Name: physiologic patient derived 3d spheroids for anti-neoplastic drug screening to target cancer stem cells
Uploaded: 2019-07-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells at JoVE.com

이 작품은 주로 DOD OCRP 초기 경력 조사자 상 W81XWH-13-1-0134 (GM), DOD 파일럿 상 W81XWH-16-1-0426 (GM), DOD 조사자 시작 상 W81XWH-17-OCRP-IIRA (GM), 난소 암및 미시간 난소 암에 대한 리브킨 센터에 의해 지원됩니다 얼라이언스. 이 간행물에 보고된 연구는 수상 번호 P30CA046592의 밑에 건강의 국가 학회의 국립 암 학회에 의해 지원되었습니다. CMN은 그랜트 번호 1256260에서 국립 과학 재단 대학원 연구 펠로우십에 의해 지원됩니다. MEB는 국가 필요 지역 (GAANN) 펠로우십에서 교육부 대학원 지원에 의해 지원됩니다.

모든 환자 샘플은 승인된 IRB 프로토콜에 따라 승인된 환자로부터 수집되며, 그 샘플은 종양 디벌킹 및 복수 수집 후 비식별화됩니다.
1. 384 웰 행잉 드롭 플레이트에서 작은 세포 번호에서 스페로이드의 생성
<ol><li>멸균 탈이온화(DI) 물로 채워진 초음파 처리기에 매달린 드롭 플레이트를 놓고 20분 동안 초음파 처리합니다.</li>
	<li>장갑을 낀 손으로 초음파 검사기에서 접시를 ...

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> All cancers Source: Globocan. , (2018).</li><li>Prasad, V., Mailankody, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+and+Development+Spending+to+Bring+a+Single+Cancer+Drug+to+Market+and+Revenues+After+Approval.">Research and Development Spending to Bring a Single Cancer Drug to Market and Revenues After Approval.</a> JAMA Internal Medicine. 177, 1569-1575 (2017).</li><li>Raghavan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+Medicine+Based+Approach+to+Model+Patterns+of+Chemoresistance+and+Tumor+Recurrence+Using+Ovarian+Cancer+Stem+Cell+Spheroids.">Personalized Medicine Based Approach to Model Patterns of Chemoresistance and Tumor Recurrence Using Ovarian Cancer Stem Cell Spheroids.</a> Clinical Cancer Research. 23 (22), 6934-6945 (2017).</li><li>Jordan, C. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase+in+combination+with+CD133+defines+angiogenic+ovarian+cancer+stem+cells+that+portend+poor+patient+survival.">Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival.</a> Cancer Research. 71, 3991-4001 (2011).</li><li>Pulaski, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+alemtuzumab+as+an+anti-myeloid+cell+antiangiogenic+therapy+for+the+treatment+of+ovarian+cancer.">Identifying alemtuzumab as an anti-myeloid cell antiangiogenic therapy for the treatment of ovarian cancer.</a> Journal of Translational Medicine. 7, 49 (2009).</li><li>Jager, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+enzymatic+and+mechanical+methods+of+dissociation+on+neural+progenitor+cells+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells.</a> Advances in Medical Sciences. 61, 78-84 (2016).</li><li>Ivanov, D. P., Grabowska, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+arrays+for+high-throughput+single-cell+analysis+of+spatial+patterns+and+biomarker+expression+in+3D.">Spheroid arrays for high-throughput single-cell analysis of spatial patterns and biomarker expression in 3D.</a> Scientific Reports. 7, 41160 (2017).</li></ol>

3D 스페로이드 형성을 위한 384웰 매달려 있는 드롭 플레이트 플랫폼은 모든 세포 생물학 또는 암 생물학 실험실을 위한 쉽게 구현되는 도구입니다. 이 생리학적 플랫폼은 높은 처리량 약물 스크리닝을 허용하면서 생리학적으로 관련된 3D 배양 내에서 세포주뿐만 아니라 1차 환자 샘플을 연구할 수 있게 합니다. 또한 이 플랫폼은 배양 조건이 고도로 조정가능하도록 하여 도금 밀도, 세포 공동 배양 ...

전 세계적으로 암 관련 사망률은 2018년 980만 명에 이르렀으며, 개선된 치료법개발의 필요성을 강조하고 있다. 안타깝게도, 새로운 항암제 개발을 위한 개선된 전략의 필요성을 나타내는 약 6억 5천만 달러의 비용이 드는 단일 약물의 개발로 인해 암 치료제 개발 비용이 증가하고 있습니다. 암 줄기 세포 (CSC), 증가 화학 저항을 특징으로3,자기 갱신 하는 능력, 그리고 새로운 종양을 종자 하는 능력4 종양 재발에 대 한 책임 것으로 생각 된다4,전이5,및 화학 저항4,6, 이는 모두 종양의 악성 용량에 기여하므로 높은 사망자 수입니다. 난소암에서, 이 세포는 복강내의 악성 복수액에서 풍부하게 발견되며, 이는 나쁜 임상 결과와 관련된 상태이다1. CSC의 악성 기능의 결과로, 전통적인 화학요법과 함께 사용하기 위하여 새로운 CSC 표적으로 하는 약을 개발하는 추진이 있었습니다. 포함 하는 CSC 표적 약물의 개발에 수반 하는 몇 가지 도전이 있다: 1) 시험관에서 CSC를 확장 하 고 유지 에 어려움; 2) 환자 샘플의 부족; 3) 배양 플랫폼의 생리적 관련성; 4) 환자 들 간의 약물 감수성의 이질성. 이 프로토콜은 이러한 각 과제를 극복할 수 있는 높은 처리량의 3D 문화 플랫폼 구현에 대해 설명합니다. 특히, 이 시스템은 소수의 환자 유래 난소 CSC를 사용하여 신속한 약물 스크리닝을 허용하며, 다운스트림 분석 기술에 매우 적합합니다. 난소암과 CSC를 연구하는 데 이상적이지만, 당사의 플랫폼은 복잡한 3D 환경에서 다른 암 과 분화 세포 유형을 연구하는 데에도 유용합니다.
복합 3차원(3D) 모델은 암세포, 비암 지지 세포 및 세포외 매트릭스(ECM) 단백질로 구성된 3D 틈새 시장인 종양 미세환경(TME) 단백질을 연구하는 데 매우 중요합니다. 이러한 3D 환경은 시험관내 전통적인 2D 세포 배양에 비해 독특한 세포 형태, 세포 세포 및 세포 매트릭스 상호작용, 세포분화, 세포 이동, 세포 밀도 및 확산 구배를 초래한다 4. 이러한 모든 요인은 3D 배양 내의 차동 약물 반응에서 절정을이며, 약물 내성 및 생리적 관련성증가를 나타내며 7,8. CSC 분화 및 화학 저항성에서 3D TME의 역할로 인해 생리학적 미세 환경에서 약물을 대상으로 하는 CSC를 선별하는 것이 중요합니다. CSC 약물 스크리닝 플랫폼의 생리학적 관련성을 개선하는 것은 환자 특정 약물 스크리닝, 약물 개발, 치료 전략의 제형 및 궁극적으로 임상 결과를 개선할 수 있는 잠재력을 가지고 있다. 약물 스크리닝에 사용되는 플랫폼이 높은 처리량과 다운스트림 분석 방법과 호환되어 유망한 약물의 비용, 시간및 임상 번역 시간을 최소화하는 것이 똑같이 중요합니다 9.
현재, 복합TME는 생리학적을 제공하기 때문에 뮤린 합성 종양 모델, 세포주 유래 이종이식 및 환자 유래 이종이식(PDX) 모델(12)과같은 생체 내 모델을 통한 약물 스크리닝 적용을 가장 잘 유지한다. 조건. 그러나, 이러한 모델들의 낮은 처리량 특성은 비용, 시간 및 기술적 기술 세트뿐만 아니라 신속하고 높은 처리량약물 스크리닝 애플리케이션에서 그들의 유용성을 제한한다. 이러한 생체내 모델에 대한 대안으로, 하이드로겔8,미세유체 장치 내 배양 또는 '오르간 온 칩' 장치10,14,및 비부착 배양3,8을 이용한 많은 시험관내 3D 모델 비용, 시간 및 필요한 기술 집합 측면에서 진입 장벽이 낮기 때문에 개발되었습니다.
하이드로겔 배양 플랫폼은 매트릭스 조성물, 기계적 특성 및 매트릭스구조(15)에걸쳐 제공되는 미세 제어에 유리하다; 그러나, 그들은 고밀도 세포 배양(14)을억제 할 수 있습니다. 또한, 하이드로겔로부터 의한 수확 세포는 수확 방법15의잠재적으로 유해한 영향으로 인해 하류 분석을 복잡하게 할 수 있다. 반면, 미세유체 장치는 동일한 장치 내에서 출력 검출을 허용하고, 시약의 소비를 최소화하고, 반응 시간을 줄이며, 폐기물을 최소화하며, 생리학적으로 관련된 스케일에서 세포 배양을 가능하게 하는 마이크로스케일 장치이며, 급속 한 확산14. 이러한 특성으로 인해 약물 독성, 효능 및 약물 동태학을 조사하기 위한 유망한 플랫폼이 됩니다. 그러나 효율적이고 정량화 가능하며 재현 가능하며 사용자 친화적인 3D 세포 배양뿐만 아니라 부피가 크고 비용이 많이 드는 펌핑 시스템의 과제는 고처리량 연구에서 미세 유체 응용을 제한했습니다10. 효율적인 검출 설정및 필드 전반에 걸친 잠재적으로 어려운 구현은 또한 미세 유체 시스템10의광범위한 채택을 방해했다.
반대로 회전 믹서(nutators), 초저 부착 플레이트 및 매달려 있는 물방울에서 비부착 조건에서 생성된 스페로이드는 사용자 정의 매트릭스 성분을 포함하지 않습니다. 이러한 방법론은 특히 비 부착 조건이 스페로이드가 복강 내에서 성장하는 조건을 대표하기 때문에 난소암을 연구하는 데 특히 관련이있습니다5. 이러한 비 부착 배양 방법 내에서, 영양기와 매달려 드롭 스페로이드는 초저 부착 플레이트에서 생성 된 스페로이드에 비해 더 높은 압축, 리모델링 및 화학 저항을 나타내는 것으로 나타났습니다, 증가 생리학적 제안 관련성16,17,18,19. 더 작은 우물 크기와 최소한의 필요한 셀 번호에서 높은 처리량 스크리닝을 위한 증가된 용량으로 인해, 매달려 있는 드롭 플레이트의 스페로이드 생성은 약물 스크리닝을 위한 이상적인 플랫폼입니다. 여기에서, 우리는 384 잘 매달려 있는 낙하 판에 있는 조정 가능한 3D 생리학 플랫폼을 제시합니다, 그 구현하기 쉽고 다운스트림 분석에 높게 순종합니다, 난소암과 난소 CSCs의 높은 처리량 약 검열을 위해 이상적 만들기.
우리의 3D 생리학적 플랫폼은 생리적 세포-세포 접촉, 확산 구배, 세포 밀도 및 자연적으로 생성된 ECM 단백질을 포함하여 3D 배양의 모든 장점을 제공하며, 이는 현실적인 약물 반응에 기여할 수 있습니다16, 17,18,19. 추가적으로, 환자 파생된 CSCs를 가진 이 스페로이드를 생성해서, 우리는 많은 기술적인 복제를 동시에 가진 약1에 환자 특정 반응을 결정할 수 있습니다, 참을성 있는 종양 내의 찾아질 수 있는 이질성을 극복하기 위하여 샘플20. 더욱이, 3D 문화는 CSC 인구3,16의 유지관리를 향상시키는 것으로 나타났으며, 따라서 7의 풍부한 CSC 인구를 대표한다. 이는 생존 가능성 및 CSC 비율의 유세포 분석 분석을 포함한 쉬운 다운스트림 분석과 결합되어 CSC 표적화 약물 효능을 최적으로 평가할 수 있습니다. 마지막으로, 이 생리학적 플랫폼은 실험 중 여러 시점의 이미징과 호환되며, 세포 사멸 및 증식 평가, 면역조직화학을 위한 세포 조직 및 형태학, 조건부 ELISA를 위한 수용성 신호 중간, 유세포 분석및 PCR 에 따른 유전자 발현을 가진 세포 표현형.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>ILT25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10,000 cSt Si oil</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>63148-62-9</td>
			<td>Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm tissue culture dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>130182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tube</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>FL4021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X DMEM for Serum Free Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X F12 for Serum Free Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>ILT10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies Inc.</td>
			<td>1449</td>
			<td>A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alamarBlue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>DAL1025</td>
			<td>Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALDEFLUOR assay kit</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>1700</td>
			<td>Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB)</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>1705</td>
			<td>Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor iXon x3 CCD Camera</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics and Antimycotics</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-isotype IgG2b</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-092-217</td>
			<td>Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>basic Fibroblast Growth Factor</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>78003.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy HT Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>7091000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD133-APC</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-113-184</td>
			<td>Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens Dimension Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4394</td>
			<td>Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS XL Core Cell Imaging System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AME3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - premium (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histogel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC2543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead viability kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td>Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph 7.8 Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX83 Research Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>7315D35</td>
			<td>Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates</td>
			<td>3D Biomatrix</td>
			<td>HDP1384-8</td>
			<td>Available through Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phalloidin AlexaFluor488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProJet 3500 HD Max</td>
			<td>3D Systems</td>
			<td>-</td>
			<td>3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile DI water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiJet M3 Crystal</td>
			<td>3D Systems</td>
			<td>-</td>
			<td>A biocompatible polymer material for 3D printing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

physiologic patient derived 3d spheroids for anti-neoplastic drug screening to target cancer stem cells

이 프로토콜에서는 생리학적으로 대표적인 미세 환경에서 항암 치료제의 높은 처리량 스크리닝을 허용하기 위해 384 웰 매달려 있는 액적 내에서 종양 스페로이드 생성 절차를 설명합니다. 우리는 환자 유래 암 줄기 세포 스페로이드의 형성뿐만 아니라, 약물 치료 다음 철저한 분석을 위해 이러한 스페로이드의 조작을 설명합니다. 구체적으로, 우리는 스페로이드 형태, 증식, 생존력, 약물 독성, 세포 표현형 및 세포 국소화 데이터의 수집을 설명합니다. 이 프로토콜은 384웰 매달려 있는 드롭 플랫폼을 사용하여 쉽게 구현할 수 있는 분석 기술에 중점을 두어 처리량이 높은 약물 스크리닝에 이상적입니다. 우리는 난소암 연구와 암 줄기 세포 연구에서이 모델의 중요성을 강조하는 동안, 384 웰 플랫폼은 다른 암 유형 및 질병 모델의 연구에 적합, 많은 분야에 플랫폼의 유용성을 확장. 이 플랫폼은 쉽게 구현된 생리학적 대표 3D 배양을 통해 맞춤화된 약물 스크리닝의 속도와 스크리닝 결과의 품질을 개선함으로써 새로운 치료법 및 환자 별 개발에 도움이 될 것으로 예측됩니다. 치료 전략을 수립하여 광범위한 임상 적 영향을 미칩니다.

세포주 또는 환자 유래 CSC로 형성된 스페로이드는 매달려 있는 액적 내에서 다양한작은 세포 수로 형성될 수 있다(도 2A). 스페로이드는 우물 당 10 개의 세포로 안정적으로 형성되어 희귀 한 환자 샘플을 보존 할 수 있습니다. 이 스페로이드 내의 세포는 생리적인 세포 세포 접촉 및 확산 비율을 허용하는 생체 내에 있을 것과 같이 3 차원에서 그밖 세포에 의해 포위됩니다. 스...

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Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

암 줄기 세포를 표적으로 하는 반대로 신 생물 성 약 검열을 위한 생리학 환자 파생된 3D Spheroids

이 프로토콜은 약물 을 평가하기 위해 증식, 세포 독성 테스트, 유세포 분석, 면역 형광 염색 및 공초점 이미징의 정량화를 포함한 환자 유래 스페로이드 생성 및 하류 분석을 설명합니다. 반대로 신생물 치료제로 후보자의 잠재력. 이 프로토콜은 각 환자 및 질병 단계에 대한 특정 약물을 식별하여 정밀 의학을 지원합니다.

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

당사의 프로토콜은 3D 세포 배양을 위한 간단한 방법을 제공하며 다운스트림 분석에 매우 적합합니다. 이것은 이기종 환자 견본 및 그들의 특정 약 반응의 평가를 용이하게 합니다. 이 기술의 장점은 스페로이드가 작은 세포 수에서 형성될 수 있다는 것입니다, 부족한 1차 샘플의 보존을 모두 허용하고, 환자 특정 약물 반응을 위한 높은 처리량 검열.매달려 있는 낙하 모델은 3D 약물 확산을 통해 생리환경을 조성하고 종양 단계에 대응하는 반응을 한다. 이것은 표적으로 한 치료 및 환자 특정 처리의 발달을 허용합니다. 이 방법은 난소암, 이질성 및 화학 요법의 발달을 연구하는 데 이상적입니다.그러나, 그것은 또한 다른 암 및 약물 내성 세포 인구를 공부 하기 위해 사용할 수 있습니다. 스페로이드를 도금할 때는 정확한 볼륨을 피펫하는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 스페로이드 간의 일관성이 보장됩니다.스페로이드와 각각의 물방울은 본질적으로 깨지기 쉽고 적절한 처리없이 쉽게 손실되므로 매달려 있는 드롭 플레이트를 적절하게 플레이트, 유지 및 분석하는 방법을 보여줍니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리의 실험실에서 대학원생 마이클 Bregenzer 될 것입니다. 6웰 플레이트의 각 우물을 4~5밀리리터의 오토클레이온 워터로 채우고 뚜껑과 접시 바닥 사이에 매달려 있는 드롭 플레이트를 끼우는 것으로 시작합니다.매달려 있는 낙하판의 테두리 주위에 800~1,000마이크로리터의 물을 첨가하여 습한 환경을 제공하고 증발을 최소화합니다. 다음으로 트립신으로 분리한 다음 FBS를 함유하는 배지의 6~8밀리리터를 추가하여 2D 성장세포를 수집합니다. 10 밀리리터 세로지피트로 세포를 흡인하고 15 밀리리터 원판 튜브에 보관하십시오.혈세포계를 사용하여 세포를 계산합니다. 원고 방향에 따라 셀 서스펜션을 준비하고 파이펫과 부드럽게 섞어 균일한 분포를 보장합니다. 파이펫 끝을 45도 각도로 우물에 놓고 각 매달려 있는 각 매달려 있는 양면에 서스펜션 20 마이크로리터를 놓습니다.6웰 플레이트뚜껑을 다시 놓고 신축성 있는 열가소성 스트립을 사용하여 가장자리를 밀봉합니다. 표준 이산화탄소 가습 인큐베이터에서 배양하고 각 스페로이드 함유 우물에 세포 배양 배지의 2 ~3 마이크로 리터를 추가하여 2 ~ 3 일마다 매달려 방울을 공급합니다. 세포의 증식 및 생존가능성을 정량화하기 위해, 증식 분석을 위해 지정된 우물에 여과된 레사쥐린 기반 용액의 2마이크로리터를 추가하고 원고 방향에 따라 배양한다.인큐베이션 기간 이후에는 생리용 캐비닛에 매달려 있는 드롭 샌드위치를 열고 뚜껑이 있는 384웰 플레이트를 플레이트 판독기에 놓습니다. 접시 판독기에 놓고 접시를 읽습니다. 실험을 팝업 창에 저장하고 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다.접시를 6웰 베이스로 돌려놓고 인큐베이터에 놓습니다. 하루 동안 모든 시간 점을 읽은 후 배양하기 전에 접시를 다시 봉인하십시오. 유동 세포 측정 분석을 위해 스페로이드를 준비하려면 1000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 각 우물에서 수집하여 분리를 위해 15 밀리리터 원간 튜브에 보관하십시오.각 튜브가 적어도 50, 000 세포를 포함되도록 5 개의 마이크로 원심 분리 관으로 Aliquot 세포 현탁액. 마이크로센트심분리기에서 5분 동안 400회 G로 튜브를 원심분리한 다음, 수퍼를 흡인하고 알데플루오 버퍼 100마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 원고 의 지시에 따라 튜브에 레이블을 지정합니다.APC ISO 튜브에 APC 이소타입 항체의 0.5 마이크로리터와 ALDH CD133 튜브에 CD133 항체의 마이크로리터 1개를 추가한다. 그런 다음 DEAB 시약 5개 소리터와 ALDH의 0.5 마이크로리터를 DEAB 튜브에 추가하고 ALDH CD133 튜브에 ALDH의 마이크로리터 1개를 추가합니다. 모든 튜브를 몇 초 동안 소용돌이시키고 섭씨 37도에서 45분 동안 배양합니다.인큐베이션 후, 모든 튜브를 다시 소용돌이시키고 원심분리기를 400회 G로 5분간 분리합니다. 원고 방향에 따라 FACS 튜브에 라벨을 부착하고 절연 된 거품 용기를 얼음으로 채웁니다. 마이크로 원심 분리기 튜브에서 상체를 흡인.그런 다음 FACS 버퍼400 마이크로리터및 나머지 세포에서 FACS DAPI 버퍼의 400 마이크로리터에서 스테인드 되지 않은 제어를 다시 중단한다. 유동 세포계에서 분석될 때까지 튜브를 얼음 위에 놓습니다. FlowJo를 사용하여 유동 사이토미터의 데이터를 분석합니다.스테인드되지 않은 파일을 두 번 클릭하고 Y축을 측면 분산 높이 또는 SSCH 및 X축으로 설정하여 분산 높이 또는 FSCH를 전달합니다. 각 축 옆의 T 버튼을 클릭하여 축을 조정하고 서로 다른 셀 집단 간의 분리를 최대화합니다. 다음으로 다각형 게이팅 버튼을 클릭하고 셀 모집단 주위에 다각형 게이트를 그리고 인구 셀에 레이블을 지정합니다.작업 영역에서 셀의 채우기를 두 번 클릭한 다음 FSC 축을 FSC 너비로 변경하고 SSC 축을 FSC 높이로 변경합니다. 사각형 게이트를 선택하여 전체 Y축에 걸쳐 가장 밀도가 높은 셀 집단 주위에 사각형만 그립니다. 이 게이트 단일 셀에 레이블을 지정합니다.그런 다음 중첩된 단일 셀 게이트에서 이 셀을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 복사하여 작업 공간의 각 샘플 아래에 붙여 넣습니다. DAPI 샘플 아래에 중첩된 단일 셀 게이트를 두 번 클릭하여 해당 샘플 튜브에서 단일 셀 모집단을 봅니다. FSC 축 채널을 DAPI 영역 채널로 변경하고 SSC 축 채널을 히스토그램으로 변경합니다.DAPI 축 옆의 T 버튼을 클릭하고 사용자 지정 축을 클릭하여 축을 조정하고 DAPI 양수와 DAPI 음수 피크 사이의 분리를 최대화합니다. 팝업 창에서 적용을 클릭하고 범위 게이트 버튼을 선택합니다. DAPI 네거티브 피크 위에 확산하고 이 게이트 라이브 셀에 레이블을 지정합니다.살아있는 세포 게이트를 복사하고 APC ISO DEAB 및 ALDH CD133 튜브 아래단일 셀 게이트 아래에 붙여 넣으며 각 튜브에서 라이브 셀의 동일한 부분을 선택합니다. 그런 다음 APC ISO 샘플 파일 아래에 중첩된 라이브 셀 채우기를 두 번 클릭하고 X축을 ALDH 영역및 Y축영역으로 전환합니다. 사분면 게이트를 적용하고 인구의 약 0.5 %가 플롯 창의 왼쪽 상단에 있는 것과 같이 게이트의 교차점을 조정합니다.그런 다음 사분면의 이름을 원하는 대로 지정한 다음, DEAB 파일 아래에 중첩된 라이브 셀 인구에 사분면 게이트를 복사하고 붙여 넣고 수직 선을 조정하여 세포 인구의 약 0.15%가 ALDH 양성 사분면 내에 놓이도록 합니다. 마지막으로, ALDH CD133 파일에 사분면 게이트를 복사하여 붙여넣기 라이브 셀 인구와 ALDH 및 CD133 비율에 따라 암 줄기 세포 비율을 평가한다. 이 프로토콜은 환자 유래 암 줄기 세포의 높은 처리량 분석을 위해 사용될 수 있다.우물 당 10 세포가 신뢰할 수있는 스페로이드를 형성 할 수 있으며 세포가 증식할 때 스페로이드의 크기가 확장됩니다. 증식 용량은 레자쥐린 기반의 플로레스세이센 분석으로 쉽게 정량화될 수 있습니다. 스페로이드 형태에 대한 약물의 효과는 치료되지 않은 치료 및 처리 된 세포에서 resazurin 꽃집을 비교하여 위상 대비 이미징으로 시각화하고 정량화 할 수 있습니다.세포 사멸은 칼신-AM과 에디듐 호모이머 I를 스페로이드에 첨가하여 검증할 수 있으며, 이어서 공초점 현미경에 대한 이미징이 뒤따릅니다. 마지막으로, 스페로이드는 유동 세포측정을 사용하여 분석을 위해 단일 세포 현탁액으로 수확및 분산될 수 있으며, 이는 특정 세포 집단에 대한 다른 약물 치료의 효과를 분별할 수 있게 한다. 물방울 손실, 중간 증발 및 스페로이드 크기의 변화를 피하기 위해 플레이트를 신중하게 처리하고 파이펫을 정밀하게 처리하고 매달려 있는 드롭 플레이트를 완전히 밀봉하는 것이 중요합니다.약물 치료, 단세포 RNA 염기서열 분석 및 효소 연계 면역소벤트 분석으로 인한 유전자 발현 및 수용성 신호의 변화를 평가하기 위해 치료법의 개발을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 이 기술은 종양학, 정밀 의학 및 약물 개발에 있는 연구가 작은 생검의 높은 처리량 약 검열을 통해 내과 간 환자 이질성 뿐만 아니라 화학 저항을 탐구하는 것을 허용합니다. 이 프로토콜을 수행할 때는 모든 표준 개인 보호 장비를 착용해야 합니다.장갑, 안전 안경, 실험실 코트, 바지 및 가까운 신발포함.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

마약 검사에 대 한 높은 처리량 3 차원 종양 Spheroids의 생성

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

연구

암 연구학

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Li Fraumeni 증후군 환자에서 파생 된 유도 만능 줄기 세포를 사용 하 여 다리를 모델링

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

제브라피시의 1차 환자 유래 종양 이종이식의 약물 스크리닝

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

환자 유래 종양은 환자의 약물 내성을 예측하기위한 "라이브"전임상 플랫폼으로 이월합니다.

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

환자 유래 신경종 줄기 세포를 사용하여 GBM에 대한 잠재적인 조합 요법을 식별하는 신속한 선별 워크플로우

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

세포외 플럭스 분석을 이용한 단일 3D 미세조직 구상체의 미토콘드리아 에너지 대사 탐구

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

약물 내성 표현형을 조절하는 인자를 식별하기 위한 풀링된 shRNA 라이브러리 스크리닝

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

환자 유래 종양 샘플에서 3차원 스페로이드 설정 및 약물에 대한 민감도 평가

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

생쥐에서 환자 유래 암세포의 정형외피 이식은 진행성 대장암을 재현합니다.

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies

약물 평가 연구를 위한 3D 종양 스페로이드 생성

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the ...