of+components+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+non-diseased+human+and+rat+brain.">Subcellular distribution of components of the ubiquitin-proteasome system in non-diseased human and rat brain.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54 (2), 263-267 (2006).</li><li>Upadhya, S. C., Ding, L., Smith, T. K., Hegde, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+proteasome+activity+in+the+nucleus+and+the+synaptic+terminals.">Differential regulation of proteasome activity in the nucleus and the synaptic terminals.</a> Neurochemistry International. 48 (4), 296-305 (2006).</li><li>Enenkel, C., Lehmann, A., Kloetzel, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+distribution+of+proteasomes+implicates+a+major+location+of+protein+degradation+in+the+nuclear+envelope-ER+network+in+yeast.">Subcellular distribution of proteasomes implicates a major location of protein degradation in the nuclear envelope-ER network in yeast.</a> EMBO Journal. 17 (21), 6144-6154 (1998).</li><li>Jarome, T. J., Kwapis, J. L., Ruenzel, W. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII,+but+not+protein+kinase+A,+regulates+Rpt6+phosphorylation+and+proteasome+activity+during+the+formation+of+long-term+memories.">CaMKII, but not protein kinase A, regulates Rpt6 phosphorylation and proteasome activity during the formation of long-term memories.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 7, 115 (2013).</li><li>Jarome, T. J., Werner, C. T., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+dependent+protein+degradation+is+critical+for+the+formation+and+stability+of+fear+memory+in+the+amygdala.">Activity dependent protein degradation is critical for the formation and stability of fear memory in the amygdala.</a> PLoS One. 6 (9), e24349 (2011).</li><li>Lopez-Salon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+cascade+is+required+for+mammalian+long-term+memory+formation.">The ubiquitin-proteasome cascade is required for mammalian long-term memory formation.</a> European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1820-1826 (2001).</li><li>Reis, D. S., Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+formation+for+trace+fear+conditioning+requires+ubiquitin-proteasome+mediated+protein+degradation+in+the+prefrontal+cortex.">Memory formation for trace fear conditioning requires ubiquitin-proteasome mediated protein degradation in the prefrontal cortex.</a> Frontiers in Behavior Neuroscience. 7, 150 (2013).</li><li>Rosenberg, T., Elkobi, A., Rosenblum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mAChR-dependent+decrease+in+proteasome+activity+in+the+gustatory+cortex+is+necessary+for+novel+taste+learning.">mAChR-dependent decrease in proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for novel taste learning.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 135, 115-124 (2016).</li><li>Rosenberg, T., Elkobi, A., Dieterich, D. C., Rosenblum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDAR-dependent+proteasome+activity+in+the+gustatory+cortex+is+necessary+for+conditioned+taste+aversion.">NMDAR-dependent proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for conditioned taste aversion.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 130, 7-16 (2016).</li><li>Orsi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+subcellular+changes+in+proteasome+activity+and+linkage-specific+protein+polyubiquitination+in+the+amygdala+during+the+consolidation+and+reconsolidation+of+a+fear+memory.">Distinct subcellular changes in proteasome activity and linkage-specific protein polyubiquitination in the amygdala during the consolidation and reconsolidation of a fear memory.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 157, 1-11 (2019).</li><li>Cullen, P. K., Ferrara, N. C., Pullins, S. E., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context+memory+formation+requires+activity-dependent+protein+degradation+in+the+hippocampus.">Context memory formation requires activity-dependent protein degradation in the hippocampus.</a> Learning and Memory. 24 (11), 589-596 (2017).</li><li>Jarome, T. J., Ferrara, N. C., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII+regulates+proteasome+phosphorylation+and+activity+and+promotes+memory+destabilization+following+retrieval.">CaMKII regulates proteasome phosphorylation and activity and promotes memory destabilization following retrieval.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 128, 103-109 (2016).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+protein+degradation+underlies+destabilization+of+retrieved+fear+memory.">Synaptic protein degradation underlies destabilization of retrieved fear memory.</a> Science. 319 (5867), 1253-1256 (2008).</li><li>Dunah, A. W., Standaert, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D1+receptor-dependent+trafficking+of+striatal+NMDA+glutamate+receptors+to+the+postsynaptic+membrane.">Dopamine D1 receptor-dependent trafficking of striatal NMDA glutamate receptors to the postsynaptic membrane.</a> Journal of Neuroscience. 21 (15), 5546-5558 (2001).</li><li>Kelly, P. T., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+proteins.+Characterization+of+tubulin+and+actin+and+identification+of+a+distinct+postsynaptic+density+polypeptide.">Synaptic proteins. Characterization of tubulin and actin and identification of a distinct postsynaptic density polypeptide.</a> Journal of Cell Biology. 79 (1), 173-183 (1978).</li><li>Mengual, E., Arizti, P., Rodrigo, J., Gimenez-Amaya, J. M., Castano, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+distribution+and+electron+microscopic+subcellular+localization+of+the+proteasome+in+the+rat+CNS.">Immunohistochemical distribution and electron microscopic subcellular localization of the proteasome in the rat CNS.</a> Journal of Neuroscience. 16 (20), 6331-6341 (1996).</li></ol>

Здесь мы демонстрируем эффективный метод количественной оценки изменений в активности убиквитин-протеасомы в различных субклеточных отсеках одного и того же животного. В настоящее время большинство попыток измерения субклеточных изменений в активности системы убиквитин-протеасомы...

Система убиквитин-протеасомы (UPS) представляет собой сложную сеть взаимосвязанных белковых структур илигазов, которая контролирует деградацию большинства недолговечных белков в клетках 1. В этой системе, белки помечены для деградации или других клеточных процессов / судьбы небольшой модификатор убиквитин. Целевой белок может приобрести 1-7 модификаций убиквитина, которые могут соединяться на одном из семи лизиновых (K) участков (K6, K11, K27, K29, K33, K48 и K63) или N-терминалметионина (M1; как известно, линейный) в предыдущем ubiquitin2. Некоторые из этих полиубиквитина теги деградации конкретных (K48)3, в то время как другие в значительной степени независимы от процесса деградации белка (M1)4,5,6. Таким образом, процесс убликвитирования белка невероятно сложен, и способность к количественной оценке изменений в определенном теге полиубиквитин имеет решающее значение для понимания роли данной модификации в клеточной работе. Дальнейшее осложняет изучение этой системы, протеасома, который является каталитической структурой UPS7, как ухудшает белки, но также может быть вовлечен в другие непротеолитические процессы8,9. Не удивительно, что с момента своего первого открытия, нормальная и аномачная убиквитин-протеасомная активность была вовлечена в долгосрочное формирование памяти и различные состояния заболеваний, в том числе многие неврологические, нейродегенеративные и психиатрические расстройства10,11. В результате, методы, которые могут эффективно и эффективно количественно UPS деятельности в головном мозге имеют решающее значение для в конечном итоге понимание того, как эта система дисрегулируется в состоянии болезни и в конечном итоге разработка вариантов лечения ориентации убиквитин и / или протеасомы функционирования.
Существует ряд проблем в количественной оценке убиквитина-протеасомы активности в тканях мозга от крыс и мышей, которые являются наиболее распространенными модельными системами, используемыми для изучения функции ИБП, в ключая 1) разнообразие модификаций убиквитина, и 2) распределение и 2) дифференциальная регуляция ИПС, функционирующих между субклеточными отсеками12,13,14. Например, многие из ранних демонстраций убиквитина-протеасомы функции в головном мозге во время формирования памяти использовали целые клеточные лисаты и указали на временное увеличение как убиквитинации белка, так и протеасомной активности15, 16 Год , 17 Лет , 18 лет , 19 лет , 20. Однако, однако, мы недавно обнаружили, что убликвитин-протеасом активность сильно различается по субклеточным отсекам в ответ на обучение, с одновременным увеличением в некоторых регионах и уменьшается в других, картина, которая значительно отличается от того, что ранее сообщалось в целых клеточных лисатов21. Это согласуется с ограничением целого клеточного подхода, поскольку он не может разъединять вклад изменений в активность ИПС в различных субклеточных отсеках. Хотя более поздние исследования использовали синаптические протоколы фракции для изучения ИПС специально в синапсах в ответ на обучение22,23,24, методы, используемые окклюзии способность измерять ядерные и цитоплазмические убиквитин-протеаомы изменения в том же животном. Это приводит к ненужной необходимости повторять эксперименты несколько раз, собирая различные субклеточные фракции в каждом. Это не только приводит к большей гибели животных, но и устраняет возможность непосредственно сравнивать активность ИБП в различных субклеточных отсеках в ответ на данное событие или во время определенного состояния заболевания. Учитывая, что белковые мишени убиквитина и протеамы сильно различаются по всей клетке, понимание того, как дибиквитин-протеасомы сигнализации отличается в различных субклеточных отсеков имеет решающее значение для определения функциональной роли ИБП в мозга при формировании памяти и неврологических, нейродегенеративных и психических расстройств.
Для решения этой потребности, мы недавно разработали процедуру, в которой ядерные, цитоплазмические и синаптические фракции могут быть собраны для данной области мозга от того же животного21. Кроме того, для учета ограниченного количества белка, который может быть получен от сбора нескольких субклеточных фракций из одного и того же образца, мы оптимизировали ранее установленные протоколы, чтобы прозаизировать активность протеасомы in vitro и специфическую связь убиквитинация белка в лисизированных клетках, собранных из ткани мозга грызунов. Используя этот протокол, мы смогли собрать и напрямую сравнить обучающие-зависимые изменения в протеасомой активности, K48, K63, M1 и общих уровнях полиубиквитина в ядре и цитоплазме и на синапсах в боковой миндалине крыс. Здесь мы подробно описываем нашу процедуру (Рисунок1),которая может значительно улучшить наше понимание того, как ИБП участвует в формировании долгосрочной памяти и различных состояниях заболеваний. Тем не менее, следует отметить, что протеасомная активность in vitro, обсуждаемая в нашем протоколе, хотя и широко используется, не измеряет непосредственно активность полных 26S протеасомы комплексов. Скорее, этот ассс измеряет активность ядра 20S, то есть он может служить только в качестве прокси, чтобы понять деятельность самого ядра, в отличие от всего 26S протеасомы комплекса.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:878px;" width="878">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">0.5M EDTA</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">15575020</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">20S Proteasome Activity Kit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>APT280</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">ATP</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">FERR1441</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Beta-actin antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>4967S</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Beta-tubulin antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>2128T</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BioTek Synergy H1 plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>VATECHH1MT3</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN19024280</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">clasto lactacystin b-lactone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L7035</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cryogenic cup</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>033377B</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMSO</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Varous other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">DTT</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">D0632</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Glycerol</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">G5516</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">H3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1791</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">HEPES</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">H3375</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SA48</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">IGEPAL (NP-40)</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">I3021</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">K48 Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab140601</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">K63 Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab179434</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">KCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">P9541</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KONTES tissue grinder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885300-0002</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laemmli sample buffer</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Linear Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Life Sensors</td>
			<td>AB-0130-0100</td>
			<td>Only M1 antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">MgCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">442611</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000213</td>
			<td>Various other manufacturers/models</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">myr-AIP</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-P212-0500</td>
			<td>Carried by Millipore-Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">NaCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">S3014</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Odyssey Fc Imaging System</td>
			<td>LiCor</td>
			<td>2800-02</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Phosphatase Inhibitor</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">524625</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Precision Plus Protein Standard</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>161-0373</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Protease Inhibitor</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">P8340</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PSD95 antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>3450T</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:222px;">SDS</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">L3771</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SS255</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:222px;">Sucrose</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">S0389</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">TBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62938</td>
			<td>Varous other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:50px;width:222px;">Tris</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">T1503</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;">Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;">Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-PW8810</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying subcellular ubiquitin-proteasome activity in the rodent brain

Система убиквитин-протеасома является ключевым регулятором деградации белка и различных других клеточных процессов в эукариотах. В головном мозге, увеличение активности убиквитина-протеамы имеют решающее значение для синаптической пластичности и формирования памяти и аномальные изменения в этой системе связаны с различными неврологическими, нейродегенеративными и психическими расстройствами. Одна из проблем при изучении убиквитина-протеасомы функционирования в головном мозге является то, что он присутствует во всех клеточных отсеках, в которых белковые цели, функциональная роль и механизмы регулирования могут сильно различаться. В результате, способность непосредственно сравнивать мозг убиквитин белка ориентации и протеасомы каталитической активности в различных субклеточных отсеков в одном животном имеет решающее значение для полного понимания того, как ИБП способствует синаптической пластичности, памяти и болезней. Описанный здесь метод позволяет сбор ядерных, цитоплазмических и сырых синаптических фракций из одного и того же мозга грызунов (крысы), а затем одновременной количественной оценки протеасомного каталитической активности (косвенно, обеспечивая активность протеасомного ядра только) и связи конкретных убиквитин белка пометки. Таким образом, метод может быть использован для непосредственного сравнения субклеточных изменений в убиквитин-протеасомактивности в различных областях мозга в одном животном во время синаптической пластичности, формирования памяти и различных состояний заболеваний. Этот метод также может быть использован для оценки субклеточного распределения и функции других белков в пределах того же животного.

Используя описанную здесь процедуру, ядерные, цитоплазмические и синаптические фракции были собраны из боковой миндалины мозга крысы(рисунок 1). Чистота отдельных фракций была подтверждена с помощью западного blotting, зондирование с антителами против бе...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain at JoVE.com

Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain

Этот протокол предназначен для эффективной количественной оценки активности убиквитино-протеасомного системы (UPS) в различных клеточных отсеках мозга грызунов. Пользователи могут изучить иСП функционирования в ядерных, цитоплазмических и синаптических фракций в одном животном, уменьшая количество времени и количество животных, необходимых для выполнения этих сложных анализов.

Количественная подклеточная убиквитин-протеасомная активность в мозге грызунов

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases ...

Этот протокол измеряет субклеточный уровень убиквитина белка и протеасомную активность в мозге грызунов, позволяя в субъектах сравнивать изменения активности убиквитина-протеасомы в ответ на клеточную активность, обучение или болезнь. Протокол позволяет сбор синаптических, цитоплазмических и ядерных фракций из одного и того же мозга грызунов. Минимизируя потери, он может быть выполнен с небольшим количеством тканей и основным лабораторным оборудованием.Демонстрацией процедуры будет Тейлор Макфадден, аспирант моей лаборатории. Начните эту процедуру со сбора и вскрытия ткани мозга грызунов, как описано в текстовом протоколе. Убедитесь, что используемое полушарие сбалансировано по условиям извлечения для каждой экспериментальной группы.Удалите 1,5 миллилитровую центрифугу микротрубки, содержащую одно полушарие области интереса, из морозильной камеры минус 80 градусов по Цельсию. Используя скальпель, перенесите замороженную ткань мозга на двухми миллилитровый стеклянный тефлоновый гомогенизатор. Добавьте 500 микролитров буфера лиза в тефлоновую трубку.Используя пестик B, гомогенизировать ту же ткань с 15 ударов, пока не видимое количество твердого материала присутствует. Используйте поворот движения во время каждого удара. С помощью трубы с 1000 микролитров перенесите гомогенизированный образец в новую микроцентрифугную трубку диаметром 1,5 миллилитра.Поместите трубку на мокрый лед и инкубировать в течение 30 минут. Поместите трубку в микроцентрифуг и вращайся в течение 10 минут при 845 раз g при четырех градусах Цельсия. После завершения, тщательно удалить супернатант путем трубопроводов и поместить в новую 1,5 миллилитровую микроцентрифугную трубку.Это цитоплазмическая фракция. Добавьте 50 микролитров буфера извлечения в полученную гранулу и повторное добавление путем трубопроводов. Не вихрь гранулы.Поместите трубку, содержащую перерасход гранулы на льду и инкубировать в течение 30 минут. Затем центрифуга трубки в течение 20 минут при 21, 456 раз г в четыре градуса по Цельсию. После центрифугации, тщательно удалите супернатант путем пипетки и поместите в новую 1,5 миллилитровую микроцентрифугную трубку.Это ядерная фракция. Гомогенизировать одно полушарие области интересов, как и прежде, за исключением использования 500 микролитров буфера TEVP вместо буфера лиза. Используя трубу из 1000 микролитров, перенесите гомогенизированный образец в новую микроцентрифугную трубку диаметром 1,5 миллилитра.Центрифуга образца при 1000 раз г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Соберите супернатант и перенесите его в новую микроцентрифугную трубку диаметром 1,5 миллилитра с помощью трубы с 1000 микролитров. Центрифуга образца при 10 000 раз г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.Откажитесь от оригинальной гранулы, которая содержит ядра и большой мусор. Перенесите супернатант в новую микроцентрифугную трубку с 1,5 миллилитром. Это цитозолическая фракция.Добавьте 50 микролитров буфера гомогенизации в гранулы и повторно сметайте трубы до тех пор, пока не будет виден твердый материал. Центрифуга образца при 20 000 раз г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Перенесите супернатант в новую микроцентрифугную трубку с 1,5 миллилитром.Это сырая синаптосомная мембранная фракция. Чтобы настроить анализ, довоенной плиты читателя до 37 градусов по Цельсию и провести через перспективе. Установите возбуждение до 360 нанометров и выброс до 460 нанометров.Если используемая пластина 96 хорошо ясна, установите положение оптики на дно. Если используется темная пластина 96 хорошо, установите положение оптики к началу. Программа кинетического запуска со временем два часа сканирования каждые 30 минут.Восстановить 20S 10X анализ буфера, представленного в комплекте с 13,5 миллилитров ультрачистой воды. Добавьте 14 микролитров 100 миллимолярной АТФ в буфер 1X. Это значительно повышает протеасомную активность в образцах и повышает надежность анализа.Восстановить стандарт AMC, предусмотренный в комплекте со 100 микролитров DMSO. Выполняйте шаги с использованием стандарта AMC в темных или условиях низкой освещенности, так как стандарт светочувствительный. Создайте стандартную кривую AMC от серии высоких до низких концентраций AMC.Эта кривая будет использоваться для калибровки считывания пластин и анализа протеасомной активности в гомогенизированных образцах. Восстановить протеасомную субтаррату, предусмотренную в комплекте с 65 микролитерами ДМСО. Также выполните этот шаг в темноте или при условиях низкой освещенности, так как субстрат светочувствительный.Затем создайте от одного до 20 разбавления протеасомного субстрата в новой микроцентрифуге 1,5 миллилитров с помощью буфера анализа 20S. Добавьте нормализованное количество желаемых образцов к пластине 96 хорошо. Вы запустите каждый образец в дубликате.Количество необходимых образцов варьируется в зависимости от подготовки тканей. Как правило, от 10 до 20 микрограммов достаточно для любой субклеточной фракции. Довнесите объем образца до 80 микролитров с ультрачистой водой.Добавленная сумма зависит от объема добавленной выборки. В двух отдельных скважинах добавьте только 80 микролитров воды. Это будут заготовки анализа.Добавьте 10 микролитров буфера анализа 20S к каждому хорошо, включая заготовки анализа. Используйте ретранслятор или автоматизированную пипетку, чтобы обеспечить согласованный объем анализа скважин. Выключите свет или войдите в темную комнату.Добавьте все 100 микролитров разбавленных стандартов AMC в новую колодец, используя один колодец для каждого стандарта. В темноте используйте ретранслятор или автоматизированную пипетку, чтобы добавить 10 микролитров разбавленного протеасомного субстрата в скважины, содержащие образец и заготовки анализа, но не стандарт AMC. Поместите пластину в считыватель пластин и начните кинетический пробег.Выполните количественную оценку различных полиубикитиновых тегов в различных субклеточных фракциях, собранных из тканей мозга грызунов, используя различные стандартные западные протоколы блоттинга в сочетании с уникальными специфическими полиубикитин-антителами. Некоторые убиквитин западные помарки изображения обеспечат колонки различных полос пока другие производят мазок-как картина с немногими или никакими ясными линиями. Для количественной оценки изображения убиквитина западные помарки нарисуйте коробку вокруг колонны, которая простирается по всей лестнице молекулярных стандартов.Отрегулируйте коробку, если окрашивание убиквитина простирается по всей лестнице. Это часто используется для модификаций лизина 48 и широко варьируется в разных подклеточных отсеках. Наконец, вычесть фон, который рассчитывается как средняя оптическая плотность фона непосредственно вокруг столбца со всех сторон.Здесь показана количественная оценка протеасомной активности в различных фракциях, собранных из боковой миндалины одного и того же животного. В ходе анализа протеасомной активности in vitro относительные флуоресцентные единицы, обнаруженные, увеличивались от начала до конца анализа в синаптической фракции, цитоплазмической фракции и ядерной фракции. Ингибитор протеасомы бета-лак не позволял RFUs изменяться в течение всего сеанса.Подклеточные различия наблюдались в протеасомной активности в боковой миндалинах одного и того же животного. Увеличение активности ядерной протеасомы было обнаружено у обученных животных по отношению к контролю, что соответствовало снижению активности внутри синаптической фракции. Цитоплазмическая протеасомная активность оставалась на базовом уровне.Здесь показаны субклеточные различия в увязке специфического белка убиквитина в боковой миндалинах того же животного после обучения. После обучения произошло увеличение общей убиквитины в ядерной фракции, что коррелировало со снижением цитоплазмической фракции. После обучения, линейное убиквитинирование увеличилось в ядерной фракции, но не цитоплазмы или синаптические фракции.Интересно, что K63 убиквитина увеличилась в ядерной фракции после обучения, которое коррелирует с уменьшением синаптической фракции. В то время как одноквититация K48 увеличилась в ядерных и цитоплазмических фракциях после обучения, но не в синаптической фракции. Этот протокол также может быть использован для понимания субклеточного распределения и функции других белков в том же животном.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Neuroscience

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

Одновременное МРТ и электрофизиологии в мозг грызунов

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Количественная активность СНГ-Регуляторных элементов в мышь Retina от эксплантов Электропорация

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Прямая Внутрижелудочковая поставке лекарственных препаратов грызунов центральной нервной системы

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

В естественных условиях Optogenetic возбуждение нервной системы грызунов Центральной

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Активности теломеразы в различных регионах мозга мыши: нерадиоактивный теломеразы повторить Amplification протокол (TRAP) Анализ

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Одновременное Электрофизиологические Запись и Micro-инъекции агенты, ингибирующие в мозге грызунов

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

Персонализированные иглы для микроинъекций в мозге, грызунов

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Оценка плотности синапсов в срезах гиппокампа грызунов мозга

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Запись и модуляция активности эпилептиформный ломтиками грызунов мозга в сочетании с микроэлектродные массивы

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Последствия взрыва индуцированной нейротравма под давлением грызунов средней мозговой артерии

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...