Name: physiologic patient derived 3d spheroids for anti-neoplastic drug screening to target cancer stem cells
Uploaded: 2019-07-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells at JoVE.com

Ce travail est soutenu principalement par DOD OCRP Early Career Investigator Award W81XWH-13-1-0134(GM), DOD Pilot award W81XWH-16-1-0426 (GM), DOD Investigator Initiated award W81XWH-17-OCRP-IIRA (GM), Rivkin Center for Ovarian Cancer and Michigan Ovarian Cancer alliance. La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par l'Institut national du cancer des Instituts nationaux de la santé sous le numéro de récompense P30CA046592. Le CMN est appuyé par la Bourse de recherche des diplômés de la National Science Foundation dans le cadre de la subvention no 1256260. Le MEB est soutenu par le Département de l'aide aux diplômés du ministère de l'Éducation dans les domaines de la bourse des besoins nationaux (GAANN).

Tous les échantillons de patients sont prélevés en vertu d'un protocole approuvé de la CISR auprès de patients consentants, dont les échantillons sont dé-identifiés après la collecte de la tumeur et des ascites.
1. Génération de sphéroïdes à partir de petits nombres de cellules dans 384-puits Hanging Drop Plates
<ol><li>Placez la plaque de chute suspendue dans un sonicator rempli d'eau déionisée stérile (DI) et sonicate pendant 20 min.</li>
	<li>À l'intérieur d'une main ga...

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> All cancers Source: Globocan. , (2018).</li><li>Prasad, V., Mailankody, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+and+Development+Spending+to+Bring+a+Single+Cancer+Drug+to+Market+and+Revenues+After+Approval.">Research and Development Spending to Bring a Single Cancer Drug to Market and Revenues After Approval.</a> JAMA Internal Medicine. 177, 1569-1575 (2017).</li><li>Raghavan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+Medicine+Based+Approach+to+Model+Patterns+of+Chemoresistance+and+Tumor+Recurrence+Using+Ovarian+Cancer+Stem+Cell+Spheroids.">Personalized Medicine Based Approach to Model Patterns of Chemoresistance and Tumor Recurrence Using Ovarian Cancer Stem Cell Spheroids.</a> Clinical Cancer Research. 23 (22), 6934-6945 (2017).</li><li>Jordan, C. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+Know+Ovarian+Cancer+Ascites:+Opportunities+for+Targeted+Therapy-Based+Translational+Research.">Getting to Know Ovarian Cancer Ascites: Opportunities for Targeted Therapy-Based Translational Research.</a> Frontiers in Oncology. 3, (2013).</li><li>Pradhan, S., Clary, J. M., Seliktar, D., Lipke, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+spheroidal+cancer+model+based+on+PEG-fibrinogen+hydrogel+microspheres.">A three-dimensional spheroidal cancer model based on PEG-fibrinogen hydrogel microspheres.</a> Biomaterials. 115, 141-154 (2017).</li><li>Varna, M., Bertheau, P., Legr&#232;s, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Microenvironment+in+Human+Tumor+Xenografted+Mouse+Models.">Tumor Microenvironment in Human Tumor Xenografted Mouse Models.</a> Journal of Analytical Oncology. 3, 159-166 (2014).</li><li>Huang, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+microfluidic+cell+culture+system+for+high-throughput+perfusion+three-dimensional+cell+culture-based+assays:+Effect+of+cell+culture+model+on+the+results+of+chemosensitivity+assays.">An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: Effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays.</a> Lab on a Chip. 13, 1133-1143 (2013).</li><li>Zang, R., Li, D., Tang, I. C., Wang, J., Yang, S. 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D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+for+use+of+tumor+spheroids+as+models+to+test+drug+delivery+and+efficacy.">Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy.</a> Journal of Control Release. , (2012).</li><li>Mehta, P., Novak, C., Raghavan, S., Ward, M., Mehta, G., Papaccio, G., Desiderio, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Renewal+and+CSCs+In+Vitro+Enrichment:+Growth+as+Floating+Spheres.">Self-Renewal and CSCs In Vitro Enrichment: Growth as Floating Spheres.</a> Cancer Stem Cells: Methods and Protocols. , 61-75 (2018).</li><li>Raghavan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+stable+small+cell+number+three-dimensional+ovarian+cancer+spheroids+using+hanging+drop+arrays+for+preclinical+drug+sensitivity+assays.">Formation of stable small cell number three-dimensional ovarian cancer spheroids using hanging drop arrays for preclinical drug sensitivity assays.</a> Gynecologic Oncology. 138, 181-189 (2015).</li><li>Raghavan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+tumor+spheroid+generation+techniques+for+differential+in+vitro+drug+toxicity.">Comparative analysis of tumor spheroid generation techniques for differential in vitro drug toxicity.</a> Oncotarget. 7, 16948-16961 (2016).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+Tumor+Evolution+via+Genomic+Profiling+of+Individual+Tumor+Spheroids+in+a+Malignant+Ascites.">Evaluating Tumor Evolution via Genomic Profiling of Individual Tumor Spheroids in a Malignant Ascites.</a> Scientific Reports. 8, 1-11 (2018).</li><li>Silva, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase+in+combination+with+CD133+defines+angiogenic+ovarian+cancer+stem+cells+that+portend+poor+patient+survival.">Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival.</a> Cancer Research. 71, 3991-4001 (2011).</li><li>Pulaski, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+alemtuzumab+as+an+anti-myeloid+cell+antiangiogenic+therapy+for+the+treatment+of+ovarian+cancer.">Identifying alemtuzumab as an anti-myeloid cell antiangiogenic therapy for the treatment of ovarian cancer.</a> Journal of Translational Medicine. 7, 49 (2009).</li><li>Jager, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+enzymatic+and+mechanical+methods+of+dissociation+on+neural+progenitor+cells+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells.</a> Advances in Medical Sciences. 61, 78-84 (2016).</li><li>Ivanov, D. P., Grabowska, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+arrays+for+high-throughput+single-cell+analysis+of+spatial+patterns+and+biomarker+expression+in+3D.">Spheroid arrays for high-throughput single-cell analysis of spatial patterns and biomarker expression in 3D.</a> Scientific Reports. 7, 41160 (2017).</li></ol>

La plate-forme de plaque de chute suspendue de 384 puits pour la formation sphéroïde 3D est un outil facile à implémenter pour n'importe quel laboratoire de biologie cellulaire ou de biologie du cancer. Cette plate-forme physiologique permet l'étude des lignées cellulaires, ainsi que des échantillons de patients primaires dans des cultures 3D physiologiquement pertinentes tout en permettant le dépistage à haut débit des médicaments. La plate-forme garantit également que les conditions de culture sont très r?...

La mortalité liée au cancer dans le monde a atteint un bilan de 9,8 millions de décès en 20181, soulignant la nécessité de développer des thérapies améliorées. Malheureusement, le coût du développement de médicaments contre le cancer augmente, la mise au point d'un seul médicament coûtant environ 650 millions de dollars US2 indiquant la nécessité d'améliorer les stratégies pour mettre au point de nouveaux médicaments anticancéreux. Les cellules souches cancéreuses (CSC), qui sont caractérisées par une chimiorésistance accrue3, la capacité d'auto-renouvellement, et la capacité de semer de nouvelles tumeurs4 sont pensés pour être responsables de la récurrence tumorale4, métastes5, et chemoresistance4,6, qui contribuent tous à la capacité maligne de la tumeur et donc le nombre élevé de décès. Dans le cancer de l'ovaire, ces cellules se trouvent enrichies dans le liquide ascites malins dans la cavité péritonéale, une condition associée à de mauvais résultats cliniques1. En raison des capacités malignes des CSC, on a tenté de mettre au point de nouveaux médicaments ciblant le SCC à utiliser en conjonction avec les chimiothérapies traditionnelles. Plusieurs défis accompagnent le développement de médicaments ciblant le SCC, notamment : 1) la difficulté d'étendre et de maintenir les CSC in vitro; 2) rareté des échantillons de patients; 3) pertinence physiologique de la plate-forme culturelle; et 4) hétérogénéité dans la sensibilité des médicaments entre les patients. Ce protocole décrit la mise en œuvre d'une plate-forme de culture 3D à haut débit qui peut surmonter chacun de ces défis. En particulier, ce système permet un dépistage rapide des médicaments à l'aide d'un petit nombre de CSC ovariens d'origine du patient, et est très favorable aux techniques d'analyse en aval. Bien qu'idéale pour l'étude du cancer de l'ovaire et des CCS, notre plate-forme est également utile pour étudier d'autres cancers et types de cellules différenciées dans des environnements 3D complexes.
Les modèles tridimensionnels complexes (3D) sont essentiels dans l'étude du microenvironnement tumoral (TME), qui est une niche 3D composée de cellules cancéreuses, de cellules de soutien non cancéreuses et de protéines de matrice extracellulaire (ECM)4. Cet environnement 3D se traduit par une morphologie cellulaire unique, des interactions cellule-cellule et cellule-matrice, la différenciation cellulaire, la migration cellulaire, la densité cellulaire et les gradients de diffusion par rapport à la culture cellulaire 2D traditionnelle in vitro4. Tous ces facteurs aboutissent à une réponse différentielle des médicaments dans les cultures 3D, montrant une résistance accrue aux médicaments et une pertinence physiologique7,8. En raison du rôle du TME 3D dans la différenciation et la chimiorésistance du SCC, il est essentiel de dépister les médicaments ciblant le SCC dans les microenvironnements physiologiques. L'amélioration de la pertinence physiologique des plateformes de dépistage des médicaments du SCC a le potentiel d'améliorer le dépistage des médicaments par les patients, le développement de médicaments, la formulation de stratégies de traitement et, en fin de compte, les résultats cliniques. Il est tout aussi important que la plate-forme utilisée pour le dépistage des médicaments soit à haut débit et compatible avec les méthodes d'analyse en aval afin de minimiser le coût, le temps et le temps de traduction clinique des médicaments prometteurs9.
Actuellement, le TME complexe est le meilleur maintenu pour des applications de criblage de drogue par des modèles in vivo tels que des modèles syngénéiques de tumeur murine, les xénogreffes de ligne cellulaire-dérivées, et les modèles de xénogreffe patient-dérivé (PDX)12,car ils fournissent physiologique Conditions. Cependant, la nature à faible débit de ces modèles, ainsi que le coût, le temps et les compétences techniques dont ils ont besoin limitent leur utilité dans les applications rapides et à haut débit de dépistage des médicaments13. Comme alternatives à ces modèles in vivo, de nombreux modèles 3D in vitro utilisant des hydrogels8, la culture dans les dispositifs microfluidiques ou «organe sur puce» dispositifs10,14, et les cultures non-adhérents3,8 ont également été développés, en raison de leur faible obstacle à l'entrée en termes de coût, de temps et de compétences requises.
Les plates-formes de culture hydrogel sont avantageuses dans le contrôle fin accordé sur la composition de matrice, les propriétés mécaniques, et la structure de matrice15; cependant, ils peuvent inhiber la culture cellulaire de haute densité14. En outre, la récolte des cellules à partir d'hydrogels peut compliquer l'analyse en aval, en raison des effets potentiellement nocifs des méthodes de récolte15. Les dispositifs microfluidiques, d'autre part, sont des dispositifs à micro-échelle qui permettent la détection de sortie dans le même dispositif et pour la culture cellulaire à des échelles physiologiquement pertinentes avec une consommation minimale de réactifs, diminution du temps de réaction, minimisation des déchets, et diffusion rapide14. Ces caractéristiques en font des plates-formes prometteuses pour étudier la toxicité, l'efficacité et la pharmacocinétique des médicaments. Cependant, les défis de la culture de cellules 3D efficaces, quantifiables, reproductibles et conviviales, ainsi que des systèmes de pompage volumineux et coûteux ont restreint les applications microfluidiques dans la recherche à haut débit10. Des configurations de détection efficaces et une mise en œuvre potentiellement difficile dans tous les domaines ont également entravé l'adoption généralisée de systèmes microfluidiques10.
En revanche, les sphéroïdes générés dans des conditions non adhérentes dans les mélangeurs rotatifs (nutators), les plaques d'attachement ultra-faibles et les gouttelettes suspendues n'incluent pas les composants de matrice définis par l'utilisateur. Ces méthodologies sont particulièrement pertinentes pour l'étude du cancer de l'ovaire car les conditions non adhérentes sont représentatives des conditions dans lesquelles les sphéroïdes se développent dans la cavité péritonéale5. Dans ces méthodes de culture non-adhérentes, les sphéroïdes de goutte de nutator et de pendaison ont été montrés pour montrer le compaction plus élevé, le remodelage, et la chimiorésistance comparés aux sphérooïdes produits dans les plaques d'attachement ultra-faibles, suggérant physiologique accru pertinence16,17,18,19. En raison de la capacité accrue pour le dépistage à haut débit à partir de plus petites tailles de puits et le nombre minimal requis de cellules, la génération de sphéroïdes dans les plaques de chute suspendues est une plate-forme idéale pour le criblage de drogue. Ici, nous présentons une plate-forme physiologique 3D réglable dans les plaques de chute suspendues de 384 puits, qui est facile à mettre en œuvre et très favorable à l'analyse en aval, ce qui le rend idéal pour le dépistage à haut débit des médicaments contre le cancer de l'ovaire et les CSC ovariens.
Notre plate-forme physiologique 3D fournit tous les avantages de la culture 3D, y compris les contacts physiologiques de cellules-cellules, les gradients de diffusion, les densités de cellules, et les protéines naturellement produites d'ECM, qui peuvent contribuer aux réponses réalistes de drogue16, 17,18,19. En outre, en générant ces sphéroïdes avec les CSC patients-dérivés, nous sommes en mesure de déterminer des réponses spécifiques du patient aux médicaments1 avec de nombreuses répliques techniques simultanément, pour surmonter l'hétérogénéité qui peut être trouvée dans la tumeur patiente échantillons20. En outre, la culture 3D a été montré pour améliorer le maintien des populations csc3,16 et est donc représentatif des populations enrichies CSC dans les ascites7. Ceci combiné à une analyse facile en aval, y compris l'analyse de la cytométrie des débits de viabilité et les proportions du SCC, permet une évaluation optimale de l'efficacité du sCC ciblant les médicaments. Enfin, cette plate-forme physiologique est compatible avec l'imagerie à plusieurs moments au cours de l'expérience, l'évaluation de la mort cellulaire et la prolifération, l'organisation cellulaire et la morphologie avec immunohistochimie, la signalisation soluble avec ELISA sur conditionné phénotypes moyens, cellulaires avec cytométrie de flux, et expression de gène suivant PCR.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>ILT25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10,000 cSt Si oil</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>63148-62-9</td>
			<td>Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm tissue culture dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>130182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tube</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>FL4021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X DMEM for Serum Free Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X F12 for Serum Free Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>ILT10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies Inc.</td>
			<td>1449</td>
			<td>A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alamarBlue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>DAL1025</td>
			<td>Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALDEFLUOR assay kit</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>1700</td>
			<td>Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB)</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>1705</td>
			<td>Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor iXon x3 CCD Camera</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics and Antimycotics</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-isotype IgG2b</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-092-217</td>
			<td>Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>basic Fibroblast Growth Factor</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>78003.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy HT Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>7091000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD133-APC</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-113-184</td>
			<td>Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens Dimension Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4394</td>
			<td>Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS XL Core Cell Imaging System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AME3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - premium (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histogel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC2543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead viability kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td>Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph 7.8 Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX83 Research Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>7315D35</td>
			<td>Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates</td>
			<td>3D Biomatrix</td>
			<td>HDP1384-8</td>
			<td>Available through Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phalloidin AlexaFluor488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProJet 3500 HD Max</td>
			<td>3D Systems</td>
			<td>-</td>
			<td>3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile DI water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiJet M3 Crystal</td>
			<td>3D Systems</td>
			<td>-</td>
			<td>A biocompatible polymer material for 3D printing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

physiologic patient derived 3d spheroids for anti-neoplastic drug screening to target cancer stem cells

Dans ce protocole, nous décrivons la procédure pour la génération des sphéroïdes de tumeur dans les gouttelettes de 384-puits pendantes pour permettre le criblage à haut débit des thérapies anticancéreuses dans un microenvironnement physiologiquement représentatif. Nous décrivons la formation des sphéroïdes dérivés de cellules souches de cancer de patient, aussi bien que, la manipulation de ces sphéroïdes pour l'analyse complète suivant le traitement de drogue. Plus précisément, nous décrivons la collection de la morphologie sphéroïde, la prolifération, la viabilité, la toxicité des médicaments, le phénotype cellulaire et les données de localisation cellulaire. Ce protocole se concentre fortement sur les techniques d'analyse qui sont facilement mises en œuvre à l'aide de la plate-forme de 384 puits de chute suspendue, ce qui le rend idéal pour le dépistage des médicaments à haut débit. Bien que nous soulignions l'importance de ce modèle dans les études sur le cancer de l'ovaire et la recherche sur les cellules souches du cancer, la plate-forme de 384 puits est propice à la recherche sur d'autres types de cancer et modèles de maladies, étendant ainsi l'utilité de la plate-forme à de nombreux domaines. En améliorant la vitesse du dépistage personnalisé des médicaments et la qualité des résultats du dépistage grâce à des cultures 3D facilement représentatives sur le plan physiologique, cette plate-forme devrait faciliter le développement de nouvelles thérapies et de cultures spécifiques aux patients. d'un impact clinique de grande envergure.

Les sphéroïdes formés avec des lignées cellulaires ou des CCS dérivés du patient peuvent être formés avec une gamme de petits nombres de cellules dans les gouttelettes suspendues (Figure 2A). Les sphéroïdes se forment de façon fiable avec aussi peu que 10 cellules par puits, ce qui permet la conservation d'échantillons de patients rares. Les cellules de ces sphéroïdes sont entourées d'autres cellules en 3 dimensions comme elles le seraient in vivo, ce qui permet des contacts c...

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Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Patients physiologiques dérivés sphéroïdes 3D pour le dépistage des médicaments anti-néoplastiques pour cibler les cellules souches cancéreuses

Ce protocole décrit la génération des sphéroïdes patients-dérivés, et l'analyse en aval comprenant la quantification de la prolifération, l'essai de cytotoxicité, la cytométrie de flux, la coloration d'immunofluorescence et l'imagerie confocale, afin d'évaluer le médicament potentiel des candidats en tant que thérapeutique anti-néoplastique. Ce protocole soutient la médecine de précision avec l'identification de médicaments spécifiques pour chaque patient et stade de la maladie.

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Notre protocole fournit une méthode simple pour la culture cellulaire 3D et est très agréable à l’analyse en aval. Cela facilite l’évaluation d’échantillons hétérogènes de patients et de leurs réponses médicamenteuses spécifiques. L’avantage de cette technique est que les sphéroïdes peuvent être formés à partir de petits nombres de cellules, permettant à la fois la conservation d’échantillons primaires rares, et le criblage à haut débit pour les réponses médicamenteuse spécifiques au patient.Le modèle de chute suspendue crée un environnement physiologique avec la diffusion de drogue 3D et fait des réponses correspondant au stade de tumeur. Cela permet le développement de thérapies ciblées et de traitements spécifiques aux patients. Cette méthode est idéale pour étudier le cancer de l’ovaire, l’hétérogénéité et le développement de la résistance à la chimio.Cependant, il peut également être utilisé pour étudier d’autres cancers et des populations de cellules résistantes aux médicaments. Lors du placage des sphéroïdes, il est important de pipette volumes précis. Cela assure la cohérence entre les sphéroïdes.Les sphéroïdes et leurs gouttelettes respectives sont intrinsèquement fragiles et facilement perdus sans manipulation adéquate, c’est pourquoi nous montrerons comment plaquer, entretenir et analyser de manière appropriée une plaque de chute suspendue. Michael Bregenzer, un étudiant diplômé de notre laboratoire, démontrera cette procédure. Commencez par remplir chaque puits de la plaque de six puits de quatre à cinq millilitres d’eau déionisée autoclave et en sandwich la plaque de chute suspendue entre le couvercle et le fond de la plaque.Ajouter 800 à 1000 microlitres d’eau autour du bord de la plaque de chute suspendue pour fournir un environnement humide et minimiser l’évaporation. Ensuite, recueillir les cellules cultivées en 2D en les détachant avec de la trypsine, puis en ajoutant six ou huit millilitres de milieu contenant FBS. Aspirez les cellules avec la pipette sérologique de 10 millilitres, et déposez-les dans un tube conique de 15 millilitres.Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules. Préparer la suspension cellulaire selon les directives du manuscrit et mélanger délicatement avec la pipette pour assurer une distribution homogène. Placez la pointe de la pipette dans le puits à un angle de 45 degrés et pipette 20 microlitres de suspension dans chaque goutte suspendue bien.Remettre le couvercle de la plaque à six puits et utiliser une bande thermoplastique extensible pour sceller les bords. Incuber dans un incubateur humidifié standard de dioxyde de carbone et nourrir les gouttes suspendues tous les deux à trois jours en ajoutant deux à trois microlitres de milieu de culture cellulaire à chaque puits contenant des sphéroïdes. Pour quantifier la prolifération et la viabilité des cellules, ajoutez deux microlitres de solution filtrée à base de resazurine aux puits désignés pour l’analyse de la prolifération et incubent selon la direction manuscrite.Après la période d’incubation, ouvrez le sandwich suspendu dans une armoire de biosécurité et apportez la plaque de puits 384 avec le couvercle toujours en place pour le lecteur de plaque. Placez-le dans le lecteur de plaque et lisez la plaque. Enregistrez l’expérience dans la fenêtre popup et exportez les données dans une feuille de calcul.Remettre la plaque à la base de six puits et la placer dans l’incubateur. Une fois que tous les points de temps ont été lus pour la journée, réséaliser la plaque avant d’incuber. Pour préparer les sphéroïdes à l’analyse de la cytométrie d’écoulement, utilisez une pipette de 1000 microlitres pour les recueillir de chaque puits et les déposer dans un tube conique de 15 millilitres pour la désagrégation.La suspension cellulaire d’Aliquot en cinq tubes de micro centrifugeuse pour que chaque tube contienne au moins 50 000 cellules. Centrifugez les tubes à 400 fois G pendant cinq minutes dans une microcentrifugeuse, puis aspirez le supernatant et suspendez les granulés dans 100 microlitres de tampon Aldefluor. Étiquetez les tubes selon les instructions manuscrites.Ajouter 0,5 microlitres d’anticorps isotype APC au tube ISO APC et un microlitre d’anticorps CD133 au tube ALDH CD133. Ajoutez ensuite cinq microlitres de réaccentrement DEAB et 0,5 microlitres d’ALDH au tube DEAB et un microlitre d’ALDH au tube ALDH CD133. Vortex tous les tubes pendant quelques secondes et les incuber à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes.Après l’incubation, vortex tous les tubes à nouveau et les centrifuger à 400 fois G pendant cinq minutes. Étiquetez les tubes FACS selon les instructions manuscrites et remplissez un récipient isolé en mousse de glace. Aspirer le supernatant des tubes de microcentrifugeuse.Puis suspendre à nouveau le contrôle non taché dans 400 microlitres de tampon FACS et le reste des cellules dans 400 microlitres de tampon FACS DAPI. Placez les tubes sur la glace jusqu’à ce qu’ils puissent être analysés sur un cytomètre d’écoulement. Utilisez FlowJo pour analyser les données du cytomètre d’écoulement.Double cliquez sur le fichier non taché et réglez l’axe Y à la hauteur de dispersion latérale ou SSCH et l’axe X pour avancer la hauteur de dispersion ou FSCH. Cliquez sur le bouton T à côté de chaque axe pour ajuster l’échelle et maximiser la séparation entre les différentes populations cellulaires. Ensuite, cliquez sur le bouton Polygon Gating, dessinez la porte polygone autour de la population cellulaire et étiquetez la population cellules.Cliquez deux fois sur la population de la cellule dans l’espace de travail, puis changez l’axe FSC en largeur FSC et l’axe SSC à la hauteur FSC. Choisissez la porte du rectangle pour dessiner seulement un rectangle autour de la population dense la plus à gauche des cellules, couvrant l’ensemble de l’axe Y. Étiquetez cette porte Single Cells.Puis cliquez à droite et copiez cette cellule dans la porte des cellules individuelles imbriquées et coller sous chaque échantillon dans l’espace de travail. Cliquez deux fois sur la porte cellules simples imbriquées sous l’échantillon DAPI pour afficher la population de cellules individuelles à partir de ce tube d’échantillon. Modifiez le canal de l’axe FSC vers le canal de zone DAPI et changez le canal de l’axe SSC en histogramme.Cliquez sur le bouton T à côté de l’axe DAPI et cliquez sur Personnaliser l’axe pour ajuster l’échelle et maximiser la séparation entre les pics négatifs DAPI positifs et DAPI. Cliquez sur Appliquer dans la fenêtre popup et choisissez le bouton Range Gate. Répartir sur le pic négatif DAPI et étiqueter cette porte Cellules vivantes.Copiez la porte Cellules vivantes et coller sous la porte Cellules simples, sous les tubes APC ISO DEAB et ALDH CD133, pour sélectionner la même partie des cellules vivantes dans chaque tube. Cliquez ensuite deux fois sur la population de cellules vivantes imbriquées sous le fichier d’échantillon ISO de l’APC, et passez de l’axe X à la zone ALDH et à l’axe Y vers la zone APC. Appliquez la porte quadrant et ajustez l’intersection de la porte de telle sorte qu’environ 0,5 % de la population se trouve en haut à gauche de la fenêtre de la parcelle.Nommez ensuite les quadrants comme vous le souhaitez, puis copiez et coller les portes du quadrant sur la population de cellules vivantes imbriquées sous le fichier DEAB et ajustez la ligne verticale de sorte qu’environ 0,15 % de la population cellulaire se trouve dans le quadrant positif de l’ALDH. Enfin, copier et coller les portes quadrant à l’ALDH CD133 fichiers Live Cells population et l’évaluation des proportions de cellules souches cancéreuses basées sur ALDH et CD133 proportions. Ce protocole peut être utilisé pour l’analyse à haut débit des cellules souches cancéreuses dérivées du patient.Aussi peu que 10 cellules par puits peuvent former des sphéroïdes fiables et que les cellules prolifèrent, les sphéroïdes se dilatent en taille. La capacité de prolifération peut être facilement quantifiée avec un essai de florescence à base de résazurine. L’effet des médicaments sur la morphologie sphéroïde peut être visualisé avec l’imagerie par contraste de phase et quantifié en comparant la florescence de la résazurine dans les cellules non traitées et traitées.La mort cellulaire peut être validée par l’ajout de Calcein-AM et d’ethidium homodimer I aux sphéroïdes, suivie de l’imagerie au microscope confocal. Enfin, les sphéroïdes peuvent être récoltés et dispersés en une seule suspension cellulaire pour analyse avec cytométrie d’écoulement, ce qui permet de discerner l’efficacité des différents traitements médicamenteux sur des populations cellulaires spécifiques. Pour éviter la perte de gouttelettes, l’évaporation moyenne et la variation de la taille des sphéroïdes, il est important de manipuler vos assiettes avec soin, pipette avec précision et sceller complètement vos plaques de chute suspendues.Pour évaluer les changements dans l’expression des gènes et la signalisation soluble due au traitement médicamenteux, le séquençage de l’ARN unicelliste et les analyses immunosorbents liées aux enzymes peuvent être utilisés pour faciliter le développement de thérapeutiques. Cette technique permet aux recherches en oncologie, en médecine de précision et en développement de médicaments d’explorer l’hétérogénéité intra-et inter-patients ainsi que la résistance à la chimio grâce au criblage de médicaments à haut débit de petites biopsies. Lors de l’exécution de ce protocole, assurez-vous de porter tout l’équipement de protection individuelle standard.Y compris des gants, des lunettes de sécurité, des manteaux de laboratoire, des pantalons et des chaussures à bouts fermés.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Génération des sphéroïdes High-Throughput tumeur en trois dimensions pour le dépistage des drogues

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Ostéosarcome utilisant le Syndrome de Li-Fraumeni cellules souches de pluripotentes induites Patient dérivé de modélisation

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Dépistage de drogue des xénogreffes dérivées de tumeur de patient primaire dans le poisson-zèbre

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

Explantations tumorales dérivées de patients en tant que plate-forme préclinique « vivante » pour prédire la résistance aux médicaments chez les patients

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Un flux de travail de dépistage rapide pour identifier la thérapie combinée potentielle pour le GBM à l’aide de cellules souches de gliome dérivées du patient

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Exploration du métabolisme énergétique mitochondrial des sphéroïdes de microtissu 3D uniques à l’aide de l’analyse du flux extracellulaire

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

Dépistage en pool de la bibliothèque d’ARNH pour identifier les facteurs qui modulent un phénotype de résistance aux médicaments

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Établissement de sphéroïdes en 3 dimensions à partir d’échantillons tumoraux dérivés de patients et évaluation de leur sensibilité aux médicaments

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

L’implantation orthotopique de cellules cancéreuses dérivées de patients chez la souris récapitule le cancer colorectal avancé

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies

Génération de sphéroïdes tumoraux 3D pour des études d’évaluation de médicaments

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the ...