Name: quantifying subcellular ubiquitin-proteasome activity in the rodent brain
Uploaded: 2019-05-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por fondos de startups de la Facultad de Ciencias Agrícolas y de la Vida y la Facultad de Ciencias de Virginia Tech. T.M. cuenta con el apoyo del Programa George Washington Carver en Virginia Tech.

Todos los procedimientos, incluidos los sujetos animales, han sido aprobados por el Instituto Politécnico de Virginia y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal (IACUC).
1. Recolección y disección de tejido cerebral de roedores
NOTA: Este protocolo se puede aplicar a una variedad de regiones cerebrales y se utiliza con varios procedimientos de recolección de tejido. A continuación se muestra el procedimiento...

<ol>
	<li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+system.">The ubiquitin system.</a> Annu Rev Biochem. 67, 425-479 (1998).</li><li>Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+chain+diversity+at+a+glance.">Ubiquitin chain diversity at a glance.</a> Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).</li><li>Ravid, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+degradation+signals+in+the+ubiquitin-proteasome+system.">Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (9), 679-690 (2008).</li><li>Erpapazoglou, Z., Walker, O., Haguenauer-Tsapis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+roles+of+k63-linked+ubiquitin+chains+in+trafficking.">Versatile roles of k63-linked ubiquitin chains in trafficking.</a> Cells. 3 (4), 1027-1088 (2014).</li><li>Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+ubiquitin+chains:+NF-kappaB+signalling,+cell+death+and+beyond.">Linear ubiquitin chains: NF-kappaB signalling, cell death and beyond.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 15 (8), 503-508 (2014).</li><li>Rieser, E., Cordier, S. M., Walczak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+ubiquitination:+a+newly+discovered+regulator+of+cell+signalling.">Linear ubiquitination: a newly discovered regulator of cell signalling.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (2), 94-102 (2013).</li><li>Collins, G. A., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Logic+of+the+26S+Proteasome.">The Logic of the 26S Proteasome.</a> Cell. 169 (5), 792-806 (2017).</li><li>Bhat, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+19S+proteasome+ATPase+Sug1+plays+a+critical+role+in+regulating+MHC+class+II+transcription.">The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription.</a> Molecular Immunology. 45 (8), 2214-2224 (2008).</li><li>Ezhkova, E., Tansey, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasomal+ATPases+link+ubiquitylation+of+histone+H2B+to+methylation+of+histone+H3.">Proteasomal ATPases link ubiquitylation of histone H2B to methylation of histone H3.</a> Molecular Cell. 13 (3), 435-442 (2004).</li><li>Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+system+as+a+critical+regulator+of+synaptic+plasticity+and+long-term+memory+formation.">The ubiquitin-proteasome system as a critical regulator of synaptic plasticity and long-term memory formation.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 105, 107-116 (2013).</li><li>Hegde, A. N., Upadhya, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+pathway+in+health+and+disease+of+the+nervous+system.">The ubiquitin-proteasome pathway in health and disease of the nervous system.</a> Trends in Neuroscience. 30 (11), 587-595 (2007).</li><li>Adori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+distribution+of+components+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+non-diseased+human+and+rat+brain.">Subcellular distribution of components of the ubiquitin-proteasome system in non-diseased human and rat brain.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54 (2), 263-267 (2006).</li><li>Upadhya, S. C., Ding, L., Smith, T. K., Hegde, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+proteasome+activity+in+the+nucleus+and+the+synaptic+terminals.">Differential regulation of proteasome activity in the nucleus and the synaptic terminals.</a> Neurochemistry International. 48 (4), 296-305 (2006).</li><li>Enenkel, C., Lehmann, A., Kloetzel, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+distribution+of+proteasomes+implicates+a+major+location+of+protein+degradation+in+the+nuclear+envelope-ER+network+in+yeast.">Subcellular distribution of proteasomes implicates a major location of protein degradation in the nuclear envelope-ER network in yeast.</a> EMBO Journal. 17 (21), 6144-6154 (1998).</li><li>Jarome, T. J., Kwapis, J. L., Ruenzel, W. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII,+but+not+protein+kinase+A,+regulates+Rpt6+phosphorylation+and+proteasome+activity+during+the+formation+of+long-term+memories.">CaMKII, but not protein kinase A, regulates Rpt6 phosphorylation and proteasome activity during the formation of long-term memories.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 7, 115 (2013).</li><li>Jarome, T. J., Werner, C. T., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+dependent+protein+degradation+is+critical+for+the+formation+and+stability+of+fear+memory+in+the+amygdala.">Activity dependent protein degradation is critical for the formation and stability of fear memory in the amygdala.</a> PLoS One. 6 (9), e24349 (2011).</li><li>Lopez-Salon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+cascade+is+required+for+mammalian+long-term+memory+formation.">The ubiquitin-proteasome cascade is required for mammalian long-term memory formation.</a> European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1820-1826 (2001).</li><li>Reis, D. S., Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+formation+for+trace+fear+conditioning+requires+ubiquitin-proteasome+mediated+protein+degradation+in+the+prefrontal+cortex.">Memory formation for trace fear conditioning requires ubiquitin-proteasome mediated protein degradation in the prefrontal cortex.</a> Frontiers in Behavior Neuroscience. 7, 150 (2013).</li><li>Rosenberg, T., Elkobi, A., Rosenblum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mAChR-dependent+decrease+in+proteasome+activity+in+the+gustatory+cortex+is+necessary+for+novel+taste+learning.">mAChR-dependent decrease in proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for novel taste learning.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 135, 115-124 (2016).</li><li>Rosenberg, T., Elkobi, A., Dieterich, D. C., Rosenblum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDAR-dependent+proteasome+activity+in+the+gustatory+cortex+is+necessary+for+conditioned+taste+aversion.">NMDAR-dependent proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for conditioned taste aversion.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 130, 7-16 (2016).</li><li>Orsi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+subcellular+changes+in+proteasome+activity+and+linkage-specific+protein+polyubiquitination+in+the+amygdala+during+the+consolidation+and+reconsolidation+of+a+fear+memory.">Distinct subcellular changes in proteasome activity and linkage-specific protein polyubiquitination in the amygdala during the consolidation and reconsolidation of a fear memory.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 157, 1-11 (2019).</li><li>Cullen, P. K., Ferrara, N. C., Pullins, S. E., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context+memory+formation+requires+activity-dependent+protein+degradation+in+the+hippocampus.">Context memory formation requires activity-dependent protein degradation in the hippocampus.</a> Learning and Memory. 24 (11), 589-596 (2017).</li><li>Jarome, T. J., Ferrara, N. C., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII+regulates+proteasome+phosphorylation+and+activity+and+promotes+memory+destabilization+following+retrieval.">CaMKII regulates proteasome phosphorylation and activity and promotes memory destabilization following retrieval.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 128, 103-109 (2016).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+protein+degradation+underlies+destabilization+of+retrieved+fear+memory.">Synaptic protein degradation underlies destabilization of retrieved fear memory.</a> Science. 319 (5867), 1253-1256 (2008).</li><li>Dunah, A. W., Standaert, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D1+receptor-dependent+trafficking+of+striatal+NMDA+glutamate+receptors+to+the+postsynaptic+membrane.">Dopamine D1 receptor-dependent trafficking of striatal NMDA glutamate receptors to the postsynaptic membrane.</a> Journal of Neuroscience. 21 (15), 5546-5558 (2001).</li><li>Kelly, P. T., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+proteins.+Characterization+of+tubulin+and+actin+and+identification+of+a+distinct+postsynaptic+density+polypeptide.">Synaptic proteins. Characterization of tubulin and actin and identification of a distinct postsynaptic density polypeptide.</a> Journal of Cell Biology. 79 (1), 173-183 (1978).</li><li>Mengual, E., Arizti, P., Rodrigo, J., Gimenez-Amaya, J. M., Castano, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+distribution+and+electron+microscopic+subcellular+localization+of+the+proteasome+in+the+rat+CNS.">Immunohistochemical distribution and electron microscopic subcellular localization of the proteasome in the rat CNS.</a> Journal of Neuroscience. 16 (20), 6331-6341 (1996).</li></ol>

Aquí, demostramos un método eficiente para cuantificar los cambios en la actividad ubiquitina-proteosoma en diferentes compartimentos subcelulares en el mismo animal. Actualmente, la mayoría de los intentos de medir los cambios subcelulares en la actividad del sistema de ubiquitina-proteosoma se han limitado a un solo compartimento por muestra, lo que resulta en la necesidad de repetir los experimentos. Esto conduce a costos significativos y pérdida de vida animal. Nuestro protocolo alivia este problema dividiendo he...

El sistema de ubiquitina-proteasoma (UPS) es una compleja red de estructuras y ligasas de proteínas interconectadas que controla la degradación de la mayoría de las proteínas de corta duración en las células1. En este sistema, las proteínas se marcan para la degradación u otros procesos/fates celulares por el pequeño modificador ubiquitina. Una proteína diana puede adquirir 1-7 modificaciones de ubiquitina, que pueden unirse en uno de los siete sitios de lisina (K) (K6, K11, K27, K29, K33, K48y K63) o la N-terminal metionina (M1; como se conoce como lineal) en la ubiquitina 2 anterior. Algunas de estas etiquetas de poliubiquitina son específicas de la degradación (K48)3, mientras que otras son en gran parte independientes del proceso de degradación de proteínas (M1)4,5,6. Por lo tanto, el proceso de ubiquitinación de proteínas es increíblemente complejo y la capacidad de cuantificar los cambios en una etiqueta de poliubiquitina específica es fundamental para entender en última instancia el papel de esa modificación dada en el funcionamiento celular. Complicando aún más el estudio de este sistema, el proteosoma,que es la estructura catalítica del SAI 7, ambos degradan las proteínas pero también pueden participar en otros procesos no proteolíticos8,9. No es de extrañar entonces, desde su descubrimiento inicial, la actividad ubiquitina-proteasoma normal y aberrante se ha implicado en la formación de la memoria a largo plazo y una variedad de estados de la enfermedad, incluyendo muchos neurológicos, neurodegenerativos y psiquiátricos trastornos10,11. Como resultado, los métodos que pueden cuantificar de manera efectiva y eficiente la actividad del SAI en el cerebro son fundamentales para entender en última instancia cómo se desreglamenta este sistema en los estados de la enfermedad y el desarrollo final de opciones de tratamiento dirigidas a la ubiquitina y/o proteosoma.
Hay una serie de problemas en la cuantificación de la actividad ubiquitina-proteasoma en el tejido cerebral de ratas y ratones, que son los sistemas modelo más comunes utilizados para estudiar la función del SAI, incluyendo 1) la diversidad de modificaciones de ubiquitina, y 2) la distribución y 2) la distribución y 2) la distribución y 2) la distribución y 2) la distribución y 2) la distribución y 2) la distribución y 2) la distribución y 2) y regulación diferencial del funcionamiento del SAI en los compartimentos subcelulares12,13,14. Por ejemplo, muchas de las primeras demostraciones de la función ubiquitina-proteasoma en el cerebro durante la formación de la memoria utilizaron lisatos de células enteras e indicaron aumentos dependientes del tiempo tanto en la ubiquitinación de proteínas como en la actividad de proteasoma15, 16 , 17 , 18 , 19 , 20. Sin embargo, recientemente encontramos que la actividad ubiquitina-proteasoma varió ampliamente entre los compartimentos subcelulares en respuesta al aprendizaje, con aumentos simultáneos en algunas regiones y disminuciones en otras, un patrón que difiere significativamente de lo que se informó anteriormente en las lisades de células enteras21. Esto es consistente con la limitación de un enfoque de células enteras, ya que no puede disociar la contribución de los cambios en la actividad de UPS en diferentes compartimentos subcelulares. Aunque estudios más recientes han empleado protocolos de fracción sináptica para estudiar el SAI específicamente en sinapsis en respuesta al aprendizaje22,23,24, los métodos utilizados ocluy la capacidad de medir nuclear y citoplasma ubiquitina-proteosoma cambios en el mismo animal. Esto resulta en una necesidad innecesaria de repetir experimentos varias veces, recopilando una fracción subcelular diferente en cada uno. Esto no sólo resulta en una mayor pérdida de vidas de animales, sino que elimina la capacidad de comparar directamente la actividad de UPS en diferentes compartimentos subcelulares en respuesta a un evento dado o durante un estado específico de la enfermedad. Teniendo en cuenta que las dianas proteicas de la ubiquitina y el proteosoma varían ampliamente a lo largo de la célula, entender cómo la señalización ubiquitina-proteosoma difiere en distintos compartimentos subcelulares es fundamental para identificar el papel funcional del SAI en el SAI cerebro durante la formación de la memoria y trastornos neurológicos, neurodegenerativos y psiquiátricos.
Para hacer frente a esta necesidad, hemos desarrollado recientemente un procedimiento en el que se podrían recolectar fracciones nucleares, citoplasmáticas y sinápticas para una región cerebral determinada del mismo animal21. Además, para tener en cuenta la cantidad limitada de proteína que se puede obtener de la recolección de múltiples fracciones subcelulares de la misma muestra, optimizamos protocolos previamente establecidos para analizar la actividad de proteasoma in vitro y la actividad específica de la vinculación ubiquitinación de proteínas en células lysed recogidas del tejido cerebral de roedores. Usando este protocolo, pudimos recopilar y comparar directamente los cambios dependientes del aprendizaje en la actividad del proteasoma, K48, K63, M1 y los niveles generales de poliubiquitinación de proteínas en el núcleo y el citoplasma y en las sinapsis en la amígdala lateral de ratas. Aquí, describimos en detalle nuestro procedimiento (Figura1), que podría mejorar significativamente nuestra comprensión de cómo el SAI está involucrado en la formación de la memoria a largo plazo y varios estados de la enfermedad. Sin embargo, cabe señalar que la actividad de proteasoma in vitro discutida en nuestro protocolo, aunque ampliamente utilizado, no mide directamente la actividad de los complejos completos de proteasoma 26S. Más bien, este ensayo mide la actividad del núcleo 20S, lo que significa que sólo puede servir como un apoderado para entender la actividad del núcleo en sí en lugar de todo el complejo de proteasoma 26S.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:878px;" width="878">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">0.5M EDTA</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">15575020</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">20S Proteasome Activity Kit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>APT280</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">ATP</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">FERR1441</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Beta-actin antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>4967S</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Beta-tubulin antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>2128T</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BioTek Synergy H1 plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>VATECHH1MT3</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN19024280</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">clasto lactacystin b-lactone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L7035</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cryogenic cup</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>033377B</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMSO</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Varous other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">DTT</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">D0632</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Glycerol</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">G5516</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">H3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1791</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">HEPES</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">H3375</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SA48</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">IGEPAL (NP-40)</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">I3021</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">K48 Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab140601</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">K63 Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab179434</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">KCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">P9541</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KONTES tissue grinder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885300-0002</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laemmli sample buffer</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Linear Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Life Sensors</td>
			<td>AB-0130-0100</td>
			<td>Only M1 antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">MgCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">442611</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000213</td>
			<td>Various other manufacturers/models</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">myr-AIP</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-P212-0500</td>
			<td>Carried by Millipore-Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">NaCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">S3014</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Odyssey Fc Imaging System</td>
			<td>LiCor</td>
			<td>2800-02</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Phosphatase Inhibitor</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">524625</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Precision Plus Protein Standard</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>161-0373</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Protease Inhibitor</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">P8340</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PSD95 antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>3450T</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:222px;">SDS</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">L3771</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SS255</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:222px;">Sucrose</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">S0389</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">TBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62938</td>
			<td>Varous other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:50px;width:222px;">Tris</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">T1503</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;">Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;">Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-PW8810</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying subcellular ubiquitin-proteasome activity in the rodent brain

El sistema de ubiquitina-proteasoma es un regulador clave de la degradación de proteínas y una variedad de otros procesos celulares en eucariotas. En el cerebro, los aumentos en la actividad ubiquitina-proteasoma son críticos para la plasticidad sináptica y la formación de la memoria y los cambios aberrantes en este sistema se asocian con una variedad de trastornos neurológicos, neurodegenerativos y psiquiátricos. Uno de los problemas en el estudio de la ubiquitina-proteosoma funcionamiento en el cerebro es que está presente en todos los compartimentos celulares, en el que las dianas de la proteína, el papel funcional y los mecanismos de regulación pueden variar ampliamente. Como resultado, la capacidad de comparar directamente la orientación a la proteína ubiquitina cerebral y la actividad catalítica proteasoma en diferentes compartimentos subcelulares dentro del mismo animal es fundamental para comprender completamente cómo el SAI contribuye a la plasticidad sináptica, memoria y enfermedades. El método descrito aquí permite la recolección de fracciones sinápticas nucleares, citoflásmáticas y brutas del mismo cerebro de roedor (rata), seguida de la cuantificación simultánea de la actividad catalítica proteasome (indirectamente, proporcionando actividad del núcleo de proteasoma únicamente) y el etiquetado de proteína de ubiquitina específica para varillajes. Por lo tanto, el método se puede utilizar para comparar directamente los cambios subcelulares en la actividad ubiquitina-proteosoma en diferentes regiones cerebrales en el mismo animal durante la plasticidad sináptica, la formación de la memoria y diferentes estados de enfermedad. Este método también se puede utilizar para evaluar la distribución subcelular y la función de otras proteínas dentro del mismo animal.

Utilizando el procedimiento descrito aquí, se recogieron fracciones nucleares, citoflásmáticas y sinápticas de la amígdala lateral del cerebro de la rata (Figura1). La pureza de las fracciones individuales se confirmó a través de la hincha occidental, sondeando con anticuerpos contra proteínas que deben ser enriquecidas o agotadas en el lisado. En el primer hemisferio donde se recogió una fracción sináptica bruta, la proteína de densidad postsiná...

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Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain

Este protocolo está diseñado para cuantificar eficientemente la actividad del sistema de ubiquitina-proteasoma (UPS) en diferentes compartimentos celulares del cerebro de roedores. Los usuarios pueden examinar el funcionamiento de UPS en fracciones nucleares, citoplasmáticas y sinápticas en el mismo animal, reduciendo la cantidad de tiempo y número de animales necesarios para realizar estos análisis complejos.

Cuantificación de la actividad ubiquitina-proteosoma subcelular en el cerebro de los roedores

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases ...

Este protocolo mide los niveles de ubiquitinación de proteína subcelular y la actividad proteosoma en el cerebro de los roedores, lo que permite comparar dentro de los sujetos cómo cambia la actividad ubiquitina-proteosoma en respuesta a la actividad celular, el aprendizaje o la enfermedad. El protocolo permite la recolección de fracciones sinápticas, citoplasmáticas y nucleares del mismo cerebro de roedores. Minimizando la pérdida, se podría realizar con pequeñas cantidades de tejido y equipos básicos de laboratorio.Demostrando el procedimiento estará Taylor McFadden, un estudiante graduado de mi laboratorio. Comience este procedimiento con la recolección y disección del tejido cerebral de roedores como se describe en el protocolo de texto. Asegúrese de que el hemisferio utilizado está equilibrado en contra de las condiciones de extracción para cada grupo experimental.Retire el microtubo centrífugo de 1,5 mililitros que contiene un hemisferio de la región de interés del congelador de menos 80 grados Celsius. Usando un bisturí, transfiera el tejido cerebral congelado a un homogeneizador de teflón de vidrio de dos mililitros. Añadir 500 microlitros de tampón de lelisis al tubo de teflón.Usando el pestle B, homogeneizar el mismo tejido con 15 golpes hasta que no haya una cantidad visible de material sólido presente. Usa un movimiento de giro durante cada golpe. Con una pipeta de 1.000 microlitros, transfiera la muestra homogeneizada a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.Coloque el tubo sobre hielo húmedo e incubar durante 30 minutos. Coloque el tubo en la microcentrífuga y gire durante 10 minutos a 845 veces g en cuatro grados centígrados. Después de la finalización, retire cuidadosamente el sobrenadante pipeteando y colóquelo en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.Esta es la fracción citoplasma. Añadir 50 microlitros de tampón de extracción al pellet resultante y resuspend por pipeteo. No vórtice el pellet.Coloque el tubo que contiene el pellet resuspendido sobre hielo e incubar durante 30 minutos. A continuación, centrifugar el tubo durante 20 minutos a 21, 456 veces g en cuatro grados Centígrados. Después de la centrifugación, retire cuidadosamente el sobrenadante pipeteando y colóquelo en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.Esta es la fracción nuclear. Homogeneizar un hemisferio de la región de interés como antes, excepto para utilizar 500 microlitros de búfer TEVP en lugar de búfer de lelisis. Con una pipeta de 1.000 microlitros, transfiera la muestra homogeneizada a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.Centrifugar la muestra a 1.000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Recoja el sobrenadante y transfiéralo a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros utilizando una pipeta de 1.000 microlitro. Centrifugar la muestra a 10.000 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.Deseche el pellet original que contiene núcleos y los desechos grandes. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Esta es la fracción citosólica.Añadir 50 microlitros de tampón de homogeneización al pellet y resuspend por pipeteo hasta que no haya material sólido visible. Centrifugar la muestra a 20.000 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.Esta es la fracción de membrana sinaptosomal bruta. Para configurar el ensayo, precalienta el lector de placas a 37 grados celsius y mantén presionado durante la carrera. Ajuste la excitación a 360 nanómetros y la emisión a 460 nanómetros.Si la placa de 96 pozos utilizada es clara, ajuste la posición de la óptica a la parte inferior. Si se utiliza una placa oscura de 96 pozos, ajuste la posición de la óptica a la parte superior. Programe una carrera cinética con un tiempo de dos horas de escaneo cada 30 minutos.Reconstituya el tampón de ensayo 20S 10X suministrado en el kit con 13,5 mililitros de agua ultrapura. Añade 14 microlitros de 100 ATP mililares al búfer ahora 1X. Esto mejora significativamente la actividad proteosoma en las muestras y mejora la fiabilidad del ensayo.Reconstituya el estándar AMC proporcionado en el kit con 100 microlitros de DMSO. Realice pasos utilizando el estándar AMC en la oscuridad o en condiciones de poca luz, ya que el estándar es sensible a la luz. Cree una curva estándar de AMC a partir de una serie de concentraciones de AMC altas a bajas.Esta curva se utilizará para la calibración del lector de placas y el análisis de la actividad proteosoma en las muestras homogeneizadas. Reconstituir el subtrato proteoso suministrado en el kit con 65 microlitros de DMSO. También realice este paso en la oscuridad o en condiciones de poca luz, ya que el sustrato es sensible a la luz.A continuación, cree una dilución de uno a 20 del sustrato proteosoma en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros utilizando el tampón de ensayo 20S. Agregue una cantidad normalizada de las muestras deseadas a una placa de 96 pozos. Ejecute cada muestra por duplicado.La cantidad de muestra necesaria varía en función de la preparación del tejido. Generalmente, 10 a 20 microgramos es suficiente para cualquier fracción subcelular. Lleve el volumen del pozo de muestra a 80 microlitros con agua ultrapura.La cantidad agregada depende del volumen de muestra agregada. En dos pozos separados, agregue 80 microlitros de agua solo. Estos serán los espacios en blanco del ensayo.Agregue 10 microlitros de búfer de ensayo 20S a cada pozo, incluidos los espacios en blanco de ensayo. Utilice un repetidor o una pipeta automatizada para garantizar un volumen de ensayo uniforme en todos los pozos. Apague las luces o entre en una habitación oscura.Agregue los 100 microlitros de estándares AMC diluidos a un nuevo pozo usando un solo pozo para cada estándar. En la oscuridad, utilice un repetidor o pipeta automatizada para añadir 10 microlitros de sustrato proteosoma diluido a los pozos que contienen en blancos de muestras y ensayos, pero no el estándar AMC. Coloque la placa en el lector de placas e inicie la carrera cinética.Realizar la cuantificación de diversas etiquetas de poliubiquitina en diferentes fracciones subcelulares recogidas a partir del tejido cerebral de roedores utilizando una variedad de protocolos de hinchazón occidental estándar en combinación con anticuerpos únicos de poliubiquitina específicos de la vinculación. Algunas imágenes de manchas occidentales de ubiquitina proporcionarán columnas de bandas distintas, mientras que otras producen un patrón similar a un frotis con pocas o ninguna línea clara. Para cuantificar las manchas occidentales de ubiquitina con imagen, dibuje una caja alrededor de la columna que extienda toda la escalera de estándares moleculares.Ajuste la caja si la tinción de ubiquitina se extiende a través de toda la escalera. Esto es común para las modificaciones de lisina 48 y varía ampliamente entre los compartimentos subcelulares. Por último, restar el fondo que se calcula como la densidad óptica media del fondo que rodea inmediatamente la columna en todos los lados.Aquí se muestra la cuantificación de la actividad proteosoma en diferentes fracciones recogidas de la amígdala lateral del mismo animal. Durante el ensayo de actividad proteosoma in vitro, las unidades fluorescentes relativas detectadas aumentaron desde el principio hasta el final del ensayo en la fracción sináptica, la fracción citoplasmática y la fracción nuclear. El inhibidor del proteasoma beta-lac impidió que las RFU cambiaran a lo largo de la sesión.Se observaron diferencias subcelulares en la actividad proteosoma en la amígdala lateral del mismo animal. Se detectó un aumento de la actividad proteosoma nuclear en animales entrenados en relación con los controles que correspondían a una disminución de la actividad dentro de la fracción sináptica. La actividad proteosoma citoplasmática se mantuvo al inicio.Aquí se muestran diferencias subcelulares en la ubiquitinación de proteína específica de la vinculación en la amígdala lateral del mismo animal después del aprendizaje. Hubo un aumento en la ubiquitinación general en la fracción nuclear después del aprendizaje que se correlacionó con una disminución en la fracción citoplasma. Después del aprendizaje, la ubiquitinación lineal aumentó en la fracción nuclear, pero no en las fracciones citoplasmáticas o sinápticas.Curiosamente, la ubiquitinación K63 aumentó en la fracción nuclear después del aprendizaje que se correlacionó con una disminución en la fracción sináptica. Mientras que la uniquitinación K48 aumentó en las fracciones nucleares y citoplasmáticas después del aprendizaje, pero no en la fracción sináptica. Este protocolo también se puede utilizar para comprender la distribución subcelular y la función de otras proteínas dentro del mismo animal.

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Translation: RNA to Protein

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