Name: physiologic patient derived 3d spheroids for anti-neoplastic drug screening to target cancer stem cells
Uploaded: 2019-07-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells at JoVE.com

Diese Arbeit wird in erster Linie durch DOD OCRP Early Career Investigator Award W81XWH-13-1-0134(GM), DOD Pilot Award W81XWH-16-1-0426 (GM), DOD Investigator Initiated Award W81XWH-17-OCRP-IIRA (GM), Rivkin Center for Ovarian Cancer und Michigan Ovarian Cancer unterstützt. Allianz. Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde vom National Cancer Institute der National Institutes of Health unter der Nummer P30CA046592 unterstützt. CMN wird vom National Science Foundation Graduate Research Fellowship unter Grant No. 1256260 unterstützt. MEB wird vom Department of Education Graduate Assistance in Areas of National Need (GAANN) Fellowship unterstützt.

Alle Patientenproben werden im Rahmen eines zugelassenen IRB-Protokolls von einwilligenden Patienten entnommen, deren Proben nach der Tumordebulk- und Aszites-Sammlung deidentifiziert werden.
1. Erzeugung von Sphäroiden aus kleinen Zellennummern in 384-gut hängenden Tropfenplatten
<ol><li>Legen Sie die hängende Fallplatte in einen Beschallungsgerät gefüllt mit sterilem deionisiertem (DI) Wasser und beschallen Sie 20 min.</li>
	<li>Mit einer handgeliebten Hand die Platte aus dem Beschall...

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> All cancers Source: Globocan. , (2018).</li><li>Prasad, V., Mailankody, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+and+Development+Spending+to+Bring+a+Single+Cancer+Drug+to+Market+and+Revenues+After+Approval.">Research and Development Spending to Bring a Single Cancer Drug to Market and Revenues After Approval.</a> JAMA Internal Medicine. 177, 1569-1575 (2017).</li><li>Raghavan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+Medicine+Based+Approach+to+Model+Patterns+of+Chemoresistance+and+Tumor+Recurrence+Using+Ovarian+Cancer+Stem+Cell+Spheroids.">Personalized Medicine Based Approach to Model Patterns of Chemoresistance and Tumor Recurrence Using Ovarian Cancer Stem Cell Spheroids.</a> Clinical Cancer Research. 23 (22), 6934-6945 (2017).</li><li>Jordan, C. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase+in+combination+with+CD133+defines+angiogenic+ovarian+cancer+stem+cells+that+portend+poor+patient+survival.">Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival.</a> Cancer Research. 71, 3991-4001 (2011).</li><li>Pulaski, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+alemtuzumab+as+an+anti-myeloid+cell+antiangiogenic+therapy+for+the+treatment+of+ovarian+cancer.">Identifying alemtuzumab as an anti-myeloid cell antiangiogenic therapy for the treatment of ovarian cancer.</a> Journal of Translational Medicine. 7, 49 (2009).</li><li>Jager, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+enzymatic+and+mechanical+methods+of+dissociation+on+neural+progenitor+cells+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells.</a> Advances in Medical Sciences. 61, 78-84 (2016).</li><li>Ivanov, D. P., Grabowska, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+arrays+for+high-throughput+single-cell+analysis+of+spatial+patterns+and+biomarker+expression+in+3D.">Spheroid arrays for high-throughput single-cell analysis of spatial patterns and biomarker expression in 3D.</a> Scientific Reports. 7, 41160 (2017).</li></ol>

Die 384-Well hängende Fallplatte plattform für die 3D-Sphäroidbildung ist ein leicht zu implementierendes Werkzeug für alle Zellbiologie- oder Krebsbiologielabore. Diese physiologische Plattform ermöglicht das Studium von Zelllinien sowie primären Patientenproben in physiologisch relevanten 3D-Kulturen und ermöglicht gleichzeitig ein Arzneimittelscreening mit hohem Durchsatz. Die Plattform stellt außerdem sicher, dass die Kulturbedingungen hochgradig abstimmbar sind, was eine enge Kontrolle über Beschichtungsdic...

Die weltweite krebsbedingte Sterblichkeit erreichte 2018 eine Zahl von 9,8 Millionen Todesfällen1, was die Notwendigkeit der Entwicklung verbesserter Therapeutika unterstreicht. Leider steigen die Kosten für die Entwicklung von Krebsmedikamenten, wobei die Entwicklung eines einzigen Medikaments, das etwa 650 Millionen US-Dollar kostet, darauf hinweist, dass verbesserte Strategien zur Entwicklung neuer Krebsmedikamente erforderlich sind. Krebsstammzellen (CSCs), die durch erhöhte Chemoresistenz gekennzeichnet sind3, die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und die Fähigkeit, neue Tumoren4 auszusäen, werden als verantwortlich für Tumorrezidiv4, Metastasierung5und Chemoresistenz4,6, die alle zur bösartigen Kapazität des Tumors und damit zur hohen Zahl von Todesopfern beitragen. Bei Eierstockkrebs, Diese Zellen werden in der bösartigen Aszites Flüssigkeit in der Peritonealhöhle angereichert gefunden, ein Zustand mit schlechten klinischen Ergebnissen verbunden1. Als Folge der bösartigen Fähigkeiten von CSCs wurde versucht, neue CSC-Medikamente zu entwickeln, die in Verbindung mit herkömmlichen Chemotherapien verwendet werden können. Es gibt mehrere Herausforderungen, die die Entwicklung von CSC-Targeting-Medikamenten begleiten, darunter: 1) Schwierigkeiten bei der Ausweitung und Aufrechterhaltung von CSCs in vitro; 2) Knappheit der Patientenproben; 3) physiologische Relevanz der Kulturplattform; und 4) Heterogenität der Arzneimittelempfindlichkeit zwischen Patienten. Dieses Protokoll beschreibt die Implementierung einer 3D-Kulturplattform mit hohem Durchsatz, die jede dieser Herausforderungen bewältigen kann. Insbesondere ermöglicht dieses System ein schnelles Arzneimittelscreening mit einer kleinen Anzahl von patientenabgeleiteten Ovarial-CSCs und ist für nachgelagerte Analysetechniken sehr gut geeignet. Unsere Plattform ist zwar ideal für die Untersuchung von Eierstockkrebs und CSCs, aber auch bei der Untersuchung anderer Krebsarten und differenzierter Zelltypen in komplexen 3D-Umgebungen.
Komplexe dreidimensionale (3D) Modelle sind entscheidend für die Untersuchung der Tumor-Mikroumgebung (TME), die eine 3D-Nische aus Krebszellen,nicht-krebsunterstützenden Zellen und extrazellulären Matrixproteinen (ECM) 4 ist. Diese 3D-Umgebung führt zu einer einzigartigen Zellmorphologie, Zellzell- und Zellmatrix-Wechselwirkungen, Zelldifferenzierung, Zellmigration, Zelldichte und Diffusionsgradienten im Vergleich zur traditionellen 2D-Zellkultur in vitro4. All diese Faktoren gipfeln in einer differenzierten Arzneimittelreaktion innerhalb von 3D-Kulturen, die eine erhöhte Arzneimittelresistenz und physiologische Relevanz aufweisen7,8. Aufgrund der Rolle des 3D-TME bei der CSC-Differenzierung und Chemoresistenz ist es wichtig, CSC-Targeting-Medikamente in physiologischen Mikroumgebungen zu überprüfen. Die Verbesserung der physiologischen Relevanz von CSC-Medikamentenscreening-Plattformen hat das Potenzial, patientenspezifische Arzneimittelscreenings, Arzneimittelentwicklung, Formulierung von Behandlungsstrategien und letztlich klinische Ergebnisse zu verbessern. Ebenso wichtig ist es, dass die für das Arzneimittelscreening verwendete Plattform mit hohem Durchsatz und kompatibel mit nachgelagerten Analysemethoden ist, um Kosten, Zeit und klinische Übersetzungszeit vielversprechender Medikamente zu minimieren9.
Derzeit ist das komplexe TME am besten für Arzneimittel-Screening-Anwendungen durch In-vivo-Modelle wie murine syngene Tumormodelle, zelllinienabgeleitete Xenografts und patientenabgeleitete Xenograft-Modelle (PDX)12, da sie physiologische Bedingungen. Der niedrige Durchsatz dieser Modelle sowie die Kosten,-Zeit- und technischen Fähigkeiten, die sie benötigen, schränken jedoch ihren Nutzen in schnellen, hochdurchsatzstarken Arzneimittelscreening-Anwendungenein 13. Als Alternativen zu diesen In-vivo-Modellen verwenden viele In-vitro-3D-Modelle Hydrogele8, Kultur in mikrofluidischen Geräten oder "Organ-on-a-Chip"-Geräten10,14und nicht-anhantigische Kulturen3,8 wurden auch entwickelt, aufgrund ihrer geringen Eintrittsbarriere in Bezug auf Kosten, Zeit und erforderliche Fähigkeiten.
Hydrogelkulturplattformen sind vorteilhaft in der Feinkontrolle über die Matrixzusammensetzung, mechanische Eigenschaften und Matrixstruktur15; sie können jedoch die Zellkultur mit hoher Dichte hemmen14. Darüber hinaus kann die Ernte von Zellen aus Hydrogelen die nachgelagerte Analyse aufgrund potenziell schädlicher Auswirkungen der Erntemethoden erschweren15. Mikrofluidische Geräte hingegen sind Mikroskalige Geräte, die die Ausgangserkennung innerhalb desselben Geräts und für die Zellkultur in physiologisch relevanten Maßstäben mit minimalem Reagenzienverbrauch, verringerter Reaktionszeit, minimiertem Abfall und schnelle Diffusion14. Diese Eigenschaften machen sie vielversprechende Plattformen für die Untersuchung der Arzneimitteltoxizität, Wirksamkeit, und Pharmakokinetik. Die Herausforderungen einer effizienten, quantifizierbaren, reproduzierbaren und benutzerfreundlichen 3D-Zellkultur sowie sperriger und kostspieliger Pumpsysteme haben jedoch mikrofluidische Anwendungen in der Forschung mit hohem Durchsatz eingeschränkt10. Effiziente Erkennungseinstellungen und potenziell schwierige Implementierung enden über alle Bereiche hinweg haben auch die weit verbreitete Einführung mikrofluidischer Systeme behindert10.
Im Gegensatz dazu enthalten Sphäroide, die unter nicht haftenden Bedingungen in rotierenden Mischern (Nutatoren), ultraniedrigen Befestigungsplatten und hängenden Tröpfchen erzeugt werden, keine benutzerdefinierten Matrixkomponenten. Diese Methoden sind besonders relevant für die Untersuchung von Eierstockkrebs, da die nicht haftenden Bedingungen repräsentativ für die Bedingungen sind, unter denen Sphäroide innerhalb der Peritonealhöhle wachsen5. Innerhalb dieser nicht-haftenden Kulturmethoden haben Nutator- und hängende Tropfensphäroide gezeigt, dass sie eine höhere Verdichtung, Umgestaltung und Chemoresistenz im Vergleich zu Sphäroiden aufweisen, die in ultraniedrigen Befestigungsplatten erzeugt werden, was auf eine erhöhte physiologische Relevanz16,17,18,19. Aufgrund der erhöhten Kapazität für High-Throughput-Screening von kleineren Brunnengrößen und minimal erforderlichen Zellzahlen ist die Sphäroid-Generierung in hängenden Fallplatten eine ideale Plattform für das Drogenscreening. Hier präsentieren wir eine abstimmbare 3D-physiologische Plattform in 384 gut hängenden Fallplatten, die einfach zu implementieren ist und für nachgelagerte Analysen hochgradig zugänglich ist, was sie ideal für das Screening von Eierstockkrebs und Eierstock-CSCs mit hohem Durchsatz ermöglicht.
Unsere 3D-physiologische Plattform bietet alle Vorteile der 3D-Kultur, einschließlich physiologischer Zell-Zell-Kontakte, Diffusionsgradienten, Zelldichten und natürlich produzierten ECM-Proteinen, die zu realistischen Wirkstoffreaktionen beitragen können16, 17,18,19. Darüber hinaus sind wir durch die Erzeugung dieser Sphäroide mit patientenabgeleiteten CSCs in der Lage, patientenspezifische Reaktionen auf Medikamente1 mit vielen technischen Replikationen gleichzeitig zu bestimmen, um Heterogenität zu überwinden, die innerhalb des Patiententumors gefunden werden kann. Proben20. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass die 3D-Kultur die Erhaltung der CSC-Populationen3,16 verbessert und somit repräsentativ für angereicherte CSC-Populationen in den Aszites7ist. Dies in Kombination mit einer einfachen nachgelagerten Analyse, einschließlich der Durchflusszytometrieanalyse der Lebensfähigkeit und cSC-Proportionen, ermöglicht eine optimale Bewertung der CSC-Targeting-Arzneimittelwirksamkeit. Schließlich ist diese physiologische Plattform mit der Bildgebung zu mehreren Zeitpunkten während des Experiments, der Bewertung von Zelltod und Zellproliferation, der Zellorganisation und Morphologie mit Immunhistochemie, der löslichen Signalisierung mit ELISA auf konditionierten Zellphänotypen mit Durchflusszytometrie und Genexpression nach PCR.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>ILT25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10,000 cSt Si oil</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>63148-62-9</td>
			<td>Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm tissue culture dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>130182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tube</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>FL4021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X DMEM for Serum Free Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X F12 for Serum Free Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>ILT10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies Inc.</td>
			<td>1449</td>
			<td>A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alamarBlue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>DAL1025</td>
			<td>Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALDEFLUOR assay kit</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>1700</td>
			<td>Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB)</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>1705</td>
			<td>Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor iXon x3 CCD Camera</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics and Antimycotics</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-isotype IgG2b</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-092-217</td>
			<td>Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>basic Fibroblast Growth Factor</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>78003.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy HT Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>7091000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD133-APC</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-113-184</td>
			<td>Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens Dimension Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4394</td>
			<td>Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS XL Core Cell Imaging System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AME3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - premium (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histogel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC2543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead viability kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td>Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph 7.8 Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX83 Research Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>7315D35</td>
			<td>Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates</td>
			<td>3D Biomatrix</td>
			<td>HDP1384-8</td>
			<td>Available through Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phalloidin AlexaFluor488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProJet 3500 HD Max</td>
			<td>3D Systems</td>
			<td>-</td>
			<td>3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile DI water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiJet M3 Crystal</td>
			<td>3D Systems</td>
			<td>-</td>
			<td>A biocompatible polymer material for 3D printing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

physiologic patient derived 3d spheroids for anti-neoplastic drug screening to target cancer stem cells

In diesem Protokoll beschreiben wir das Verfahren zur Erzeugung von Tumorsphäroiden innerhalb von 384 gut hängenden Tröpfchen, um ein Hochdurchsatzscreening von Krebstherapeutika in einer physiologisch repräsentativen Mikroumgebung zu ermöglichen. Wir skizzieren die Bildung von patientenabgeleiteten Krebsstammzellsphäroiden sowie die Manipulation dieser Sphäroide für eine gründliche Analyse nach medikamentöser Behandlung. Insbesondere beschreiben wir die Sammlung von Sphäroidmorphologie, Proliferation, Lebensfähigkeit, Arzneimitteltoxizität, Zellphänotyp und Zelllokalisierungsdaten. Dieses Protokoll konzentriert sich stark auf Analysetechniken, die leicht mit der 384-Well hängenden Tropfen-Plattform implementiert werden können, so dass es ideal für High-Through-Through-Drogen-Screening. Während wir die Bedeutung dieses Modells in der Eierstockkrebsforschung und der Krebsstammzellforschung betonen, ist die 384-Well-Plattform für die Erforschung anderer Krebsarten und Krankheitsmodelle zugänglich und erweitert den Nutzen der Plattform auf viele Bereiche. Durch die Verbesserung der Geschwindigkeit des personalisierten Arzneimittelscreenings und der Qualität der Screening-Ergebnisse durch leicht zu implementierende physiologisch repräsentative 3D-Kulturen wird diese Plattform bei der Entwicklung neuer Therapeutika und patientenspezifischer Behandlungsstrategien und haben daher weitreichende klinische Auswirkungen.

Sphäroide, die mit Zelllinien oder vom Patienten abgeleiteten CSCs gebildet werden, können mit einem Bereich von kleinen Zellnummern innerhalb hängender Tröpfchen gebildet werden (Abbildung 2A). Sphäroide bilden sich zuverlässig mit nur 10 Zellen pro Brunnen, was die Konservierung seltener Patientenproben ermöglicht. Zellen innerhalb dieser Sphäroide sind von anderen Zellen in 3 Dimensionen umgeben, wie sie in vivo wären, was physiologische Zell-Zell-Kontakte und Diffusionsraten erm...

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Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Physiologische Rand-3D-Sphäroide für antineoplastisches Arzneimittel-Screening, um Krebs-Stammzellen gezielt anzusprechen

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von vom Patienten abgeleiteten Sphäroiden und nachgelagerte Analysen, einschließlich Quantifizierung der Proliferation, Zytotoxizitätstests, Durchflusszytometrie, Immunfluoreszenzfärbung und konfokale Bildgebung, um Potenzial der Kandidaten als antineoplastische Therapeutika. Dieses Protokoll unterstützt Präzisionsmedizin mit der Identifizierung spezifischer Medikamente für jeden Patienten und das Krankheitsstadium.

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Unser Protokoll bietet eine einfache Methode für die 3D-Zellkultur und ist für die nachgelagerte Analyse sehr gut geeignet. Dies erleichtert die Bewertung heterogener Patientenproben und deren spezifische Wirkstoffreaktionen. Der Vorteil dieser Technik ist, dass Sphäroide aus kleinen Zellnummern gebildet werden können, was sowohl die Konservierung knapper Primärproben als auch ein Screening mit hohem Durchsatz für patientenspezifische Arzneimittelreaktionen ermöglicht.Das Hängende Tropfenmodell schafft eine physiologische Umgebung mit 3D-Medikamentendiffusion und reagiert entsprechend dem Tumorstadium. Dies ermöglicht die Entwicklung gezielter Therapien und patientenspezifischer Behandlungen. Diese Methode ist ideal für die Untersuchung von Eierstockkrebs, Heterogenität und der Entwicklung von Chemoresistenz.Jedoch, Es kann auch verwendet werden, um andere Krebsarten und medikamentenresistente Zellpopulationen zu studieren. Bei der Beschichtung von Sphäroiden ist es wichtig, präzise Volumen zu pipette. Dadurch wird die Konsistenz zwischen Sphäroiden sichergestellt.Die Sphäroide und ihre jeweiligen Tröpfchen sind von Natur aus zerbrechlich und ohne richtige Handhabung leicht verloren, daher zeigen wir, wie man eine hängende Fallplatte entsprechend plattiert, pflegt und analysiert. Demonstriert wird dieses Verfahren von Michael Bregenzer, einem Doktoranden unseres Labors. Beginnen Sie damit, jeden Brunnen der Sechs-Brunnen-Platte mit vier bis fünf Milliliterautokton-entionisiertem Wasser zu füllen und die hängende Fallplatte zwischen Deckel und Boden der Platte zu verstauen.Fügen Sie 800 bis 1000 Mikroliter Wasser um den Rand der hängenden Fallplatte hinzu, um eine feuchte Umgebung zu schaffen und die Verdunstung zu minimieren. Als Nächstes sammeln Sie 2D gewachsene Zellen, indem Sie sie mit Trypsin lösen und dann sechs oder acht Milliliter Medium hinzufügen, das FBS enthält. Die Zellen mit der 10 Milliliter serologischen Pipette ansaugen und in einem 15 Milliliter konischen Rohr ablagern.Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Zellen zu zählen. Bereiten Sie die Zellsuspension nach Manuskriptrichtungen vor und mischen Sie sie vorsichtig mit der Pipette, um eine homogene Verteilung zu gewährleisten. Legen Sie die Spitze der Pipette in einem Winkel von 45 Grad und Pipette 20 Mikroliter Suspension in jedem hängenden Tropfen gut.Legen Sie den Deckel der Sechs-Well-Platte wieder auf und verwenden Sie einen dehnbaren thermoplastischen Streifen, um die Kanten zu versiegeln. In einem Standard-Kohlendioxid-Befeuchtungsbrutschrank inkubieren und die hängenden Tropfen alle zwei bis drei Tage füttern, indem man jedem sphäroidhaltigen Brunnen zwei bis drei Mikroliter Zellkulturmedium hinzufügt. Um die Proliferation und Lebensfähigkeit der Zellen zu quantifizieren, fügen Sie zwei Mikroliter gefilterter Resazurin-basierter Lösung in die Brunnen ein, die für die Proliferationsanalyse bestimmt sind, und inkubieren Sie gemäß Manuskriptrichtung.Öffnen Sie nach der Inkubationszeit das hängende Tropfen-Sandwich in einem Biosicherheitsschrank und bringen Sie die 384-Wellplatte mit dem Deckel noch an Ort und Stelle zum Plattenleser. Legen Sie es in den Plattenleser und lesen Sie die Platte. Speichern Sie das Experiment im Popupfenster, und exportieren Sie die Daten in eine Kalkulationstabelle.Geben Sie die Platte wieder auf die Sechs-Brunnen-Basis zurück und legen Sie sie in den Inkubator. Sobald alle Zeitpunkte für den Tag gelesen wurden, versiegeln Sie die Platte vor dem Inkubieren erneut. Um Sphäroide für die Durchflusszytometrieanalyse vorzubereiten, verwenden Sie eine 1000-Mikroliter-Pipette, um sie aus jedem Brunnen zu sammeln und sie in ein 15 Milliliter konisches Rohr zur Disaggregation zu legen.Aliquot Zellsuspension in fünf Mikrozentrifugenröhren, so dass jede Röhre mindestens 50.000 Zellen enthält. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 400 mal G für fünf Minuten in einer Mikrozentrifuge, dann aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie Pellets in 100 Mikroliter Aldefluorpuffer wieder auf. Beschriften Sie die Rohre nach Manuskriptanweisungen.Fügen Sie 0,5 Mikroliter APC-Isotyp-Antikörper in das APC ISO-Rohr und einen Mikroliter CD133-Antikörper in die ALDH CD133-Röhre ein. Dann fügen Sie fünf Mikroliter DEAB-Reagenz und 0,5 Mikroliter ALDH in das DEAB-Rohr und einen Mikroliter ALDH in die ALDH CD133-Röhre. Wirbel alle Rohre für ein paar Sekunden und inkubieren sie bei 37 Grad Celsius für 45 Minuten.Nach der Inkubation alle Röhren wieder wirbeln und fünf Minuten lang bei 400 mal G zentrieren. Beschriften Sie FACS-Rohre nach Manuskriptanweisungen und füllen Sie einen isolierten Schaumbehälter mit Eis. Aspirieren Sie den Überstand aus den Mikrozentrifugenrohren.Dann setzen Sie die ungefärbte Kontrolle in 400 Mikroliter FACS-Puffer und den Rest der Zellen in 400 Mikroliter FACS DAPI Puffer wieder aus. Legen Sie die Rohre auf das Eis, bis sie auf einem Durchflusszytometer analysiert werden können. Verwenden Sie FlowJo, um die Daten aus dem Durchflusszytometer zu analysieren.Doppelklicken Sie auf die unbefleckte Datei und legen Sie die Y-Achse auf Seitenstreuhöhe oder SSCH oder Die X-Achse auf Streuhöhe oder FSCH nach vorne. Klicken Sie auf die T-Schaltfläche neben jeder Achse, um die Skalierung anzupassen und die Trennung zwischen verschiedenen Zellpopulationen zu maximieren. Klicken Sie als Nächstes auf die Schaltfläche Polygon-Gating, zeichnen Sie Polygon-Gate um die Zellenpopulation und beschriften Sie die Grundgesamtheitszellen.Doppelklicken Sie auf die Grundgesamtheit der Zelle im Arbeitsbereich, und ändern Sie dann die FSC-Achse in Die FSC-Breite und die SSC-Achse in die FSC-Höhe. Wählen Sie das Rechtecktor aus, um nur ein Rechteck um die linke dichte Grundgesamtheit von Zellen zu zeichnen, die sich über die gesamte Y-Achse erstreckt. Beschriften Sie dieses Gate Single Cells.Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf diese Zellen in das verschachtelte Einzelne Zellen-Gate, und fügen Sie sie unter jedem Beispiel im Arbeitsbereich ein. Doppelklicken Sie auf das Unter das DAPI-Beispiel verschachtelte Tor für einzelne Zellen, um die Einzelzellenpopulation aus diesem Beispielrohr anzuzeigen. Ändern Sie den FSC-Achsenkanal in den DAPI-Bereichskanal, und ändern Sie den SSC-Achsenkanal in Histogramm.Klicken Sie auf die T-Schaltfläche neben der DAPI-Achse und klicken Sie auf Achse anpassen, um die Skalierung anzupassen und die Trennung zwischen DAPI-positiven und DAPI-negativen Peaks zu maximieren. Klicken Sie im Popup-Fenster auf Anwenden, und wählen Sie die Schaltfläche Range Gate aus. Verteilen Sie es über die negative DAPI-Spitze und beschriften Sie dieses Gate Live Cells.Kopieren Sie das Live Cells-Gate und fügen Sie es unter das Einzelzellen-Gate unter den APC ISO DEAB- und ALDH-CD133-Röhren ein, um den gleichen Teil der lebenden Zellen in jeder Röhre auszuwählen. Doppelklicken Sie dann auf die Live Cells-Population, die unter der APC ISO-Beispieldatei verschachtelt ist, und wechseln Sie die X-Achse in den ALDH-Bereich und die Y-Achse in den APC-Bereich. Wenden Sie Quadrant Gate an und passen Sie den Schnittpunkt des Tores an, so dass etwa 0,5 % der Bevölkerung in der oberen linken Ecke des Plotfensters liegen.Benennen Sie dann die Quadranten wie gewünscht, kopieren Sie dann die Quadrantentore und fügen Sie sie auf die unter der DEAB-Datei verschachtelte Grundgesamtheit der lebenden Zellen ein, und passen Sie die vertikale Linie so an, dass etwa 0,15 % der Zellpopulation innerhalb des ALDH-positiven Quadranten liegen. Kopieren sie schließlich die Quadrantentore in die ALDH CD133-Dateien Live Cells Population und Bewertung KrebsStammzellproportionen basierend auf ALDH und CD133 Proportionen. Dieses Protokoll kann für die Analyse von Krebsstammzellen mit hohem Durchsatz verwendet werden.So wenig wie 10 Zellen pro Brunnen können zuverlässige Sphäroide bilden und wenn sich die Zellen vermehren, dehnen sich die Sphäroide in der Größe aus. Die Proliferationsfähigkeit kann leicht mit einem auf Resazurin basierenden Blütenstand-Assay quantifiziert werden. Die Wirkung von Medikamenten auf die Sphäroidmorphologie kann mit Phasenkontrastbildgebung visualisiert und durch den Vergleich der Resazurinblütenin in unbehandelten und behandelten Zellen quantifiziert werden.Der Zelltod kann durch Zugabe von Calcein-AM und Ethidium Homodimer I zu Sphäroiden validiert werden, gefolgt von einer Bildgebung auf einem konfokalen Mikroskop. Schließlich können Sphäroide geerntet und in eine einzelne Zellsuspension zur Analyse mit Durchflusszytometrie dispergiert werden, was es ermöglicht, die Wirksamkeit verschiedener medikamentöser Behandlungen an bestimmten Zellpopulationen zu erkennen. Um Tröpfchenverlust, mittlere Verdunstung und Variation der Sphäroidgröße zu vermeiden, ist es wichtig, Ihre Platten sorgfältig zu handhaben, Pipette mit Präzision und vollständig versiegeln Sie Ihre hängenden Fallplatten.Zur Bewertung von Veränderungen der Genexpression und der löslichen Signalisierung durch medikamentöse Behandlung können einzellige RNA-Sequenzierungen und enzymgebundene Immunsorbent-Assays verwendet werden, um die Entwicklung von Therapeutika zu erleichtern. Diese Technik ermöglicht es Forschungen in der Onkologie, Präzisionsmedizin und Arzneimittelentwicklung, die Intra- und Interpatientenheterogenität sowie die Chemoresistenz durch das Arzneimittelscreening kleiner Biopsien mit hohem Durchsatz zu erforschen. Achten Sie bei der Durchführung dieses Protokolls darauf, alle standardmäßigen persönlichen Schutzausrüstungen zu tragen.Inklusive Handschuhen, Schutzbrillen, Labormänteln, Hosen und schuhen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generation von Hochdurchsatz-dreidimensionale Tumor Sphäroide für Drogen-Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Forschung

Krebsforschung

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modellierung von Osteosarkom mit Li-Fraumeni-Syndrom, die Patienten abgeleitet induzierten pluripotenten Stammzellen

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Arzneimittel-Screening von Primärpatienten abgeleitetTumor Xenografts in Zebrafischen

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

Patienten-abgeleitete Tumor-Explantate als "Live" präklinische Plattform zur Vorhersage von Arzneimittelresistenzen bei Patienten

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Ein schneller Screening-Workflow zur Identifizierung einer potenziellen Kombinationstherapie für GBM unter Verwendung von vom Patienten abgeleiteten Gliomstammzellen

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Erforschung des mitochondrialen Energiestoffwechsels einzelner 3D-Mikrogewebesphäroide mittels extrazellulärer Flussanalyse

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

Gepooltes shRNA-Bibliotheksscreening zur Identifizierung von Faktoren, die einen Phänotyp der Arzneimittelresistenz modulieren

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Etablierung von 3-dimensionalen Sphäroiden aus patienteneigenen Tumorproben und Bewertung ihrer Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Orthotope Implantation von patienteneigenen Krebszellen in Mäusen rekapituliert fortgeschrittenen Darmkrebs

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies

Generierung von 3D-Tumorsphäroiden für Wirkstoffevaluierungsstudien

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the ...