Name: physiologic patient derived 3d spheroids for anti-neoplastic drug screening to target cancer stem cells
Uploaded: 2019-07-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells at JoVE.com

Dette arbeidet er støttet hovedsakelig av DOD OCRP tidlig karriere etterforsker Award W81XWH-13-1-0134 (GM), DOD pilot Award W81XWH-16-1-0426 (GM), DOD etterforsker initiert prisen W81XWH-17-OCRP-IIRA (GM), Rivkin Center for eggstokkene kreft og Michigan eggstokkene Cancer Alliansen. Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Cancer Institute of National Institutes of Health under pris nummer P30CA046592. CMN er støttet av National Science Foundation Graduate Research Fellowship under Grant no. 1256260. MEB støttes av Department of Education Graduate Assistance i områder av National Need (GAANN) Fellowship.

Alle pasientprøver er samlet under en godkjent IRB protokoll fra samtykkende pasienter, hvis prøvene er de-identifisert etter tumor "debulking" og ascites samling.
1. generering av Spheroids fra små celle tall i 384-brønn hengende drop plater
<ol><li>Plasser den hengende dråpe platen i en sonicator fylt med sterilt deionisert (DI) vann og sonikere i 20 min.</li>
	<li>Med en hansker hånd fjerner du platen fra sonicator og vasker den med rennende DI vann.</li>
	<li>La platen til å sitte...

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> All cancers Source: Globocan. , (2018).</li><li>Prasad, V., Mailankody, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+and+Development+Spending+to+Bring+a+Single+Cancer+Drug+to+Market+and+Revenues+After+Approval.">Research and Development Spending to Bring a Single Cancer Drug to Market and Revenues After Approval.</a> JAMA Internal Medicine. 177, 1569-1575 (2017).</li><li>Raghavan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+Medicine+Based+Approach+to+Model+Patterns+of+Chemoresistance+and+Tumor+Recurrence+Using+Ovarian+Cancer+Stem+Cell+Spheroids.">Personalized Medicine Based Approach to Model Patterns of Chemoresistance and Tumor Recurrence Using Ovarian Cancer Stem Cell Spheroids.</a> Clinical Cancer Research. 23 (22), 6934-6945 (2017).</li><li>Jordan, C. T., Guzman, M. L., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Stem+Cells.">Cancer Stem Cells.</a> New England Journal of Medicine. 355, 1253-1261 (2006).</li><li>Ishiguro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+Characterization+of+an+In+Vitro+Model+of+Ovarian+Cancer+Stem-like+Cells+with+an+Enhanced+Proliferative+Capacity.">Establishment and Characterization of an In Vitro Model of Ovarian Cancer Stem-like Cells with an Enhanced Proliferative Capacity.</a> Cancer Research. 76, 150-160 (2016).</li><li>P&#225;ez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Dormancy:+A+Model+of+Early+Dissemination+and+Late+Cancer+Recurrence.">Cancer Dormancy: A Model of Early Dissemination and Late Cancer Recurrence.</a> Clinical Cancer Research. 18, 645-653 (2012).</li><li>Ahmed, N., Stenvers, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+Know+Ovarian+Cancer+Ascites:+Opportunities+for+Targeted+Therapy-Based+Translational+Research.">Getting to Know Ovarian Cancer Ascites: Opportunities for Targeted Therapy-Based Translational Research.</a> Frontiers in Oncology. 3, (2013).</li><li>Pradhan, S., Clary, J. M., Seliktar, D., Lipke, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+spheroidal+cancer+model+based+on+PEG-fibrinogen+hydrogel+microspheres.">A three-dimensional spheroidal cancer model based on PEG-fibrinogen hydrogel microspheres.</a> Biomaterials. 115, 141-154 (2017).</li><li>Varna, M., Bertheau, P., Legr&#232;s, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Microenvironment+in+Human+Tumor+Xenografted+Mouse+Models.">Tumor Microenvironment in Human Tumor Xenografted Mouse Models.</a> Journal of Analytical Oncology. 3, 159-166 (2014).</li><li>Huang, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+microfluidic+cell+culture+system+for+high-throughput+perfusion+three-dimensional+cell+culture-based+assays:+Effect+of+cell+culture+model+on+the+results+of+chemosensitivity+assays.">An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: Effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays.</a> Lab on a Chip. 13, 1133-1143 (2013).</li><li>Zang, R., Li, D., Tang, I. C., Wang, J., Yang, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Based+Assays+in+High-Throughput+Screening+for+Drug+Discovery.">Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery.</a> International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. , (2012).</li><li>Murphy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+alternative+in+vivo+drug+screening+methodology:+a+single+mouse+analysis.">Evaluation of alternative in vivo drug screening methodology: a single mouse analysis.</a> Cancer Research. 76, 5798-5809 (2016).</li><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+Xenograft+models:+An+emerging+platform+for+translational+cancer+research.">Patient-derived Xenograft models: An emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).</li><li>Damiati, S., Kompella, U. B., Damiati, S. A., Kodzius, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+drug+delivery+systems+and+drug+screening.">Microfluidic devices for drug delivery systems and drug screening.</a> Genes. 9, (2018).</li><li>Caliari, S. R., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Practical+Guide+to+Hydrogels+for+Cell+Culture.">A Practical Guide to Hydrogels for Cell Culture.</a> Nature Methods. 14, 69-81 (2016).</li><li>Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+for+use+of+tumor+spheroids+as+models+to+test+drug+delivery+and+efficacy.">Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy.</a> Journal of Control Release. , (2012).</li><li>Mehta, P., Novak, C., Raghavan, S., Ward, M., Mehta, G., Papaccio, G., Desiderio, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Renewal+and+CSCs+In+Vitro+Enrichment:+Growth+as+Floating+Spheres.">Self-Renewal and CSCs In Vitro Enrichment: Growth as Floating Spheres.</a> Cancer Stem Cells: Methods and Protocols. , 61-75 (2018).</li><li>Raghavan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+stable+small+cell+number+three-dimensional+ovarian+cancer+spheroids+using+hanging+drop+arrays+for+preclinical+drug+sensitivity+assays.">Formation of stable small cell number three-dimensional ovarian cancer spheroids using hanging drop arrays for preclinical drug sensitivity assays.</a> Gynecologic Oncology. 138, 181-189 (2015).</li><li>Raghavan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+tumor+spheroid+generation+techniques+for+differential+in+vitro+drug+toxicity.">Comparative analysis of tumor spheroid generation techniques for differential in vitro drug toxicity.</a> Oncotarget. 7, 16948-16961 (2016).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+Tumor+Evolution+via+Genomic+Profiling+of+Individual+Tumor+Spheroids+in+a+Malignant+Ascites.">Evaluating Tumor Evolution via Genomic Profiling of Individual Tumor Spheroids in a Malignant Ascites.</a> Scientific Reports. 8, 1-11 (2018).</li><li>Silva, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase+in+combination+with+CD133+defines+angiogenic+ovarian+cancer+stem+cells+that+portend+poor+patient+survival.">Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival.</a> Cancer Research. 71, 3991-4001 (2011).</li><li>Pulaski, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+alemtuzumab+as+an+anti-myeloid+cell+antiangiogenic+therapy+for+the+treatment+of+ovarian+cancer.">Identifying alemtuzumab as an anti-myeloid cell antiangiogenic therapy for the treatment of ovarian cancer.</a> Journal of Translational Medicine. 7, 49 (2009).</li><li>Jager, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+enzymatic+and+mechanical+methods+of+dissociation+on+neural+progenitor+cells+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells.</a> Advances in Medical Sciences. 61, 78-84 (2016).</li><li>Ivanov, D. P., Grabowska, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+arrays+for+high-throughput+single-cell+analysis+of+spatial+patterns+and+biomarker+expression+in+3D.">Spheroid arrays for high-throughput single-cell analysis of spatial patterns and biomarker expression in 3D.</a> Scientific Reports. 7, 41160 (2017).</li></ol>

Den 384-godt hengende drop plate plattform for 3D spheroid formasjon er en lett implementert verktøy for enhver cellebiologi eller kreft biologi laboratorier. Denne fysiologiske plattformen gjør det mulig å studere cellelinjer, i tillegg til primær pasientprøver innen fysiologisk relevante 3D-kulturer, samtidig som det gir høy gjennomstrømming for narkotika screening. Plattformen sikrer også at kultur forholdene er svært tunable, noe som gir tett kontroll over plating tetthet, celle co-kultur prosenter, ekstrace...

Verdensomspennende kreft-relatert dødelighet nådde en toll på 9 800 000 dødsfall i 20181, fremhever behovet for utvikling av forbedrede legemiddel selskap. Dessverre, er kostnaden for å utvikle kreft narkotika økende, med utviklingen av et enkelt stoff koster ca 650 000 000 USD2 indikerer behovet for forbedrede strategier for å utvikle nye anti-kreft narkotika. Kreft stamceller (CSCs), som er preget av økt chemoresistance3, evne til å fornye seg selv, og evnen til å frø nye svulster4 antas å være ansvarlig for tumor gjentakelse4, metastasering5, og chemoresistance4,6, som alle bidrar til ondartet kapasitet av svulsten og dermed høye dødstallene. I kreft i eggstokkene finnes disse cellene beriket i den ondartede ascites væsken i bukhulen, en tilstand knyttet til dårlige kliniske utfall1. Som et resultat av den ondartede evnene til CSCs, har det vært et push å utvikle nye CSC målretting narkotika å bruke i forbindelse med tradisjonelle chemotherapies. Det er flere utfordringer som følger utviklingen av CSC målretting narkotika inkludert: 1) vanskeligheter med å utvide og vedlikeholde CSCs in vitro; 2) knapphet på pasientprøver; 3) fysiologisk relevans av kulturen plattformen; og 4) heterogenitet i legemiddel følsom het mellom pasientene. Denne protokollen skisserer implementeringen av en 3D kultur plattform med høy gjennomstrømming som kan overvinne hver av disse utfordringene. Spesielt gir dette systemet for rask narkotika screening ved hjelp av et lite antall pasient-avledet eggstokkene CSCs, og er svært mottagelig for nedstrøms analyse teknikker. Selv om det er ideelt for å studere kreft i eggstokkene og CSCs, er plattformen også verdifull når det gjelder å studere andre typer kreft og forskjellige celler i komplekse 3D-miljøer.
Komplekse 3-dimensjonale (3D) modeller er avgjørende i å studere tumor mikromiljøet (TME), som er en 3D nisje bestående av kreftceller, ikke-kreft støtte celler, og ekstracellulære matrise (ECM) proteiner4. Denne 3D-miljø resulterer i unike celle morfologi, celle-celle og celle-matrise interaksjoner, celle differensiering, celle migrasjon, celle tetthet, og diffusjon graderinger sammenlignet med tradisjonelle 2D cellekultur in vitro4. Alle disse faktorene kulminere i differensial narkotika respons i 3D-kulturer, viser økt resistens og fysiologiske relevans7,8. På grunn av rollen til 3D TME i CSC differensiering og chemoresistance, er det viktig å skjermen for CSC målretting narkotika i fysiologiske microenvironments. Forbedre fysiologiske relevansen av CSC narkotika screening plattformer har potensial til å forbedre pasientens spesifikke narkotika screening, narkotika utvikling, formulering av behandlings strategier, og til slutt kliniske utfall. Det er like viktig at plattformen som brukes for narkotika screening være høy gjennomstrømming og kompatibel med nedstrøms analysemetoder for å minimere kostnader, tid og klinisk oversettelse tid lovende narkotika9.
Foreløpig er det komplekse TME best vedlikeholdt for narkotika screening applikasjoner gjennom in vivo modeller som murine syngeneic tumor modeller, cellelinje-avledet xenotransplantater, og pasient-avledet xenograft (PDX) modeller12, som de gir fysiologiske Forhold. Men den lave gjennomstrømningen natur disse modellene, samt, kostnaden, tid og tekniske ferdigheter som de krever begrenser deres nytte i rask, høy gjennomstrømming narkotika screening programmer13. Som alternativ til disse in vivo-modellene har mange in vitro 3D-modeller som bruker hydrogeler8, kultur innen mikrovæskebasert enheter eller ' organ-on-a-chip '-enheter10,14, og ikke-tilhenger kulturer3,8 har også blitt utviklet, på grunn av deres lave barriere til oppføring i form av kostnader, tid og nødvendige skillset.
Hydrogel kultur plattformer er fordelaktig i fin kontroll by over matrisen sammensetning, mekaniske egenskaper, og matrise struktur15; men de kan hemme høy tetthet cellekultur14. I tillegg kan høsting celler fra hydrogeler komplisere nedstrøms analyse, på grunn av potensielt skadelige effekter av høsting metoder15. Mikrovæskebasert enheter, derimot, er Mikroskala enheter som tillater for utdata deteksjon innenfor samme enhet og for cellekultur på fysiologisk relevante skalaer med minimalt forbruk av reagenser, redusert reaksjonstid, minimert avfall, og rask diffusjon14. Disse egenskapene gjør dem lovende plattformer for å undersøke medikament toksisitet, effekt og farmakokinetikken. Utfordringene med effektiv, målbar, reproduserbar og brukervennlig 3D cellekultur, samt, store og kostbare pumpesystemer har begrenset mikrovæskebasert applikasjoner i høy gjennomstrømming forskning10. Effektiv deteksjon oppsett og potensielt vanskelig implementering på tvers av felt har også hindret utbredt adopsjon av mikrovæskebasert systemer10.
Contrarily, spheroids generert i ikke-tilhenger forhold i roterende miksere (nutators), ultra-lav festeplater, og hengende dråper inkluderer ikke brukerdefinerte matrise-komponenter. Disse metodene er spesielt relevant for å studere eggstokkene kreft som ikke-tilhenger forholdene er representative for forholdene der spheroids vokser i bukhulen5. Innenfor disse ikke-tilhenger kultur metoder, nutator og hengende drop spheroids har vist å vise høyere komprimering, remodeling, og chemoresistance sammenlignet med spheroids generert i Ultra-Low vedlegg plater, noe som tyder på økt fysiologiske relevans16,17,18,19. På grunn av økt kapasitet for screening med høy gjennomstrømming fra mindre brønn størrelser og minimalt nødvendige celle tall, er spheroid generasjon i hengende dråpe plater en ideell plattform for narkotika screening. Her presenterer vi en tunable 3D fysiologiske plattform i 384-vel hengende drop plater, som er lett å implementere og svært mottagelig for nedstrøms analyse, noe som gjør den ideell for høy gjennomstrømning narkotika screening av eggstokkene kreft og eggstokkene CSCs.
Vår 3D fysiologiske-plattform gir alle fordelene med 3D-kultur, inkludert fysiologiske celle kontakter, diffusjon graderinger, celle tetthet og naturlig produserte ECM-proteiner, som kan bidra til realistiske narkotika responser16, 17,18,19. I tillegg, ved å generere disse spheroids med pasient-avledet CSCs, er vi i stand til å bestemme pasientens konkrete tiltak mot narkotika1 med mange tekniske replikerer samtidig, for å overvinne heterogenitet som kan finnes i pasientens svulst prøvene20. Videre har 3D-kultur vist å øke vedlikeholdet av CSC populasjoner3,16 og dermed er representativt for beriket CSC populasjoner i ascites7. Dette kombinert med enkel nedstrøms analyse, inkludert flyt flowcytometri analyse av levedyktighet og CSC proporsjoner gir optimal evaluering av CSC målretting narkotika effekt. Til slutt, denne fysiologiske plattform er forenlig med tenkelig for mangfoldig tid meningene under eksperiment, bedømmelse av cellen død og spredning, cellen organisasjon og morfologi med immunhistokjemi, løselig signal med ELISA opp på betinget medium, celle fenotyper med Flow flowcytometri, og genuttrykk etter PCR.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>ILT25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10,000 cSt Si oil</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>63148-62-9</td>
			<td>Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm tissue culture dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>130182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tube</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>FL4021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X DMEM for Serum Free Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X F12 for Serum Free Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>ILT10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies Inc.</td>
			<td>1449</td>
			<td>A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alamarBlue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>DAL1025</td>
			<td>Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALDEFLUOR assay kit</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>1700</td>
			<td>Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB)</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>1705</td>
			<td>Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor iXon x3 CCD Camera</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics and Antimycotics</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-isotype IgG2b</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-092-217</td>
			<td>Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>basic Fibroblast Growth Factor</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>78003.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy HT Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>7091000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD133-APC</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-113-184</td>
			<td>Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens Dimension Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4394</td>
			<td>Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS XL Core Cell Imaging System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AME3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - premium (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histogel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC2543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead viability kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td>Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph 7.8 Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX83 Research Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>7315D35</td>
			<td>Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates</td>
			<td>3D Biomatrix</td>
			<td>HDP1384-8</td>
			<td>Available through Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phalloidin AlexaFluor488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProJet 3500 HD Max</td>
			<td>3D Systems</td>
			<td>-</td>
			<td>3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile DI water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiJet M3 Crystal</td>
			<td>3D Systems</td>
			<td>-</td>
			<td>A biocompatible polymer material for 3D printing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

physiologic patient derived 3d spheroids for anti-neoplastic drug screening to target cancer stem cells

I denne protokollen, vi skissere fremgangsmåten for generering av tumor spheroids innen 384-vel hengende dråper for å muliggjøre høy gjennomstrømming screening av anti-kreft legemiddel selskap i en fysiologisk representant mikromiljøet. Vi skisserer dannelsen av pasienten avledet kreft stilk cellen spheroids, samt manipulering av disse spheroids for grundige analyser etter behandling. Nærmere bestemt beskriver vi innsamling av spheroid morfologi, spredning, levedyktighet, legemiddel toksisitet, celle fenotype og celle lokaliseringsdata. Denne protokollen fokuserer tungt på analyse teknikker som er lett implementeres ved hjelp av 384-godt hengende slipp plattform, noe som gjør den ideell for høy gjennomstrømming narkotika screening. Mens vi understreke viktigheten av denne modellen i eggstokkene kreft studier og kreft stilk cellen forskning, er 384-brønn plattform mottagelig for forskning av andre krefttyper og sykdom modeller, utvide nytten av plattformen til mange felt. Ved å forbedre hastigheten på personlig narkotika screening og kvaliteten på screening resultater gjennom enkelt implementert fysiologisk representative 3D-kulturer, er denne plattformen spådd til hjelp i utviklingen av nye legemiddel-og pasientspesifikke behandlings strategier, og dermed ha vidtrekkende klinisk effekt.

Spheroids dannet med cellelinjer eller pasient-avledet CSCs kan dannes med en rekke små celle tall innenfor hengende dråper (figur 2a). Spheroids skjema pålitelig med så få som 10 celler per brønn, noe som gir mulighet for bevaring av sjeldne pasientprøver. Celler innenfor disse spheroids er omgitt av andre celler i 3 dimensjoner som de ville være i Vivo, slik at for fysiologiske celle-celle-kontakter og diffusjon priser. Tumor celler i spheroids sprer seg forårsaker at spheroids ut...

Watch this Scientific Journal Video about Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells at JoVE.com

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Fysiologiske pasient avledet 3D Spheroids for anti-neoplastic Drug screening å målrette Cancer stamceller

Denne protokollen beskriver generering av pasient-avledet spheroids, og nedstrøms analyse inkludert kvantifisering av spredning, cytotoksisitet testing, flyt flowcytometri, immunofluorescence farging og konfokalmikroskopi bildebehandling, for å vurdere narkotika potensielle neoplastic legemidler. Denne protokollen støtter presisjons medisin med identifisering av spesifikke medikamenter for hver pasient og stadium av sykdom.

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Vår protokoll gir en enkel metode for 3D-cellekultur og er svært mottagelig for nedstrøms analyse. Dette letter evalueringen av heterogene pasientprøver og deres spesifikke legemiddelresponser. Fordelen med denne teknikken er at sfæroider kan dannes fra småcelletall, noe som åpner for både bevaring av knappe primære prøver, og høy gjennomstrømningsscreening for pasientspesifikke legemiddelresponser.Hengende drop-modellen skaper et fysiologisk miljø med 3D-stoffdiffusjon og svarer som tilsvarer tumorstadiet. Dette gjør det mulig å utvikle målrettede terapier og pasientspesifikke behandlinger. Denne metoden er ideell for å studere eggstokkreft, heterogenitet og utvikling av kjemoresistens.Det kan imidlertid også brukes til å studere andre kreftformer og legemiddelresistente cellepopulasjoner. Når plating sfæroider, er det viktig å pipette nøyaktige volumer. Dette sikrer konsistens mellom sfæroider.Spheroidene og deres respektive dråper er iboende skjøre og lett tapt uten riktig håndtering, derfor vil vi vise hvordan man skal plate, vedlikeholde og analysere en hengende dropplate. Viser denne prosedyren vil være Michael Bregenzer, en utdannet student fra vårt laboratorium. Start med å fylle hver brønn av seksbrønnsplaten med fire til fem milliliter autoklav deionisert vann og smøre hengende dropplate mellom lokket og bunnen av platen.Tilsett 800 til 1000 mikroliter vann rundt kanten på den hengende dropplaten for å gi et fuktig miljø og minimere fordampning. Deretter samler du 2D-dyrkede celler ved å løsne dem med trypsin, og deretter legge til seks eller åtte milliliter med medium som inneholder FBS. Aspirer cellene med 10 milliliter serologisk pipette, og deponer dem i et 15 milliliter konisk rør.Bruk et hemocytometer for å telle cellene. Forbered cellesuspensjon i henhold til manuskriptretninger, og bland forsiktig med pipetten for å sikre homogen distribusjon. Plasser tuppen av pipetten i brønnen i en vinkel på 45 grader og pipette 20 mikroliter suspensjon i hver hengende dråpe godt.Sett lokket på seksbrønnsplaten på igjen og bruk en elastisk termoplastisk stripe for å forsegle kantene. Inkuber i en standard karbondioksidfuktet inkubator og mate hengende dråper hver to til tre dager ved å legge til to til tre mikroliter cellekultur medium til hver sfæroid-inneholdende godt. For å kvantifisere spredning og levedyktighet av cellene, legg til to mikroliter filtrert resazurin-basert løsning på brønnene utpekt for spredningsanalyse og inkubere i henhold til manuskriptretning.Etter inkubasjonsperioden åpner du hengende dråpesmørbrød i et biosikkerhetsskap og tar med 384-brønnplaten med lokket fortsatt på plass til plateleseren. Plasser den i plateleseren og les platen. Lagre eksperimentet i popup-vinduet, og eksporter dataene til et regneark.Sett platen tilbake til seksbrønnsbasen og plasser den i inkubatoren. Når alle tidspunkter er lest for dagen, må platen på nysperte før du inkuberte. For å forberede sfæroider for strømningscytometrianalyse, bruk en 1000 mikroliter pipette for å samle dem fra hver brønn og deponere dem i et 15 milliliter konisk rør for disaggregation.Aliquot celle suspensjon i fem mikro sentrifuge rør slik at hvert rør inneholder minst 50.000 celler. Sentrifuger rørene ved 400 ganger G i fem minutter i en mikrocentrifuge, og aspirer deretter de supernatante og re-suspendere pellets i 100 mikroliter aldefluorbuffer. Merk rørene i henhold til manuskriptets retninger.Tilsett 0,5 mikroliter APC isotype antistoff til APC ISO-røret og ett mikroliter CD133-antistoff til ALDH CD133-røret. Tilsett deretter fem mikroliter deab-reagens og 0,5 mikroliter ALDH i DEAB-røret og ett mikroliter ALDH til ALDH CD133-røret. Vortex alle rør i noen sekunder og inkuber dem på 37 grader celsius i 45 minutter.Etter inkubasjonen, vortex alle rør igjen og sentrifuge dem på 400 ganger G i fem minutter. Merk FACS-rør i henhold til manuskriptretninger og fyll en isolert skumbeholder med is. Aspirer overnatanten fra mikrocentrifugerørene.Deretter suspenderer du den uoppdagede kontrollen i 400 mikroliter facs-buffer og resten av cellene i 400 mikroliter facs DAPI-buffer. Plasser rørene på isen til de kan analyseres på et strømningscytometer. Bruk FlowJo til å analysere dataene fra strømningssytometeret.Dobbeltklikk på den uopphetede filen, og sett Y-aksen til sidesp punkthøyde eller SSCH og X-aksen til å videresende punkthøyde eller FSCH. Klikk T-knappen ved siden av hver akse for å justere skalaen og maksimere separasjonen mellom ulike cellepopulasjoner. Deretter klikker du på Polygon Gating-knappen, tegner polygonport rundt cellepopulasjonen og merker populasjonscellene.Dobbeltklikk cellens populasjon i arbeidsområdet, og endre deretter FSC-aksen til FSC-bredde og SSC-aksen til FSC-høyden. Velg rektangelporten for å bare tegne et rektangel rundt den ytterste tette populasjonen av celler, som strekker seg over hele Y-aksen. Merk denne porten Enkeltceller.Høyreklikk deretter og kopier disse cellene i den nestede Enkeltceller-porten og lim dem inn under hvert utvalg i arbeidsområdet. Dobbeltklikk på Enkeltceller-porten nestet under DAPI-prøven for å vise enkeltcellepopulasjonen fra det prøverøret. Endre FSC-aksekanalen til DAPI-områdekanalen, og endre SSC-aksekanalen til histogrammet.Klikk på T-knappen ved siden av DAPI-aksen og klikk på Tilpass akse for å justere skalaen og maksimere separasjonen mellom DAPI-positive og DAPI negative topper. Klikk på Påfør i popup-vinduet og velg Range Gate-knappen. Spre den over DAPI negativ topp og merke denne porten Live Cells.Kopier Live Cells gate og lim den inn under Single Cells gate, under APC ISO DEAB og ALDH CD133 rør, for å velge samme del av levende celler i hvert rør. Dobbeltklikk deretter populasjonen For levende celler nestet under APC ISO-eksempelfilen, og bytt X-aksen til ALDH-området og Y-aksen til APC-området. Påfør Kvadrant gate og justere skjæringspunktet mellom porten slik som at ca 0,5% av befolkningen ligger øverst til venstre i tomten vinduet.Deretter navngi kvadrantene etter ønske, kopier og lim deretter kvadrantportene på den levende cellepopulasjonen nestet under DEAB-filen og juster den vertikale linjen slik at ca 0,15% av cellepopulasjonen ligger innenfor ALDH positiv kvadrant. Til slutt, kopiere og lime kvadrant portene til ALDH CD133 filer Live Cells befolkningen og evaluering kreft stamcelle proporsjoner basert på ALDH og CD133 proporsjoner. Denne protokollen kan brukes til høy gjennomstrømningsanalyse av pasientavledede kreftstamceller.Så lite som 10 celler per brønn kan danne pålitelige sfæroider og etter hvert som cellene sprer seg, utvider spheroidene i størrelse. Spredningskapasitet kan enkelt kvantifiseres med en resazurinbasert florescence-analyse. Effekten av legemidler på sfæroid morfologi kan visualiseres med fasekontrastavbildning og kvantifiseres ved å sammenligne resazurin florescence i ubehandlede og behandlede celler.Celledød kan valideres via tillegg av Calcein-AM og ethidium homodimer I til spheroider, etterfulgt av avbildning på et konfokalt mikroskop. Til slutt kan sfæroider høstes og spres til en enkelt cellesuspensjon for analyse med strømningscytometri, noe som gjør det mulig å skjelne effektiviteten av ulike legemiddelbehandlinger på bestemte cellepopulasjoner. For å unngå dråpetap, middels fordampning og variasjon i sfæroid størrelse, er det viktig å håndtere platene dine nøye, pipette med presisjon og forsegle hengende dråpeplater helt.For å evaluere endringer i genuttrykk og oppløselig signalisering på grunn av medikamentell behandling, kan enkeltcelleRNA-sekvensering og enzymtilknyttede immunosorberende analyser, brukes til å lette utviklingen av terapeutiske midler. Denne teknikken gjør det mulig for forskning innen onkologi, presisjonsmedisin og legemiddelutvikling å utforske intra og inter pasient heterogenitet samt kjemoresistens gjennom høy gjennomstrømning narkotika screening av små biopsier. Når du utfører denne protokollen, sørg for å bruke alt standard personlig verneutstyr.Inkludert hansker, vernebriller, laboratoriefrakker, bukser og nær-toed sko.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generering av høy gjennomstrømming tredimensjonale svulst Spheroids for narkotikarelaterte Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modellering Osteosarcoma bruker Li-Fraumeni syndrom pasient-avledede Induced Pluripotent stamceller

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Narkotikascreening av primær pasient avledet tumor xenografts i sebrafisk

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

Pasientavledede tumor utviser som en "levende" preklinisk plattform for å forutsi legemiddelresistens hos pasienter

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

En arbeidsflyt for rask screening for å identifisere potensiell kombinasjonsterapi for GBM ved bruk av pasientavledede gliomastammeceller

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Utforske mitokondriell energimetabolisme av enkelt 3D microtissue sfæroider ved hjelp av ekstracellulær fluksanalyse

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

Samlet shRNA-bibliotekscreening for å identifisere faktorer som modulerer en legemiddelresistensfenotype

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Etablering av 3-dimensjonale sfæroider fra pasientavledede tumorprøver og evaluering av deres følsomhet overfor legemidler

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Ortotopisk implantasjon av pasientavledede kreftceller hos mus rekapitulerer avansert kolorektal kreft

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies

Generering av 3D-tumorsfæroider for legemiddelevalueringsstudier

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the ...