Name: quantifying subcellular ubiquitin-proteasome activity in the rodent brain
Uploaded: 2019-05-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain at JoVE.com

Detta arbete stöddes av startup medel från College of Agricultural och Life Sciences och College of Science vid Virginia Tech. T.M. stöds av George Washington Carver program på Virginia Tech.

Alla förfaranden inklusive djur försökspersoner har godkänts av Virginia Polytechnic Institute och State University institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC).
1. insamling och dissektion av gnagare hjärnvävnad
Anmärkning: Detta protokoll kan tillämpas på en mängd olika hjärnregioner och används med olika vävnads insamlings förfaranden. Nedan är det förfarande som används i vårt labb för subcellulära av råtta hj...

<ol>
	<li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+system.">The ubiquitin system.</a> Annu Rev Biochem. 67, 425-479 (1998).</li><li>Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+chain+diversity+at+a+glance.">Ubiquitin chain diversity at a glance.</a> Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).</li><li>Ravid, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+degradation+signals+in+the+ubiquitin-proteasome+system.">Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (9), 679-690 (2008).</li><li>Erpapazoglou, Z., Walker, O., Haguenauer-Tsapis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+roles+of+k63-linked+ubiquitin+chains+in+trafficking.">Versatile roles of k63-linked ubiquitin chains in trafficking.</a> Cells. 3 (4), 1027-1088 (2014).</li><li>Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+ubiquitin+chains:+NF-kappaB+signalling,+cell+death+and+beyond.">Linear ubiquitin chains: NF-kappaB signalling, cell death and beyond.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 15 (8), 503-508 (2014).</li><li>Rieser, E., Cordier, S. M., Walczak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+ubiquitination:+a+newly+discovered+regulator+of+cell+signalling.">Linear ubiquitination: a newly discovered regulator of cell signalling.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (2), 94-102 (2013).</li><li>Collins, G. A., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Logic+of+the+26S+Proteasome.">The Logic of the 26S Proteasome.</a> Cell. 169 (5), 792-806 (2017).</li><li>Bhat, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+19S+proteasome+ATPase+Sug1+plays+a+critical+role+in+regulating+MHC+class+II+transcription.">The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription.</a> Molecular Immunology. 45 (8), 2214-2224 (2008).</li><li>Ezhkova, E., Tansey, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasomal+ATPases+link+ubiquitylation+of+histone+H2B+to+methylation+of+histone+H3.">Proteasomal ATPases link ubiquitylation of histone H2B to methylation of histone H3.</a> Molecular Cell. 13 (3), 435-442 (2004).</li><li>Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+system+as+a+critical+regulator+of+synaptic+plasticity+and+long-term+memory+formation.">The ubiquitin-proteasome system as a critical regulator of synaptic plasticity and long-term memory formation.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 105, 107-116 (2013).</li><li>Hegde, A. N., Upadhya, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+pathway+in+health+and+disease+of+the+nervous+system.">The ubiquitin-proteasome pathway in health and disease of the nervous system.</a> Trends in Neuroscience. 30 (11), 587-595 (2007).</li><li>Adori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+distribution+of+components+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+non-diseased+human+and+rat+brain.">Subcellular distribution of components of the ubiquitin-proteasome system in non-diseased human and rat brain.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54 (2), 263-267 (2006).</li><li>Upadhya, S. C., Ding, L., Smith, T. K., Hegde, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+proteasome+activity+in+the+nucleus+and+the+synaptic+terminals.">Differential regulation of proteasome activity in the nucleus and the synaptic terminals.</a> Neurochemistry International. 48 (4), 296-305 (2006).</li><li>Enenkel, C., Lehmann, A., Kloetzel, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+distribution+of+proteasomes+implicates+a+major+location+of+protein+degradation+in+the+nuclear+envelope-ER+network+in+yeast.">Subcellular distribution of proteasomes implicates a major location of protein degradation in the nuclear envelope-ER network in yeast.</a> EMBO Journal. 17 (21), 6144-6154 (1998).</li><li>Jarome, T. J., Kwapis, J. L., Ruenzel, W. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII,+but+not+protein+kinase+A,+regulates+Rpt6+phosphorylation+and+proteasome+activity+during+the+formation+of+long-term+memories.">CaMKII, but not protein kinase A, regulates Rpt6 phosphorylation and proteasome activity during the formation of long-term memories.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 7, 115 (2013).</li><li>Jarome, T. J., Werner, C. T., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+dependent+protein+degradation+is+critical+for+the+formation+and+stability+of+fear+memory+in+the+amygdala.">Activity dependent protein degradation is critical for the formation and stability of fear memory in the amygdala.</a> PLoS One. 6 (9), e24349 (2011).</li><li>Lopez-Salon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+cascade+is+required+for+mammalian+long-term+memory+formation.">The ubiquitin-proteasome cascade is required for mammalian long-term memory formation.</a> European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1820-1826 (2001).</li><li>Reis, D. S., Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+formation+for+trace+fear+conditioning+requires+ubiquitin-proteasome+mediated+protein+degradation+in+the+prefrontal+cortex.">Memory formation for trace fear conditioning requires ubiquitin-proteasome mediated protein degradation in the prefrontal cortex.</a> Frontiers in Behavior Neuroscience. 7, 150 (2013).</li><li>Rosenberg, T., Elkobi, A., Rosenblum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mAChR-dependent+decrease+in+proteasome+activity+in+the+gustatory+cortex+is+necessary+for+novel+taste+learning.">mAChR-dependent decrease in proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for novel taste learning.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 135, 115-124 (2016).</li><li>Rosenberg, T., Elkobi, A., Dieterich, D. C., Rosenblum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDAR-dependent+proteasome+activity+in+the+gustatory+cortex+is+necessary+for+conditioned+taste+aversion.">NMDAR-dependent proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for conditioned taste aversion.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 130, 7-16 (2016).</li><li>Orsi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+subcellular+changes+in+proteasome+activity+and+linkage-specific+protein+polyubiquitination+in+the+amygdala+during+the+consolidation+and+reconsolidation+of+a+fear+memory.">Distinct subcellular changes in proteasome activity and linkage-specific protein polyubiquitination in the amygdala during the consolidation and reconsolidation of a fear memory.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 157, 1-11 (2019).</li><li>Cullen, P. K., Ferrara, N. C., Pullins, S. E., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context+memory+formation+requires+activity-dependent+protein+degradation+in+the+hippocampus.">Context memory formation requires activity-dependent protein degradation in the hippocampus.</a> Learning and Memory. 24 (11), 589-596 (2017).</li><li>Jarome, T. J., Ferrara, N. C., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII+regulates+proteasome+phosphorylation+and+activity+and+promotes+memory+destabilization+following+retrieval.">CaMKII regulates proteasome phosphorylation and activity and promotes memory destabilization following retrieval.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 128, 103-109 (2016).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+protein+degradation+underlies+destabilization+of+retrieved+fear+memory.">Synaptic protein degradation underlies destabilization of retrieved fear memory.</a> Science. 319 (5867), 1253-1256 (2008).</li><li>Dunah, A. W., Standaert, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D1+receptor-dependent+trafficking+of+striatal+NMDA+glutamate+receptors+to+the+postsynaptic+membrane.">Dopamine D1 receptor-dependent trafficking of striatal NMDA glutamate receptors to the postsynaptic membrane.</a> Journal of Neuroscience. 21 (15), 5546-5558 (2001).</li><li>Kelly, P. T., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+proteins.+Characterization+of+tubulin+and+actin+and+identification+of+a+distinct+postsynaptic+density+polypeptide.">Synaptic proteins. Characterization of tubulin and actin and identification of a distinct postsynaptic density polypeptide.</a> Journal of Cell Biology. 79 (1), 173-183 (1978).</li><li>Mengual, E., Arizti, P., Rodrigo, J., Gimenez-Amaya, J. M., Castano, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+distribution+and+electron+microscopic+subcellular+localization+of+the+proteasome+in+the+rat+CNS.">Immunohistochemical distribution and electron microscopic subcellular localization of the proteasome in the rat CNS.</a> Journal of Neuroscience. 16 (20), 6331-6341 (1996).</li></ol>

Här visar vi en effektiv metod för att kvantifiera förändringar i ubiquitin-Proteasome-aktivitet mellan olika subcellulära fack i samma djur. För närvarande, de flesta försök att mäta subcellulära förändringar i aktiviteten av ubiquitin-Proteasome systemet har begränsats till ett enda fack per prov, vilket resulterar i behovet av att upprepa experiment. Detta leder till betydande kostnader och förlust av djurlivet. Vårt protokoll lindrar detta problem genom att dela upp halvklot, vilket gör att olika cel...

Ubiquitin-Proteasome-systemet (UPS) är ett komplext nätverk av sammankopplade proteinstrukturer och Ligaser som kontrollerar nedbrytningen av de flesta kortlivade proteiner i celler1. I detta system är proteiner märkta för nedbrytning eller andra cellulära processer/öden av den lilla modifieraren ubiquitin. Ett målprotein kan förvärva 1-7 ubiquitin modifieringar, som kan länka samman på en av sju lysin (K) platser (K6, K11, K27, K29, K33, K48 och K63) eller N-Terminal metionin (M1, så kallad linjär) i föregående ubiquitin2. Några av dessa polyubiquitin taggar är nedbrytnings-specifika (K48)3, medan andra är till stor del oberoende av proteinnedbrytning processen (M1)4,5,6. Sålunda, proteinet ubiquitination förlopp är oerhört komplex och förmågan till kvantifiera förändringen i en bestämd polyubiquitin tag är kritisk för i slutändan förstå den roll av så pass givit modifiera i Cellular funktion. Ytterligare komplierar studiet av detta system, Proteasome, som är den katalytiska strukturen av UPS7, både försämrar proteiner men kan också vara inblandade i andra icke-proteolytiska processer8,9. Inte överraskande då, sedan dess första upptäckten, normal och avvikande ubiquitin-Proteasome aktivitet har varit inblandad i långtids minnesbildning och en mängd olika sjukdomstillstånd, inklusive många neurologiska, neurodegenerativa och psykiatriska störningar10,11. Som ett resultat av detta är metoder som effektivt och effektivt kan kvantifiera UPS aktivitet i hjärnan avgörande för att i slutändan förstå hur detta system är dysreglerat i sjukdomstillstånd och eventuell utveckling av behandlingsalternativ riktade mot ubiquitin och/eller proteasom fungerar.
Det finns ett antal frågor att kvantifiera ubiquitin-Proteasome aktivitet i hjärnvävnad från råttor och möss, som är de vanligaste modellsystem som används för att studera UPS-funktion, inklusive 1) mångfalden av ubiquitin modifieringar, och 2) distribution och differentiell reglering av UPS fungerar över subcellulära fack12,13,14. Till exempel, många av de tidiga demonstrationerna av ubiquitin-proteasom funktion i hjärnan under minnesbildning används hela cellen celllysat och indikerade tidsberoende ökningar i både protein ubiquitination och proteasom aktivitet15, 16 , 17 , 18 , 19 , 20. Vi fann dock nyligen att ubiquitin-Proteasome aktivitet varierade kraftigt över subcellulära fack som svar på inlärning, med samtidiga ökningar i vissa regioner och minskningar i andra, ett mönster som skiljer sig avsevärt från vad som tidigare rapporterades i hela cellen celllysat21. Detta är förenligt med begränsningen av en hel cells strategi, eftersom den inte kan separera bidraget från förändringar i UPS-aktivitet i olika subcellulära fack. Även nyare studier har använt synaptiska fraktions protokoll för att studera UPS specifikt på synapser som svar på lärande22,23,24, de metoder som används ockludera förmågan att mäta nukleära och cytoplasmiska ubiquitin-Proteasome förändringar i samma djur. Detta resulterar i ett onödigt behov av att upprepa experiment flera gånger, samla in en annan subcellulär fraktion i varje. Detta resulterar inte bara i en större förlust av djurliv, men det eliminerar möjligheten att direkt jämföra UPS aktivitet mellan olika subcellulära fack som svar på en viss händelse eller under en viss sjukdomstillstånd. Med tanke på att protein målen för ubiquitin och proteasom varierar kraftigt i hela cellen, förstå hur ubiquitin-proteasom signalering skiljer sig i olika subcellulära fack är avgörande för att identifiera den funktionella roll UPS i hjärnan under minnesbildning och neurologiska, neurodegenerativa och psykiatriska störningar.
För att ta itu med detta behov utvecklade vi nyligen ett förfarande där nukleära, cytoplasmiska och synaptiska fraktioner kunde samlas in för en given hjärnregion från samma djur21. Dessutom, för att ta hänsyn till den begränsade mängden protein som kan erhållas från insamling av flera subcellulära fraktioner från samma prov, vi optimerat tidigare etablerade protokoll till assay in vitro proteasom aktivitet och länkspecifika protein ubiquitination i lyserade celler som samlats in från gnagare hjärnvävnad. Med hjälp av detta protokoll, kunde vi samla in och direkt jämföra lärande-beroende förändringar i proteasom aktivitet, K48, K63, M1 och övergripande protein polvubiquitinering nivåer i kärnan och cytoplasman och vid synapser i sidled amygdala av råttor. Här beskriver vi i detalj vårt förfarande (figur 1), som avsevärt skulle kunna förbättra vår förståelse för hur UPS är involverad i långtids minnesbildning och olika sjukdomstillstånd. Det bör dock noteras att in vitro proteasom verksamhet diskuteras i vårt protokoll, medan allmänt används, inte direkt mäta aktiviteten av kompletta 26S proteasom komplex. Snarare, denna analys mäter aktiviteten av 20-talet kärnan, vilket innebär att det bara kan fungera som en proxy för att förstå verksamheten i själva kärnan i motsats till hela 26S proteasom Complex.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:878px;" width="878">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">0.5M EDTA</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">15575020</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">20S Proteasome Activity Kit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>APT280</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">ATP</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">FERR1441</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Beta-actin antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>4967S</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Beta-tubulin antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>2128T</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BioTek Synergy H1 plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>VATECHH1MT3</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN19024280</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">clasto lactacystin b-lactone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L7035</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cryogenic cup</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>033377B</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMSO</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Varous other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">DTT</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">D0632</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Glycerol</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">G5516</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">H3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1791</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">HEPES</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">H3375</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SA48</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">IGEPAL (NP-40)</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">I3021</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">K48 Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab140601</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">K63 Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab179434</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">KCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">P9541</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KONTES tissue grinder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885300-0002</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laemmli sample buffer</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Linear Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Life Sensors</td>
			<td>AB-0130-0100</td>
			<td>Only M1 antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">MgCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">442611</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000213</td>
			<td>Various other manufacturers/models</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">myr-AIP</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-P212-0500</td>
			<td>Carried by Millipore-Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">NaCl</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">S3014</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Odyssey Fc Imaging System</td>
			<td>LiCor</td>
			<td>2800-02</td>
			<td>Other vendors carry different versions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Phosphatase Inhibitor</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">524625</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Precision Plus Protein Standard</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>161-0373</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:222px;">Protease Inhibitor</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">P8340</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PSD95 antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>3450T</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:222px;">SDS</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">L3771</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SS255</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:222px;">Sucrose</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">S0389</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">TBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62938</td>
			<td>Varous other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:50px;width:222px;">Tris</td>
			<td style="width:143px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:259px;">T1503</td>
			<td style="width:255px;">Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;">Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;">Ubiquitin Antibody</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-PW8810</td>
			<td>Various other vendors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying subcellular ubiquitin-proteasome activity in the rodent brain

Den ubiquitin-Proteasome systemet är en viktig regulator av proteinnedbrytning och en mängd andra cellulära processer i eukaryotes. I hjärnan, ökningar av ubiquitin-Proteasome aktivitet är kritiska för synaptisk plasticitet och minnesbildning och avvikande förändringar i detta system är förknippade med en mängd olika neurologiska, neurodegenerativa och psykiatriska störningar. En av de frågor som studerar ubiquitin-Proteasome funktion i hjärnan är att det är närvarande i alla cellulära fack, där protein mål, funktionell roll och mekanismer för reglering kan variera kraftigt. Som ett resultat, förmågan att direkt jämföra hjärnan ubiquitin protein inriktning och proteasom katalytisk aktivitet i olika subcellulära fack inom samma djur är avgörande för att fullt förstå hur UPS bidrar till synaptisk plasticitet, minne och sjukdom. Den metod som beskrivs här tillåter insamling av nukleära, cytoplasmiska och råa synaptiska fraktioner från samma gnagare (råtta) hjärna, följt av samtidig kvantifiering av proteasom katalytisk aktivitet (indirekt, som ger aktivitet av proteasom kärna endast) och länkningsspecifika ubiquitin protein märkning. Sålunda, metoden kan användas för att direkt jämföra subcellulära förändringar i ubiquitin-Proteasome aktivitet i olika hjärnregioner i samma djur under synaptisk plasticitet, minnesbildning och olika sjukdomstillstånd. Denna metod kan också användas för att bedöma den subcellulära distributionen och funktionen av andra proteiner inom samma djur.

Med hjälp av det förfarande som beskrivs här, nukleära, cytoplasmiska och synaptiska fraktioner samlades in från den laterala amygdala av råtta hjärnan (figur 1). Renhet av de enskilda fraktioner bekräftades via västerländska blotting, sondering med antikroppar mot proteiner som bör berikas eller utarmat i lysat. I den första halvklotet där en rå synaptisk fraktion samlades, postsynaptiska densitet protein 95 (PSD95) var närvarande i synaptic, ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain at JoVE.com

Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain

Detta protokoll är utformat för att effektivt kvantifiera ubiquitin-Proteasome system (UPS) aktivitet i olika cellulära fack i gnagare hjärnan. Användare kan undersöka UPS fungerar i nukleära, cytoplasmiska och synaptiska fraktioner i samma djur, minska mängden tid och antal djur som behövs för att utföra dessa komplexa analyser.

Kvantifiera subcellulär ubiquitin-Proteasome-aktivitet i gnagare hjärnan

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases ...

Detta protokoll mäter subcellulära protein ubiquitination nivåer och proteasome aktivitet i gnagare hjärnan tillåter inom försökspersoner jämförelser av hur ubiquitin-proteasome aktivitet förändringar som svar på cellulär aktivitet, lärande, eller sjukdom. Protokollet tillåter insamling av synaptiska, cytoplasmatiska och nukleära fraktioner från samma gnagare hjärna. Minimera förlust, det skulle kunna utföras med små vävnadsmängder och grundläggande laboratorieutrustning.Visar förfarandet kommer att Taylor McFadden, en doktorand från mitt laboratorium. Börja detta förfarande med insamling och dissektion av gnagare hjärnvävnad som beskrivs i textprotokollet. Se till att den använda hemisfären är motbalanserad över utvinningsförhållanden för varje experimentgrupp.Ta bort 1,5 milliliter centrifugera mikrorör som innehåller en halvklot av regionen av intresse från minus 80 grader Celsius frys. Med hjälp av en skalpell, överföra den frusna hjärnvävnaden till en två milliliter glas Teflon homogenisator. Tillsätt 500 mikroliter av lysbuffert till Teflonröret.Med hjälp av mortelstöt B, homogenisera samma vävnad med 15 slag tills ingen synlig mängd fast material är närvarande. Använd en vridrörelse under varje slag. Med en 1, 000 mikroliterpipett överför du det homogeniserade provet till ett nytt 1,5 milliliter mikrocentrifugrör.Placera röret på våt is och inkubera i 30 minuter. Placera röret i mikrocentrifuget och snurra i 10 minuter vid 845 gånger g i fyra grader Celsius. Efter avslutad, försiktigt ta bort supernatanten genom pipettering och placera i en ny 1,5 milliliter microcentrifugrör.Detta är den cytoplasmatiska fraktionen. Tillsätt 50 mikroliter av utsugsbuffert till den resulterande pelleten och resuspend genom pipettering. Virvel inte pelleten.Placera röret som innehåller den återanvända pelleten på is och inkubera i 30 minuter. Sedan centrifugera röret i 20 minuter vid 21, 456 gånger g i fyra grader Celsius. Efter centrifugering ska du försiktigt ta bort supernatanten genom pipettering och placera i ett nytt 1,5 milliliter mikrocentrifugrör.Det här är kärnfraktionen. Homogenisera en halvklot av regionen av intresse som tidigare utom att använda 500 mikroliter av TEVP buffert i stället för lysis buffert. Med hjälp av en 1, 000 mikroliterpipett, överför det homogeniserade provet till ett nytt 1,5 milliliter mikrocentrifugrör.Centrifugera provet vid 1, 000 gånger g i 10 minuter vid fyra grader Celsius. Samla upp supernatanten och överför den till ett nytt 1,5 milliliter mikrocentrifugrör med hjälp av en 1, 000 mikroliterpipett. Centrifugera provet vid 10, 000 gånger g i 10 minuter vid fyra grader Celsius.Kasta den ursprungliga pelleten som innehåller kärnor och det stora skräpet. Överför supernatanten till ett nytt 1,5 milliliter mikrocentrifugrör. Detta är den cytosoliska fraktionen.Tillsätt 50 mikroliter av homogeniseringsbuffert till pelleten och resuspend genom pipettering tills inget fast material syns. Centrifugera provet vid 20, 000 gånger g i 10 minuter vid fyra grader Celsius. Överför supernatanten till ett nytt 1,5 milliliter mikrocentrifugrör.Detta är den råa synaptosomala membranfraktionen. För att ställa in analysen, prewarm plattan läsaren till 37 grader Celsius och hålla genom körningen. Ställ excitationen till 360 nanometer och utsläpp till 460 nanometer.Om den 96 brunnsplatta som används är klar, ställ in optikläget på botten. Om en mörk 96 brunnsplatta används, ställ in optikpositionen på toppen. Programmera en kinetisk körning med en tid på två timmar skanning var 30:e minut.Rekonstruera 20S 10X-analysbufferten som tillhandahålls i satsen med 13,5 milliliter ultrarent vatten. Lägg till 14 mikroliter på 100 millimolar ATP till den nu 1X buffert. Detta avsevärt förbättrar proteasom aktivitet i proverna och förbättrar analysen tillförlitlighet.Rekonstruera AMC-standarden som tillhandahålls i satsen med 100 mikroliter DMSO. Utför steg med hjälp av AMC-standarden i mörker eller under svagt ljus som standard är ljuskänslig. Skapa en standardkurva för AMC från en serie höga till låga AMC-koncentrationer.Denna kurva kommer att användas för kalibrering av plåtläsar och analys av proteasomaktivitet i de homogeniserade proverna. Rekonstruera den proteasom subtrat som tillhandahålls i satsen med 65 mikroliter av DMSO. Utför även detta steg i mörker eller under svagt ljus som underlaget är ljuskänsligt.Skapa sedan en en till 20 utspädning av proteasom substrat i en ny 1,5 milliliter mikrocentrifugrör med hjälp av 20S-analysbuffert. Lägg till en normaliserad mängd av de önskade proverna till en 96 brunnsplatta. Kör varje prov i två exemplar.Mängden prov som behövs varierar baserat på vävnadspreparering. Generellt är 10 till 20 mikrogram tillräckligt för någon subcellulär fraktion. Ta prov brunnsvolymen till 80 mikroliter med ultrarent vatten.Mängden som läggs till beror på volymen av tillsatta prov. I två separata brunnar, tillsätt 80 mikroliter vatten ensam. Dessa kommer att vara de assay ämnen.Lägg till 10 mikroliter av 20S-analysbuffert till varje brunn inklusive analys ämnen. Använd en repeater eller automatiserad pipett för att säkerställa konsekvent analysvolym över brunnarna. Släck lamporna eller gå in i ett mörkt rum.Lägg till alla 100 mikroliter av utspädda AMC-standarder till en ny brunn med hjälp av en enda brunn för varje standard. I mörker, använd en repeater eller automatiserad pipetter för att lägga till 10 mikroliter av utspädd proteasom substrat till brunnar som innehåller prov- och analysstom men inte AMC-standarden. Placera plattan i plattan läsaren och starta den kinetiska springa.Utföra kvantifiering av olika polyubiquitin taggar i olika subcellulära fraktioner samlas in från gnagare hjärnvävnad med hjälp av en mängd olika standard Western blotting protokoll i kombination med unika länkage-specifika polyubiquitin antikroppar. Vissa ubiquitin Western blot bilder kommer att ge kolumner av distinkta band medan andra producerar utstryk-liknande mönster med få eller inga tydliga linjer. För kvantifiering av avbildade ubiquitin Western blots, rita en låda runt kolumnen som sträcker sig hela molekylära standarder stege.Justera rutan om ubiquitin färgning gör sträcker sig genom hela stegen. Detta är vanligt för lysin 48 modifieringar och varierar kraftigt mellan subcellulära fack. Slutligen subtrahera bakgrunden som beräknas som medelvärdet optisk densitet bakgrunden omedelbart omger kolumnen på alla sidor.Visas här är kvantifiering av proteasom aktivitet i olika fraktioner som samlats in från den laterala amygdala av samma djur. Under in vitro proteasom aktivitetsanalys ökade relativa fluorescerande enheter som upptäckts från början till slutet av analysen i synapsfraktionen, den cytoplasmatiska fraktionen, och kärnfraktionen. Proteasom hämmare beta-lac hindrade RFUs från att förändras över sessionen.Subcellulära skillnader observerades i proteasom aktivitet i laterala amygdala av samma djur. En ökning av nukleär proteasom aktivitet upptäcktes hos utbildade djur i förhållande till kontroller som motsvarade en minskning av aktiviteten inom synaptiska fraktionen. Cytoplasmisk proteasom aktivitet kvar vid baslinjen.Visas här är subcellulära skillnader i länkning-specifika protein ubiquitination i den laterala amygdala av samma djur efter lärande. det fanns en ökning av den totala ubiquitination i nukleära fraktionen efter lärande som korrelerade med en minskning av cytoplasmatiska fraktionen. Efter inlärning ökade linjär ubiquitination i den nukleära fraktionen men inte cytoplasmatiska eller synaptiska fraktioner.Intressant nog ökade K63 ubiquitination i den nukleära fraktionen efter lärande som korrelerade med en minskning av synaptiska fraktionen. Medan K48 uniquitination ökade i nukleära och cytoplasmatiska fraktioner efter lärande men inte i synaptiska fraktionen. Detta protokoll kan också användas för att förstå subcellulär fördelning och funktion av andra proteiner inom samma djur.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Neuroscience

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

Samtidig fMRI och elektrofysiologi hos gnagare Brain

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Kvantifiera aktivitet Cis-Reglerande element i musen Retina av Explantation elektroporation

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Direkt Intraventrikulär tillförsel av läkemedel till Gnagare Centrala nervsystemet

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo optogenetic Stimulering av gnagare centrala nervsystemet

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerasaktivitet i de olika regionerna i Mouse Brain: Ej Radioaktiv Telomeras Upprepa Amplification Protocol (TRAP) analys

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Samtidig elektrofysiologiska inspelning och Micro-injektioner av hämmande medel i Gnagare Brain

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

Personlig nålar för Microinjections i gnagare hjärnan

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Utvärdering av synaps densitet i hippocampus gnagare hjärnan skivor

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Inspelning och modulering av Epileptiform aktivitet i gnagare hjärnan skivor kopplat till mikroelektrod matriser

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Effekter av Blast-inducerad Neurotrauma på trycksatt gnagare mellersta cerebrala artärer

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...