Name: physiologic patient derived 3d spheroids for anti-neoplastic drug screening to target cancer stem cells
Uploaded: 2019-07-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells at JoVE.com

Dit werk wordt voornamelijk ondersteund door de DOD OCRP Early loopbaan onderzoeker Award W81XWH-13-1-0134 (GM), DOD pilot Award W81XWH-16-1-0426 (GM), DOD onderzoeker geïnitieerd Award W81XWH-17-OCRP-IIRA (GM), Rivkin Center voor ovariële kanker en Michigan ovariële kanker Alliantie. Het onderzoek dat in deze uitgave werd gerapporteerd, werd gesteund door het National Cancer Institute van de National Institutes of Health onder het awardnummer P30CA046592. CMN wordt ondersteund door de National Science Foundation Graduate Research Fellowship onder Grant No. 1256260. MEB wordt ondersteund door het departement onderwijs Graduate Assistance in gebieden van National Need (GAANN) Fellowship.

Alle patiënt monsters worden verzameld onder een goedgekeurd IRB-Protocol van instan-patienten, waarvan de monsters zijn geïdentificeerd na tumor deballast stoffen en ascites-verzameling.
1. generatie van Spheroids uit kleine Celaantallen in 384-goed hangende drop platen
<ol><li>Plaats de hangende druppel plaat in een sonicator gevuld met steriel gedeïoniseerd (di) water en sonificeren gedurende 20 min.</li>
	<li>Met een handschoenen, verwijder de plaat van de sonicator en was het met str...

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> All cancers Source: Globocan. , (2018).</li><li>Prasad, V., Mailankody, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+and+Development+Spending+to+Bring+a+Single+Cancer+Drug+to+Market+and+Revenues+After+Approval.">Research and Development Spending to Bring a Single Cancer Drug to Market and Revenues After Approval.</a> JAMA Internal Medicine. 177, 1569-1575 (2017).</li><li>Raghavan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+Medicine+Based+Approach+to+Model+Patterns+of+Chemoresistance+and+Tumor+Recurrence+Using+Ovarian+Cancer+Stem+Cell+Spheroids.">Personalized Medicine Based Approach to Model Patterns of Chemoresistance and Tumor Recurrence Using Ovarian Cancer Stem Cell Spheroids.</a> Clinical Cancer Research. 23 (22), 6934-6945 (2017).</li><li>Jordan, C. T., Guzman, M. L., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Stem+Cells.">Cancer Stem Cells.</a> New England Journal of Medicine. 355, 1253-1261 (2006).</li><li>Ishiguro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+Characterization+of+an+In+Vitro+Model+of+Ovarian+Cancer+Stem-like+Cells+with+an+Enhanced+Proliferative+Capacity.">Establishment and Characterization of an In Vitro Model of Ovarian Cancer Stem-like Cells with an Enhanced Proliferative Capacity.</a> Cancer Research. 76, 150-160 (2016).</li><li>P&#225;ez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Dormancy:+A+Model+of+Early+Dissemination+and+Late+Cancer+Recurrence.">Cancer Dormancy: A Model of Early Dissemination and Late Cancer Recurrence.</a> Clinical Cancer Research. 18, 645-653 (2012).</li><li>Ahmed, N., Stenvers, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+Know+Ovarian+Cancer+Ascites:+Opportunities+for+Targeted+Therapy-Based+Translational+Research.">Getting to Know Ovarian Cancer Ascites: Opportunities for Targeted Therapy-Based Translational Research.</a> Frontiers in Oncology. 3, (2013).</li><li>Pradhan, S., Clary, J. M., Seliktar, D., Lipke, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+spheroidal+cancer+model+based+on+PEG-fibrinogen+hydrogel+microspheres.">A three-dimensional spheroidal cancer model based on PEG-fibrinogen hydrogel microspheres.</a> Biomaterials. 115, 141-154 (2017).</li><li>Varna, M., Bertheau, P., Legr&#232;s, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Microenvironment+in+Human+Tumor+Xenografted+Mouse+Models.">Tumor Microenvironment in Human Tumor Xenografted Mouse Models.</a> Journal of Analytical Oncology. 3, 159-166 (2014).</li><li>Huang, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+microfluidic+cell+culture+system+for+high-throughput+perfusion+three-dimensional+cell+culture-based+assays:+Effect+of+cell+culture+model+on+the+results+of+chemosensitivity+assays.">An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: Effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays.</a> Lab on a Chip. 13, 1133-1143 (2013).</li><li>Zang, R., Li, D., Tang, I. C., Wang, J., Yang, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Based+Assays+in+High-Throughput+Screening+for+Drug+Discovery.">Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery.</a> International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. , (2012).</li><li>Murphy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+alternative+in+vivo+drug+screening+methodology:+a+single+mouse+analysis.">Evaluation of alternative in vivo drug screening methodology: a single mouse analysis.</a> Cancer Research. 76, 5798-5809 (2016).</li><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+Xenograft+models:+An+emerging+platform+for+translational+cancer+research.">Patient-derived Xenograft models: An emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).</li><li>Damiati, S., Kompella, U. B., Damiati, S. A., Kodzius, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+drug+delivery+systems+and+drug+screening.">Microfluidic devices for drug delivery systems and drug screening.</a> Genes. 9, (2018).</li><li>Caliari, S. R., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Practical+Guide+to+Hydrogels+for+Cell+Culture.">A Practical Guide to Hydrogels for Cell Culture.</a> Nature Methods. 14, 69-81 (2016).</li><li>Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+for+use+of+tumor+spheroids+as+models+to+test+drug+delivery+and+efficacy.">Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy.</a> Journal of Control Release. , (2012).</li><li>Mehta, P., Novak, C., Raghavan, S., Ward, M., Mehta, G., Papaccio, G., Desiderio, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Renewal+and+CSCs+In+Vitro+Enrichment:+Growth+as+Floating+Spheres.">Self-Renewal and CSCs In Vitro Enrichment: Growth as Floating Spheres.</a> Cancer Stem Cells: Methods and Protocols. , 61-75 (2018).</li><li>Raghavan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+stable+small+cell+number+three-dimensional+ovarian+cancer+spheroids+using+hanging+drop+arrays+for+preclinical+drug+sensitivity+assays.">Formation of stable small cell number three-dimensional ovarian cancer spheroids using hanging drop arrays for preclinical drug sensitivity assays.</a> Gynecologic Oncology. 138, 181-189 (2015).</li><li>Raghavan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+tumor+spheroid+generation+techniques+for+differential+in+vitro+drug+toxicity.">Comparative analysis of tumor spheroid generation techniques for differential in vitro drug toxicity.</a> Oncotarget. 7, 16948-16961 (2016).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+Tumor+Evolution+via+Genomic+Profiling+of+Individual+Tumor+Spheroids+in+a+Malignant+Ascites.">Evaluating Tumor Evolution via Genomic Profiling of Individual Tumor Spheroids in a Malignant Ascites.</a> Scientific Reports. 8, 1-11 (2018).</li><li>Silva, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase+in+combination+with+CD133+defines+angiogenic+ovarian+cancer+stem+cells+that+portend+poor+patient+survival.">Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival.</a> Cancer Research. 71, 3991-4001 (2011).</li><li>Pulaski, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+alemtuzumab+as+an+anti-myeloid+cell+antiangiogenic+therapy+for+the+treatment+of+ovarian+cancer.">Identifying alemtuzumab as an anti-myeloid cell antiangiogenic therapy for the treatment of ovarian cancer.</a> Journal of Translational Medicine. 7, 49 (2009).</li><li>Jager, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+enzymatic+and+mechanical+methods+of+dissociation+on+neural+progenitor+cells+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells.</a> Advances in Medical Sciences. 61, 78-84 (2016).</li><li>Ivanov, D. P., Grabowska, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+arrays+for+high-throughput+single-cell+analysis+of+spatial+patterns+and+biomarker+expression+in+3D.">Spheroid arrays for high-throughput single-cell analysis of spatial patterns and biomarker expression in 3D.</a> Scientific Reports. 7, 41160 (2017).</li></ol>

Het 384-well Hanging drop Plate-platform voor 3D-spheroid-formatie is een eenvoudig te implementeren tool voor elke celbiologie of Kankerbiologie Labs. Dit fysiologisch platform maakt de studie van cellijnen, evenals, primaire patiënt monsters binnen fysiologisch relevante 3D-culturen mogelijk, terwijl het een hoge doorvoer van drugs screening toestaat. Het platform zorgt er ook voor dat de cultuuromstandigheden sterk instelbaar zijn, waardoor een strakke controle over de dichtheden, celcocultuurverhoudingen, extracellu...

Wereldwijde kankergerelateerde sterfte bereikte een tol van 9.800.000 sterfgevallen in 20181, met de nadruk op de noodzaak voor de ontwikkeling van verbeterde Therapeutics. Helaas, de kosten van het ontwikkelen van kanker drugs neemt toe, met de ontwikkeling van een enkele drug kost ongeveer 650.000.000 USD2 wijst op de noodzaak van verbeterde strategieën voor de ontwikkeling van nieuwe anti-kanker drugs. Kanker stamcellen (CSCs), die worden gekenmerkt door verhoogde chemoresistance3, de capaciteit om zichzelf te verlengen, en het vermogen om nieuwe tumoren zaad4 worden verondersteld te zijn verantwoordelijk voor tumor recidief4, metastase5, en chemoresistance4,6, die allemaal bijdragen aan de kwaadaardige capaciteit van de tumor en dus de hoge dood tol. Bij eierstokkanker worden deze cellen verrijkt in de maligne ascites vloeistof in de peritoneale Holte, een aandoening die gepaard gaat met slechte klinische uitkomsten1. Als gevolg van de kwaadaardige capaciteiten van CSCs, is er een duw geweest om nieuwe CSC-targeting te ontwikkelen die in combinatie met traditionele chemotherapieën wordt gebruikt. Er zijn verschillende uitdagingen die gepaard gaan met de ontwikkeling van CSC-targeting op drugs, waaronder: 1) moeilijkheden bij het uitbreiden en onderhouden van CSCs in vitro; 2) schaarste van de patiënt monsters; 3) fysiologische relevantie van het cultuurplatform; en 4) heterogeniteit in geneesmiddel gevoeligheid tussen patiënten. Dit protocol schetst de implementatie van een 3D-cultuurplatform met hoge doorvoer dat elk van deze uitdagingen kan overwinnen. Met name dit systeem zorgt voor een snelle geneesmiddelen screening met behulp van kleine aantallen patiënt-afgeleide ovariële CSCs, en is zeer vatbaar voor downstream analysetechnieken. Hoewel ideaal voor het bestuderen van ovariële kanker en CSCs, is ons platform ook waardevol bij het bestuderen van andere kankers en gedifferentieerde celtypen in complexe 3D-omgevingen.
Complexe 3-dimensionale (3D) modellen zijn essentieel in het bestuderen van de tumor micro Environment (TME), dat is een 3D-niche opgebouwd uit kankercellen, niet-kanker ondersteunende cellen, en extracellulaire matrix (ECM) eiwitten4. Deze 3D-omgeving resulteert in unieke celmorfologie, celceldeling en celmatrix interacties, celdifferentiatie, Celmigratie, celdichtheid en diffusie gradiënten in vergelijking met traditionele 2D-celkweek in vitro4. Al deze factoren culmineren in differentiële drug Response binnen 3D-culturen, exposeren verhoogde drug resistentie en fysiologische relevantie7,8. Vanwege de rol van de 3D-TME in CSC-differentiatie en chemoresistance, is het essentieel om te schermen voor CSC-targeting op drugs in fysiologische micro-omgevingen. Verbetering van de fysiologische relevantie van CSC drug screening platforms heeft het potentieel om patiënt specifieke drug screening te verbeteren, ontwikkeling van geneesmiddelen, formulering van behandelingsstrategieën, en uiteindelijk klinische uitkomsten. Het is net zo belangrijk dat het platform dat wordt gebruikt voor het screenen van geneesmiddelen een hoge doorvoer is en compatibel is met downstream-analysemethoden om kosten, tijd en klinische Vertaal tijd van veelbelovende medicijnen te minimaliseren9.
Op dit moment, het complex TME is het best onderhouden voor drug screening toepassingen door middel van in vivo modellen zoals Murine syngenic tumor modellen, cellijn-afgeleide xenografts, en patiënt-afgeleide xenotransplantaatmodellen is (PDX) modellen12, als ze bieden fysiologisch Voorwaarden. Echter, de lage doorvoer aard van deze modellen, evenals de kosten, tijd en technische vaardigheden sets die ze nodig hebben beperkt hun nut in snelle, hoge doorvoer drug screening toepassingen13. Als alternatieven voor deze in vivo modellen, veel in vitro 3D-modellen met behulp van hydrogels8, cultuur binnen microfluïdische apparaten of ' Organ-on-a-chip ' apparaten10,14, en niet-aanhandige culturen3,8 zijn ook ontwikkeld, vanwege hun lage barrière voor toegang in termen van kosten, tijd en vereiste vaardigheden.
Hydrogel cultuur platforms zijn voordelig in de fijne controle die wordt geboden over de matrix samenstelling, mechanische eigenschappen en matrixstructuur15; echter, ze kunnen remmen hoge dichtheid celcultuur14. Bovendien kan het oogsten van cellen uit hydrogels de downstreamanalyse compliceren, als gevolg van mogelijk schadelijke effecten van oogstmethoden15. Microfluïdische apparaten, aan de andere kant, zijn Microscale apparaten die het mogelijk maken voor output detectie binnen hetzelfde apparaat en voor celkweek op fysiologisch relevante weegschalen met minimale consumptie van reagentia, verminderde reactietijd, geminimaliseerd afval, en Rapid Diffusion14. Deze kenmerken maken ze veelbelovende platforms voor het onderzoeken van drug toxiciteit, werkzaamheid, en farmacokinetiek. Echter, de uitdagingen van efficiënte, kwantificeerbare, reproduceerbare en gebruiksvriendelijke 3D-celcultuur, evenals, omvangrijke en dure pompsystemen hebben beperkt microfluïdische toepassingen in high-throughput Research10. Efficiënte detectie opstellingen en mogelijk moeilijke implementatie op verschillende terreinen hebben ook de wijdverbreide acceptatie van microfluïdische systemen10belemmerd.
In tegenstelling tot het ontstaan van sferoïden in niet-aanhangende omstandigheden in roterende mixers (nutators), Ultra-Low-bevestigings platen en hangende druppels worden geen door de gebruiker gedefinieerde matrix componenten opgenomen. Deze methodologieën zijn vooral relevant voor het bestuderen van ovariële kanker, aangezien de niet-aanhandende omstandigheden representatief zijn voor de omstandigheden waarin sferoïden binnen de peritoneale holte5groeien. Binnen deze niet-aanhangende kweekmethoden is aangetoond dat nutator en hangende valsspheroids een hogere verdichting, herinrichting en chemoresistance vertonen in vergelijking met sferoïden die in uiterst lage bevestigings platen worden gegenereerd, wat suggereert dat er meer fysiologische relevantie16,17,18,19. Door de toegenomen capaciteit voor screening met hoge doorvoer van kleinere goed groottes en minimale vereiste celaantallen is spheroid-generatie in hangende drop platen een ideaal platform voor geneesmiddelen screening. Hier presenteren we een instelbaar 3D-fysiologisch platform in 384-goed hangende druppel platen, die gemakkelijk te implementeren en zeer vatbaar zijn voor downstream-analyse, waardoor het ideaal is voor een hoge doorvoer van drug screening van eierstokkanker en ovariële CSCs.
Ons 3D-fysiologisch platform biedt alle voordelen van 3D-cultuur, waaronder fysiologische celcelcontacten, diffusie gradiënten, celdichtheden en natuurlijk geproduceerde ECM-eiwitten, die kunnen bijdragen aan realistische geneesmiddel responsen16, 17,18,19. Bovendien kunnen we, door deze sferoïden te genereren met door de patiënt afgeleide CSCS, patiënt specifieke reacties op drugs1 vaststellen met veel technische replicaten tegelijkertijd, om heterogeniteit te overwinnen die kan worden gevonden binnen de tumor van de patiënt voorbeelden20. Bovendien is aangetoond dat 3D-cultuur het onderhoud van de CSC-populaties3,16 verbetert en dus representatief is voor de verrijkte CSC-populaties in de ascites7. Dit gecombineerd met eenvoudige downstream analyse, met inbegrip van flow cytometrie analyse van de levensvatbaarheid en CSC-verhoudingen zorgt voor een optimale evaluatie van CSC targeting drug werkzaamheid. Ten slotte is dit fysiologisch platform compatibel met Imaging op meerdere tijdstippen tijdens het experiment, evaluatie van celdood en proliferatie, celorganisatie en morfologie met immunohistochemie, oplosbare signalering met ELISA op geconditioneerde medium, celfenotypes met Flowcytometrie en genexpressie na PCR.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>ILT25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10,000 cSt Si oil</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>63148-62-9</td>
			<td>Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm tissue culture dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>130182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tube</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>FL4021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X DMEM for Serum Free Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X F12 for Serum Free Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>ILT10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies Inc.</td>
			<td>1449</td>
			<td>A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alamarBlue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>DAL1025</td>
			<td>Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALDEFLUOR assay kit</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>1700</td>
			<td>Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB)</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>1705</td>
			<td>Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor iXon x3 CCD Camera</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics and Antimycotics</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-isotype IgG2b</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-092-217</td>
			<td>Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>basic Fibroblast Growth Factor</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>78003.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy HT Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>7091000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD133-APC</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-113-184</td>
			<td>Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens Dimension Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4394</td>
			<td>Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS XL Core Cell Imaging System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AME3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - premium (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histogel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC2543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead viability kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td>Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph 7.8 Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX83 Research Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>7315D35</td>
			<td>Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates</td>
			<td>3D Biomatrix</td>
			<td>HDP1384-8</td>
			<td>Available through Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phalloidin AlexaFluor488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProJet 3500 HD Max</td>
			<td>3D Systems</td>
			<td>-</td>
			<td>3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile DI water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiJet M3 Crystal</td>
			<td>3D Systems</td>
			<td>-</td>
			<td>A biocompatible polymer material for 3D printing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

physiologic patient derived 3d spheroids for anti-neoplastic drug screening to target cancer stem cells

In dit protocol schetsen we de procedure voor het genereren van tumor sferoïden binnen 384-goed hangende druppeltjes om een high-throughput screening van anti-kankertherapieën mogelijk te maken in een fysiologisch representatieve micro-omgeving. We schetsen de vorming van patiënten afgeleide Kanker stamcel sferoïden, evenals, de manipulatie van deze sferoïden voor grondige analyse na medicamenteuze behandeling. Concreet beschrijven we de verzameling van spheroid-morfologie, proliferatie, levensvatbaarheid, geneesmiddeltoxiciteit, celfenotype en lokalisatiegegevens van cellen. Dit protocol richt zich sterk op analysetechnieken die eenvoudig worden geïmplementeerd met het 384-well Hanging drop-platform, waardoor het ideaal is voor een hoge doorvoer van drugs screening. Terwijl we benadrukken het belang van dit model in ovariële kanker studies en kanker stamcelonderzoek, de 384-well platform is vatbaar voor onderzoek van andere soorten kanker en ziekte modellen, uitbreiding van het nut van het platform om vele gebieden. Door de snelheid van gepersonaliseerde geneesmiddelen screening en de kwaliteit van screening resultaten te verbeteren door eenvoudig te implementeren fysiologisch representatieve 3D-culturen, wordt dit platform voorspeld om te helpen bij de ontwikkeling van nieuwe therapieën en patiëntspecifieke behandelstrategieën en hebben zo een brede klinische impact.

Spheroids gevormd met cellijnen of door de patiënt afgeleide CSCs kunnen worden gevormd met een reeks kleine celaantallen binnen hangende druppeltjes (Figuur 2a). Spheroids vormen betrouwbaar met slechts 10 cellen per put, waardoor zeldzame patiënt monsters kunnen worden beschermd. Cellen binnen deze sferoïden zijn omgeven door andere cellen in 3 dimensies zoals ze zouden zijn in vivo, waardoor fysiologisch celcelcontacten en diffusie percentages. Tumor cellen binnen de spheroïden prolif...

Watch this Scientific Journal Video about Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells at JoVE.com

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Fysiologisch patiënt afgeleide 3D-Spheroids voor anti-neoplastische geneesmiddelen screening om kanker stamcellen te targeten

Dit protocol beschrijft het genereren van door patiënten afgeleide spheroïden en downstreamanalyses, waaronder de kwantificering van proliferatie, cytotoxiciteits testen, Flowcytometrie, immunofluorescentie kleuring en confocale beeldvorming, om de geneesmiddelen te beoordelen potentiële kandidaten als anti-neoplastische Therapeutics. Dit protocol ondersteunt precisie geneeskunde met identificatie van specifieke geneesmiddelen voor elke patiënt en stadium van de ziekte.

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Ons protocol biedt een eenvoudige methode voor 3D-celcultuur en is zeer vatbaar voor downstream-analyse. Dit vergemakkelijkt de evaluatie van heterogene patiëntmonsters en hun specifieke medicijnreacties. Het voordeel van deze techniek is dat sferoïden kunnen worden gevormd uit kleine celnummers, waardoor zowel het behoud van schaarse primaire monsters als een hoge doorvoerscreening op patiëntspecifieke medicijnreacties mogelijk is.De opknoping drop model creëert een fysiologische omgeving met 3D-drug diffusie en doet reacties die overeenkomen met tumor stadium. Dit maakt de ontwikkeling van gerichte therapieën en patiëntspecifieke behandelingen mogelijk. Deze methode is ideaal voor het bestuderen van eierstokkanker, heterogeniteit en de ontwikkeling van chemoresistentie.Het kan echter ook worden gebruikt om andere vormen van kanker en resistente celpopulaties te bestuderen. Bij het plating van sferoïden is het belangrijk om precieze volumes te pipetten. Dit zorgt voor consistentie tussen sferoïden.De sferoïden en hun respectieve druppels zijn inherent kwetsbaar en gemakkelijk verloren zonder de juiste behandeling, daarom zullen we laten zien hoe op de juiste manier plaat, onderhouden en analyseren van een opknoping drop plaat. Het aantonen van deze procedure zal Michael Bregenzer, een afgestudeerde student van ons laboratorium. Begin met het vullen van elke put van de zes-put plaat met vier tot vijf milliliter autoclave gedeïmiseerd water en sandwiching de opknoping druppelplaat tussen het deksel en de onderkant van de plaat.Voeg 800 tot 1000 microliter water toe rond de rand van de hangende druppelplaat om een vochtige omgeving te bieden en verdamping te minimaliseren. Verzamel vervolgens 2D-volwassen cellen door ze los te maken met trypsine en voeg vervolgens zes of acht milliliter medium toe dat FBS bevat. Aspirate de cellen met de 10 milliliter serologische pipet, en deponeren ze in een 15 milliliter conische buis.Gebruik een hemocytometer om de cellen te tellen. Bereid celsuspensie volgens manuscriptaanwijzingen voor en meng voorzichtig met de pipet om een homogene verdeling te garanderen. Plaats de punt van de pipet in de put onder een hoek van 45 graden en pipet 20 microliter suspensie in elke opknoping drop goed.Plaats het deksel van de zes-put plaat terug op en gebruik een rekbare thermoplastische strip om de randen te verzegelen. Incubeer in een standaard koolstofdioxide bevochtigde couveuse en voeden de opknoping druppels om de twee tot drie dagen door het toevoegen van twee tot drie microliter van celcultuur medium aan elke sferoïde-bevattende put. Om proliferatie en levensvatbaarheid van de cellen te kwantificeren, voeg twee microliters van gefilterde resazurin-gebaseerde oplossing toe aan de putten die zijn aangewezen voor proliferatieanalyse en incuberen volgens de hand van het manuscript.Na de incubatietijd opent u de hangval sandwich in een bioveiligheidskast en breng de 384 putplaat met het deksel nog op zijn plaats naar de plaatlezer. Plaats het in de plaatlezer en lees de plaat. Sla het experiment op in het pop-upvenster en exporteer de gegevens naar een spreadsheet.Breng de plaat terug naar de zes-put basis en plaats deze in de couveuse. Zodra alle tijd punten zijn gelezen voor de dag, opnieuw verdringing van de plaat voor het uitbroeden. Om sferoïden voor te bereiden op flow cytometrie analyse, gebruik een 1000 microliter pipet om ze te verzamelen van elke put en deponeren ze in een 15 milliliter conische buis voor disaggregatie.Aliquot cel suspensie in vijf micro centrifuge buizen, zodat elke buis bevat ten minste 50,000 cellen. Centrifugeer de buizen op 400 keer G gedurende vijf minuten in een microcentrifuge, dan aspirate de supernatant en re-suspend pellets in 100 microliters van Aldefluor buffer. Label de buizen volgens de handschriftaanwijzing.Voeg 0,5 microliter APC-isotypeantilichaam toe aan de APC ISO-buis en één microliter CD133-antilichaam aan de ALDH CD133-buis. Voeg vervolgens vijf microliter DEAB-reagens en 0,5 microliter ALDH toe aan de DEAB-buis en één microliter ALDH aan de ALDH CD133-buis. Vortex alle buizen voor een paar seconden en incubeer ze op 37 graden Celsius gedurende 45 minuten.Na de incubatie, vortex alle buizen weer en centrifugeren ze op 400 keer G gedurende vijf minuten. Label FACS buizen volgens manuscriptaanwijzingen en vul een geïsoleerde schuimcontainer met ijs. Aspirate de supernatant van de microcentrifuge buizen.Schort vervolgens de niet-bevlekte besturing opnieuw op in 400 microliter facs-buffer en de rest van de cellen in 400 microliters van FACS DAPI-buffer. Plaats de buizen op het ijs totdat ze kunnen worden geanalyseerd op een stroom cytometer. Gebruik FlowJo om de gegevens uit de stroomcytometer te analyseren.Dubbelklik op het niet-vastgehouden bestand en stel de Y-as in op zijverstrooiingshoogte of SSCH en de X-as op voorwaartse spreidingshoogte of FSCH. Klik op de T-knop naast elke as om de schaal aan te passen en de scheiding tussen verschillende celpopulaties te maximaliseren. Klik vervolgens op de polygoon gating-knop, teken veelhoekpoort rond de celpopulatie en label de populatie cellen.Dubbelklik op de populatie van de cel in de werkruimte en wijzig de FSC-as in FSC-breedte en de SSC-as in de FSC-hoogte. Kies de rechthoekpoort om alleen een rechthoek te tekenen rond de meest linkse dichte populatie cellen, die de gehele Y-as overspant. Label deze poort Enkele Cellen.Klik vervolgens met de rechtermuisknop en kopieer deze cellen in de geneste poort met één cellen en plak ze onder elk voorbeeld in de werkruimte. Dubbelklik op de poort met één cellen die is genest onder het DAPI-monster om de populatie van één cel van die steekproefbuis weer te geven. Wijzig het FSC-askanaal in het DAPI-gebiedskanaal en wijzig het SSC-askanaal in histogram.Klik op de T-knop naast de DAPI-as en klik op As aanpassen om de schaal aan te passen en de scheiding tussen dapi-positieve en DAPI-negatieve pieken te maximaliseren. Klik op Toepassen in het pop-upvenster en kies de knop Bereikgate. Verspreid het over de DAPI negatieve piek en label deze poort Live Cells.Kopieer de poort van levende cellen en plak deze onder de single cells-poort, onder de APC ISO DEAB- en ALDH CD133-buizen, om hetzelfde gedeelte levende cellen in elke buis te selecteren. Dubbelklik vervolgens op de populatie Levende cellen die is genest onder het APC ISO-voorbeeldbestand en schakel de X-as over naar ALDH-gebied en de Y-as naar APC-gebied. Breng Kwadrant Poort en pas de kruising van de poort, zoals dat ongeveer 0,5% van de bevolking ligt in de linkerbovenhoek van het perceel venster.Geef vervolgens de kwadranten naar wens, kopieer en plak vervolgens de kwadrantpoorten op de populatie levende cellen die zich onder het DEAB-bestand nestelen en pas de verticale lijn aan zodat ongeveer 0,15% van de celpopulatie binnen het positief kwadrant van ALDH ligt. Ten slotte, kopiëren en plakken van de kwadrant poorten naar de ALDH CD133 bestanden Live Cells bevolking en evaluatie kanker stamcel verhoudingen op basis van ALDH en CD133 verhoudingen. Dit protocol kan worden gebruikt voor een hoge doorvoeranalyse van door patiënten afgeleide kankerstamcellen.Zo weinig als 10 cellen per put kan vormen betrouwbare sferoïden en als de cellen vermenigvuldigen, de sferoïden uit te breiden in omvang. Proliferatiecapaciteit kan gemakkelijk worden gekwantificeerd met een resazurin-gebaseerde florescentietest. Het effect van geneesmiddelen op sferoïde morfologie kan worden gevisualiseerd met fasecontrastbeeldvorming en gekwantificeerd door resazurine florescentie te vergelijken in onbehandelde en behandelde cellen.Celdood kan worden gevalideerd via toevoeging van Calcein-AM en ethidium homodimer I aan sferoïden, gevolgd door beeldvorming op een confocale microscoop. Ten slotte kunnen sferoïden worden geoogst en verspreid in een suspensie van één cel voor analyse met stroomcytometrie, waardoor het mogelijk is om de effectiviteit van verschillende medicamenteuze behandelingen op specifieke celpopulaties te onderscheiden. Om druppelverlies, gemiddelde verdamping en variatie in sferoïde grootte te voorkomen, is het belangrijk om zorgvuldig met uw platen om te gaan, pipet met precisie te hanteren en uw hangende valplaten volledig te verzegelen.Om veranderingen in genexpressie en oplosbare signalering als gevolg van medicamenteuze behandeling te evalueren, kunnen rna-sequencing met één cel en enzymgebonden immunosorbenttesten worden gebruikt om de ontwikkeling van therapieën te vergemakkelijken. Deze techniek maakt het mogelijk onderzoeken in oncologie, precisiegeneeskunde en medicijnontwikkeling om intra- en inter-patiëntheterogeniteit te onderzoeken en chemoresistentie door middel van een hoge doorvoer drug screening van kleine biopten. Draag bij het uitvoeren van dit protocol alle standaard persoonlijke beschermingsmiddelen.Inclusief handschoenen, veiligheidsbrillen, labjassen, broeken en schoenen van dichtbij.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generatie van High-Throughput driedimensionale Tumor spheroïden voor Drug Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modelleren van osteosarcoom met behulp van Li-Fraumeni syndroom geïnduceerde pluripotente stamcellen patiënt-afgeleide cellen

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Drug Screening van primaire patiënt afgeleid tumor Xenografts bij zebravissen

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

Patiënt-afgeleide tumor explanteert als een "live" preklinisch platform voor het voorspellen van medicijnresistentie bij patiënten

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Een snelle screeningsworkflow om potentiële combinatietherapie voor GBM te identificeren met behulp van patiënt-afgeleide glioomstamcellen

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Onderzoek naar mitochondriaal energiemetabolisme van enkelvoudige 3D-microtissue-sferoïden met behulp van extracellulaire fluxanalyse

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

Gepoolde shRNA-bibliotheekscreening om factoren te identificeren die een fenotype van medicijnresistentie moduleren

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Het vaststellen van 3-dimensionale sferoïden uit van de patiënt afgeleide tumormonsters en het evalueren van hun gevoeligheid voor geneesmiddelen

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Orthotope implantatie van patiënt-afgeleide kankercellen bij muizen recapituleert gevorderde colorectale kanker

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies

Generatie van 3D-tumorsferoïden voor geneesmiddelenevaluatiestudies

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the ...