Name: physiologic patient derived 3d spheroids for anti-neoplastic drug screening to target cancer stem cells
Uploaded: 2019-07-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells at JoVE.com

Эта работа поддерживается в первую очередь DOD OCRP Ранняя карьера Следователь премии W81XWH-13-1-0134 (GM), DOD Пилот награда W81XWH-16-1-0426 (GM), DOD Следователь Инициированный награду W81XWH-17-OCRP-IIRA (GM), Ривкин Центр рака яичников и Мичигана яичников Альянс. Исследование, о которых сообщается в этой публикации, было поддержано Национальным институтом рака Национальных институтов здравоохранения под номером премии P30CA046592. CMN поддерживается Национальным научным фондом стипендий в соответствии с Грант Омской No 1256260. MEB поддерживается Департаментом образования аспирантуры в областях национальных потребностей (GAANN) стипендий.

Все образцы пациентов собираются в соответствии с утвержденным протоколом IRB от согласных пациентов, чьи образцы де-идентифицированы после удаления опухоли и асцита.
1. Поколение сфероидов из малых номеров клеток в 384-хорошо висячие пластины Drop
<ol><li>Поместите висячие пл?...

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> All cancers Source: Globocan. , (2018).</li><li>Prasad, V., Mailankody, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+and+Development+Spending+to+Bring+a+Single+Cancer+Drug+to+Market+and+Revenues+After+Approval.">Research and Development Spending to Bring a Single Cancer Drug to Market and Revenues After Approval.</a> JAMA Internal Medicine. 177, 1569-1575 (2017).</li><li>Raghavan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+Medicine+Based+Approach+to+Model+Patterns+of+Chemoresistance+and+Tumor+Recurrence+Using+Ovarian+Cancer+Stem+Cell+Spheroids.">Personalized Medicine Based Approach to Model Patterns of Chemoresistance and Tumor Recurrence Using Ovarian Cancer Stem Cell Spheroids.</a> Clinical Cancer Research. 23 (22), 6934-6945 (2017).</li><li>Jordan, C. T., Guzman, M. L., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Stem+Cells.">Cancer Stem Cells.</a> New England Journal of Medicine. 355, 1253-1261 (2006).</li><li>Ishiguro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+Characterization+of+an+In+Vitro+Model+of+Ovarian+Cancer+Stem-like+Cells+with+an+Enhanced+Proliferative+Capacity.">Establishment and Characterization of an In Vitro Model of Ovarian Cancer Stem-like Cells with an Enhanced Proliferative Capacity.</a> Cancer Research. 76, 150-160 (2016).</li><li>P&#225;ez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Dormancy:+A+Model+of+Early+Dissemination+and+Late+Cancer+Recurrence.">Cancer Dormancy: A Model of Early Dissemination and Late Cancer Recurrence.</a> Clinical Cancer Research. 18, 645-653 (2012).</li><li>Ahmed, N., Stenvers, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+Know+Ovarian+Cancer+Ascites:+Opportunities+for+Targeted+Therapy-Based+Translational+Research.">Getting to Know Ovarian Cancer Ascites: Opportunities for Targeted Therapy-Based Translational Research.</a> Frontiers in Oncology. 3, (2013).</li><li>Pradhan, S., Clary, J. M., Seliktar, D., Lipke, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+spheroidal+cancer+model+based+on+PEG-fibrinogen+hydrogel+microspheres.">A three-dimensional spheroidal cancer model based on PEG-fibrinogen hydrogel microspheres.</a> Biomaterials. 115, 141-154 (2017).</li><li>Varna, M., Bertheau, P., Legr&#232;s, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Microenvironment+in+Human+Tumor+Xenografted+Mouse+Models.">Tumor Microenvironment in Human Tumor Xenografted Mouse Models.</a> Journal of Analytical Oncology. 3, 159-166 (2014).</li><li>Huang, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+microfluidic+cell+culture+system+for+high-throughput+perfusion+three-dimensional+cell+culture-based+assays:+Effect+of+cell+culture+model+on+the+results+of+chemosensitivity+assays.">An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: Effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays.</a> Lab on a Chip. 13, 1133-1143 (2013).</li><li>Zang, R., Li, D., Tang, I. C., Wang, J., Yang, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Based+Assays+in+High-Throughput+Screening+for+Drug+Discovery.">Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery.</a> International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. , (2012).</li><li>Murphy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+alternative+in+vivo+drug+screening+methodology:+a+single+mouse+analysis.">Evaluation of alternative in vivo drug screening methodology: a single mouse analysis.</a> Cancer Research. 76, 5798-5809 (2016).</li><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+Xenograft+models:+An+emerging+platform+for+translational+cancer+research.">Patient-derived Xenograft models: An emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).</li><li>Damiati, S., Kompella, U. B., Damiati, S. A., Kodzius, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+drug+delivery+systems+and+drug+screening.">Microfluidic devices for drug delivery systems and drug screening.</a> Genes. 9, (2018).</li><li>Caliari, S. R., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Practical+Guide+to+Hydrogels+for+Cell+Culture.">A Practical Guide to Hydrogels for Cell Culture.</a> Nature Methods. 14, 69-81 (2016).</li><li>Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+for+use+of+tumor+spheroids+as+models+to+test+drug+delivery+and+efficacy.">Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy.</a> Journal of Control Release. , (2012).</li><li>Mehta, P., Novak, C., Raghavan, S., Ward, M., Mehta, G., Papaccio, G., Desiderio, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Renewal+and+CSCs+In+Vitro+Enrichment:+Growth+as+Floating+Spheres.">Self-Renewal and CSCs In Vitro Enrichment: Growth as Floating Spheres.</a> Cancer Stem Cells: Methods and Protocols. , 61-75 (2018).</li><li>Raghavan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+stable+small+cell+number+three-dimensional+ovarian+cancer+spheroids+using+hanging+drop+arrays+for+preclinical+drug+sensitivity+assays.">Formation of stable small cell number three-dimensional ovarian cancer spheroids using hanging drop arrays for preclinical drug sensitivity assays.</a> Gynecologic Oncology. 138, 181-189 (2015).</li><li>Raghavan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+tumor+spheroid+generation+techniques+for+differential+in+vitro+drug+toxicity.">Comparative analysis of tumor spheroid generation techniques for differential in vitro drug toxicity.</a> Oncotarget. 7, 16948-16961 (2016).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+Tumor+Evolution+via+Genomic+Profiling+of+Individual+Tumor+Spheroids+in+a+Malignant+Ascites.">Evaluating Tumor Evolution via Genomic Profiling of Individual Tumor Spheroids in a Malignant Ascites.</a> Scientific Reports. 8, 1-11 (2018).</li><li>Silva, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase+in+combination+with+CD133+defines+angiogenic+ovarian+cancer+stem+cells+that+portend+poor+patient+survival.">Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival.</a> Cancer Research. 71, 3991-4001 (2011).</li><li>Pulaski, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+alemtuzumab+as+an+anti-myeloid+cell+antiangiogenic+therapy+for+the+treatment+of+ovarian+cancer.">Identifying alemtuzumab as an anti-myeloid cell antiangiogenic therapy for the treatment of ovarian cancer.</a> Journal of Translational Medicine. 7, 49 (2009).</li><li>Jager, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+enzymatic+and+mechanical+methods+of+dissociation+on+neural+progenitor+cells+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells.</a> Advances in Medical Sciences. 61, 78-84 (2016).</li><li>Ivanov, D. P., Grabowska, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+arrays+for+high-throughput+single-cell+analysis+of+spatial+patterns+and+biomarker+expression+in+3D.">Spheroid arrays for high-throughput single-cell analysis of spatial patterns and biomarker expression in 3D.</a> Scientific Reports. 7, 41160 (2017).</li></ol>

384-хорошо висит падение пластины платформы для 3D сфероидов формирования легко реализован инструмент для любой клеточной биологии или рака биологии лабораторий. Эта физиологическая платформа позволяет изучать клеточные линии, а также первичные образцы пациентов в физиологически знач...

Смертность от рака во всем мире достигла 9,8 миллионаслучаев смерти в 2018 году 1, что подчеркивает необходимость развития улучшенной терапии. К сожалению, стоимость разработки противораковых препаратов растет, при этом разработка одного лекарства стоимостью около 650 миллионов долларов США2 указывает на необходимость совершенствования стратегий разработки новых противораковых препаратов. Раковые стволовые клетки (CSCs), которые характеризуются повышенной химиорезистентности3, способность к самообновлению, и способность семян новыхопухолей4, как полагают, несет ответственность за рецидив опухоли4, метастаз 5 , и химиорезистентность4,6, которые все способствуют злокачественной способности опухоли и, следовательно, высокий уровень смертности. При раке яичников, эти клетки находятся обогащенные в злокачественных асцитов жидкости в полости перитонеальной полости, состояние, связанное с плохими клиническими исходами1. В результате злокачественных возможностей CSCs, наблюдается толчок к разработке новых CSC ориентации наркотиков для использования в сочетании с традиционной химиотерапии. Существует ряд проблем, которые сопровождают разработку CSC ориентации наркотиков, включая: 1) трудности в расширении и поддержании CSCs in vitro; 2) нехватка образцов пациентов; 3) физиологическая значимость культурной платформы; и 4) неоднородность в чувствительности к лекарственным препаратам между пациентами. В этом протоколе излагается реализация платформы 3D-культуры с высокой пропускной стоимостью, которая может преодолеть каждую из этих проблем. В частности, эта система позволяет быстро скрининг атиса с использованием небольшого числа пациентов полученных яичников CSCs, и в значительной степени поддается вниз по течению методов анализа. В то время как идеально подходит для изучения рака яичников и CSCs, наша платформа также ценна в изучении других видов рака и дифференцированных типов клеток в сложных 3D-средах.
Сложные 3-мерные (3D) модели имеют решающее значение при изучении микроокружения опухоли (TME), которая представляет собой 3D нишу, состоящую из раковых клеток, нераковых поддерживающих клеток и внеклеточных матричных (ECM) белков4. Эта 3D-среда приводит к уникальной морфологии клеток, клеток и клеточной матрицы взаимодействий, дифференциации клеток, миграции клеток, плотности клеток, и диффузии градиентов по сравнению с традиционной 2D-клеточной культуры в пробирке4. Все эти факторы кульминацией дифференциальной реакции наркотиков в 3D культур, проявляя повышенную лекарственную устойчивость и физиологическую актуальность7,8. В связи с ролью 3D TME в дифференциации CSC и химиорезности, очень важно, чтобы экран для CSC ориентации наркотиков в физиологических микросредах. Улучшение физиологической значимости платформ скрининга наркотиков CSC имеет потенциал для улучшения пациента конкретных скрининга наркотиков, разработка лекарственных средств, формулировка стратегий лечения, и в конечном итоге клинические результаты. Не менее важно, чтобы платформа, используемая для скрининга лекарственных средств, была высокой пропускной способом исовместима с методами анализа вниз по течению, чтобы свести к минимуму затраты, время и время клинического перевода перспективных препаратов 9.
В настоящее время комплекс TME лучше всего поддерживать для применения скрининга наркотиков через in vivo модели, такие как морин сингенных моделей опухолей, клеточной линии полученных ксенотрансплантатов, и пациента полученных ксенотрансплантата (PDX) модели12, как они обеспечивают физиологические Условия. Тем не менее, низкая пропускная стоимость этих моделей, а также, стоимость, время и технические навыки, которые они требуют ограничивает их полезность в быстрой, высокой пропускной стьюбиния наркотиков скрининга приложений13. В качестве альтернативы этим моделям in vivo, многие модели in vitro 3D, используя гидрогели8, культуры в микрофлюидных устройствах или устройствах "орган-на-чипе"10,14, и неприсоединения культур3,8 были также разработаны, в связи с их низким барьером для входа с точки зрения стоимости, времени и требуемого набора навыков.
Платформы культуры гидрогеля выгодны в тонком контроле, предоставляемом над матричной композицией, механическими свойствами и матричной структурой15; однако, они могут ингибировать культуру клетки высокой плотности14. Кроме того, сбор клеток из гидрогелей может осложнить анализ ниже по течению, из-за потенциально вредного воздействия методов сбора урожая15. Микрофлюидические устройства, с другой стороны, являются микромасштабными устройствами, которые позволяют обнаруживать выход в пределах одного устройства и для клеточной культуры в физиологически значимых масштабах с минимальным потреблением реагентов, снижением времени реакции, минимичными отходами и быстрая диффузия14. Эти характеристики делают их перспективными платформами для исследования токсичности, эффективности и фармакокинетики. Тем не менее, проблемы эффективной, количественной, воспроизводимой и удобной для пользователя 3D-клеточной культуры, а также громоздких и дорогостоящих насосных систем ограничили микрофлюидные приложения в высокопроизводительных исследованиях10. Эффективные установки обнаружения и потенциально трудное внедрение в различных областях также препятствуют широкому внедрению микрофлюидных систем10.
Напротив, сфероиды, генерируемые в неприсоединения в вращающихся смесителях (нутаторах), сверхнизких пластинах крепления и висячих каплях, не включают в себя матричные компоненты, определяемые пользователем. Эти методики особенно актуальны для изучения рака яичников, так как несоблюдение условий являются репрезентативными условий, в которых сфероиды растут в полости перитонеальной полости5. В рамках этих неприсоединения методы культуры, nutator и висит падение сфероидов было показано, чтобы показать более высокое уплотнение, ремоделирование, и химиорезистентность по сравнению с сфероидами, генерируемых в ультра-низких пластин вложения, предлагая увеличение физиологических актуальность16,17,18,19. Из-за увеличения емкости для высокопроизводительного скрининга от меньших размеров скважин и минимальных требуемых номеров клеток, генерация сфероидов в висячих пластинах является идеальной платформой для скрининга наркотиков. Здесь мы представляем настраиваем 3D физиологические платформы в 384-хорошо висит падение пластин, что легко реализовать и высоко поддается вниз по течению анализа, что делает его идеальным для высокой пропускной способности наркотиков скрининга рака яичников и яичников CSCs.
Наша 3D физиологическая платформа обеспечивает все преимущества 3D-культуры, в том числе физиологические контакты клеток, градиенты диффузии, плотность клеток, и естественно производства белков ECM, которые могут способствовать реалистичным лекарственным реакциям16, 17,18,19. Кроме того, генерируя эти сфероиды с помощью CSCs, полученных из пациента, мы можем определить конкретные реакции пациента на препараты1 с большим количеством технических реплик одновременно, чтобы преодолеть неоднородность, которая может быть найдена в опухоли пациента образцы20. Кроме того, 3D-культура была показана дляповышения поддержания популяций CSC 3,16 и, таким образом, является репрезентативным для обогащенных популяций CSC в ascites7. Это в сочетании с легким анализом вниз по течению, включая анализ цитометрии потока жизнеспособности и пропорций CSC позволяет оптимально оценивать эффективность CSC, нацеленную на эффективность препарата. Наконец, эта физиологичная платформа совместима с визуализацией в несколько точек времени в ходе эксперимента, оценкой гибели клеток и пролиферации, организацией клеток и морфологией с иммуногистохимией, растворимым сигнализирующим с ELISA на условии средние, клеточные фенотипы с цитометрией потока и экспрессией генов после ПЦР.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>ILT25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10,000 cSt Si oil</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>63148-62-9</td>
			<td>Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm tissue culture dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>130182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tube</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>FL4021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X DMEM for Serum Free Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X F12 for Serum Free Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>ILT10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies Inc.</td>
			<td>1449</td>
			<td>A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alamarBlue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>DAL1025</td>
			<td>Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALDEFLUOR assay kit</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>1700</td>
			<td>Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB)</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td>1705</td>
			<td>Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor iXon x3 CCD Camera</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics and Antimycotics</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-isotype IgG2b</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-092-217</td>
			<td>Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>basic Fibroblast Growth Factor</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>78003.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy HT Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>7091000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD133-APC</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-113-184</td>
			<td>Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens Dimension Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4394</td>
			<td>Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS XL Core Cell Imaging System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AME3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - premium (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histogel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC2543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead viability kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td>Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph 7.8 Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX83 Research Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>7315D35</td>
			<td>Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates</td>
			<td>3D Biomatrix</td>
			<td>HDP1384-8</td>
			<td>Available through Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phalloidin AlexaFluor488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProJet 3500 HD Max</td>
			<td>3D Systems</td>
			<td>-</td>
			<td>3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile DI water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiJet M3 Crystal</td>
			<td>3D Systems</td>
			<td>-</td>
			<td>A biocompatible polymer material for 3D printing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

physiologic patient derived 3d spheroids for anti-neoplastic drug screening to target cancer stem cells

В этом протоколе мы описываем процедуру генерации опухолевых сфероидов в 384-хорошо висячих каплях, чтобы обеспечить высокосквозной скрининг противораковой терапии в физиологически репрезентативной микросреде. Мы описываем формирование пациентов полученных сфероидов стволовых клеток, а также, манипуляции этих сфероидов для тщательного анализа после лечения наркотиками. В частности, мы описываем сбор сфероидной морфологии, пролиферации, жизнеспособности, токсичности наркотиков, фенотипа клеток и данных о локализации клеток. Этот протокол в значительной степени фокусируется на методах анализа, которые легко реализуются с помощью 384-хорошо висящей платформы drop, что делает его идеальным для скрининга с высокой пропускной проликстью наркотиков. Хотя мы подчеркиваем важность этой модели в исследованиях рака яичников и исследования стволовых клеток рака, 384-хорошо платформа поддается исследованию других типов рака и моделей заболеваний, расширяя полезность платформы во многих областях. Улучшая скорость персонализированного скрининга на наркотики и качество результатов скрининга за счет легко реализуемых физиологически репрезентативных 3D культур, эта платформа, по прогнозам, поможет в разработке новых терапевтических и специфических для пациентов стратегии лечения, и, таким образом, имеют широкое клиническое воздействие.

Сфероиды, образованные с помощью клеточных линий или csCs, полученных пациентом, могут быть сформированы с диапазоном небольших номеров клеток в пределах висячих капель(рисунок 2A). Сфероиды образуют надежно всего 10 клеток на скважину, что позволяет сохранить редкие образ...

Watch this Scientific Journal Video about Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells at JoVE.com

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Физиологические пациент выведенных 3D сфероидов для анти-неопластических наркотиков скрининга целевой рак стволовых клеток

Этот протокол описывает генерацию сфероидов, полученных из пациента, и анализ вниз по течению, включая количественную оценку пролиферации, тестирование цитотоксичности, цитометрию потока, оленивание иммунофлюоресценции и конфокальные изображения, для оценки препарата потенциал кандидатов в качестве анти-неопластической терапии. Этот протокол поддерживает прецизионную медицину с определением специфических препаратов для каждого пациента и стадии заболевания.

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Наш протокол обеспечивает простой метод для 3D-культуры клеток и очень подотменен для анализа ниже по течению. Это облегчает оценку неоднородных образцов пациентов и их конкретных ответов на наркотики. Преимущество этого метода заключается в том, что сфероиды могут быть сформированы из небольших клеточных чисел, что позволяет как для сохранения дефицитных первичных образцов, так и высокой пропускной способности скрининга для конкретных пациентов наркотиков ответов.Модель подвешивания капли создает физиологическую среду с 3D-диффузией препарата и делает реакции, соответствующие стадии опухоли. Это позволяет развиться в области целенаправленной терапии и лечения конкретных пациентов. Этот метод идеально подходит для изучения рака яичников, неоднородности и развития химиоустойчивости.Тем не менее, он также может быть использован для изучения других видов рака и лекарственно-устойчивых популяций клеток. При обливки сфероидов, важно пипетки точные объемы. Это обеспечивает консистенцию между сфероидами.Сфероиды и их соответствующие капли по своей сути хрупкие и легко теряются без надлежащей обработки, поэтому мы покажем, как правильно пластины, поддерживать и анализировать висячие пластины падение. Демонстрацией этой процедуры будет Майкл Брегенцер, аспирант нашей лаборатории. Начните с заполнения каждого хорошо из шести-хорошо пластины с четырьмя-пятью миллилитров автоклава деионизированной воды и зажатие висячие пластины падение между крышкой и нижней части пластины.Добавьте от 800 до 1000 микролитров воды вокруг края подвесной пластины капли, чтобы обеспечить влажную окружающую среду и свести к минимуму испарение. Затем соберите 2D выращенные клетки, отсоединив их трипсином, а затем добавив шесть или восемь миллилитров среды, содержащей FBS. Аспирировать клетки с 10 миллилитров серологических пипетки, и хранение их в 15 миллилитров конической трубки.Используйте гемоцитометр для подсчета клеток. Подготовьте подвеску клеток в соответствии с рукописными указаниями и аккуратно перемешайте с пипеткой, чтобы обеспечить однородное распределение. Поместите кончик пипетки в колодец под углом 45 градусов и пипетку 20 микролитров подвески в каждую висящую каплю хорошо.Поместите крышку шести-хорошо пластины обратно и использовать эластичную термопластичную полосу, чтобы запечатать края. Инкубировать в стандартном углекислом газе увлажненной инкубатор и кормить висячие капли каждые два-три дня, добавив два-три микролитров клеточной культуры среды для каждого сфероид-содержащих хорошо. Для количественной оценки пролиферации и жизнеспособности клеток добавьте два микролитера отфильтрованного раствора на основе резазурина к скважинам, предназначенным для анализа распространения и инкубации в соответствии с рукописным направлением.После инкубации период, открыть висячие сэндвич падение в биобезопасности кабинета и принести 384 хорошо пластины с крышкой еще на месте для пластины читателя. Поместите его в плиту читателя и читать пластины. Сохраните эксперимент в всплывающем окне и экспортируйте данные в электронную таблицу.Верните пластину обратно в базу из шести хорошо и поместите ее в инкубатор. После того, как все точки времени были прочитаны в течение дня, запечатать пластину перед инкубацией. Для подготовки сфероидов для анализа цитометрии потока используйте трубу из 1000 микролитров, чтобы собрать их из каждой системы и отставить в 15-миллилитровую коническую трубку для дезагрегации.Подвеска клеток Aliquot в пять микро центрифугных трубок, так что каждая трубка содержит по крайней мере 50 000 клеток. Центрифуга труб на 400 раз G в течение пяти минут в микроцентрифуге, а затем аспирировать супернатант и повторно приостановить гранулы в 100 микролитров буфера Aldefluor. Этикетка труб в соответствии с рукописными указаниями.Добавьте 0,5 микролитров изотипа APC в трубку APC ISO и один микролитер антитела CD133 к трубке ALDH CD133. Затем добавьте пять микролитров реагента DEAB и 0,5 микролитров ALDH в трубку DEAB и один микролитер ALDH в трубку ALDH CD133. Vortex все трубы в течение нескольких секунд и инкубировать их при 37 градусов по Цельсию в течение 45 минут.После инкубации, вихрь все трубы снова и центрифуги их в 400 раз G в течение пяти минут. Этикетка FACS труб в соответствии с рукописными указаниями и заполнить изолированный контейнер пены со льдом. Аспирировать супернатант из микроцентрифугных трубок.Затем повторно приостанавливаю неописуемый контроль в 400 микролитров буфера FACS и остальных ячеек в 400 микролитров буфера FACS DAPI. Поместите трубки на лед, пока они не могут быть проанализированы на цитометре потока. Используйте FlowJo для анализа данных с цитометра потока.Дважды щелкните необлебряемый файл и установите Y-ось в сторону высоты рассеяния или SSCH и X-оси для перемотки высоты рассеяния или FSCH. Нажмите кнопку T рядом с каждой оси, чтобы настроить шкалу и максимизировать разделение между различными популяциями ячеек. Далее нажмите на кнопку Polygon Gating, нарисуйте полигональные ворота вокруг популяции клеток и обозначите ячейки популяции.Дважды нажмите на популяцию ячейки в рабочем пространстве, а затем измените ось FSC на ширину FSC и ось SSC на высоту FSC. Выберите прямоугольные ворота, чтобы нарисовать прямоугольник только вокруг левой плотной популяции ячеек, охватывающей всю Y-ось. Наклеить этикетку на эти ворота одиночные ячейки.Затем нажмите правой кнопкой мыши и скопировать эти клетки в вложенных одиночных ячеек ворот и вставить их под каждый образец в рабочем пространстве. Дважды щелкните ворота Single Cells, вложенные под образцом DAPI, чтобы просмотреть популяцию одной ячейки из этой пробной трубки. Измените канал оси FSC на канал области DAPI и измените канал оси SSC на гистограмму.Нажмите на кнопку T рядом с оси DAPI и нажмите на Настраивайте ось, чтобы настроить шкалу и максимизировать разделение между положительными DAPI и отрицательными пиками DAPI. Нажмите Применить в всплывающем окне и выбрать кнопку Range Gate. Распределив его по отрицательному пику DAPI и обозначив эти ворота Live Cells.Копировать живые клетки ворота и вставить его под воротами одной клетки, под APC ISO DEAB и ALDH CD133 труб, чтобы выбрать ту же часть живых клеток в каждой трубке. Затем дважды щелкните популяцию живых ячеек, вложенных под файлом образца APC ISO, и переключите X-ось на область ALDH и Y-ось на область APC. Нанесите квадрантные ворота и отрегулируйте пересечение ворот, например, примерно 0,5% населения находится в левом верхнем левом от окна участка.Затем назовите квадранты по желанию, затем скопировать и вставить квадрантные ворота на популяцию живых клеток, вложенных под файл DEAB, и отрегулируйте вертикальную линию так, чтобы примерно 0,15% популяции клеток находится в положительном квадранте ALDH. Наконец, копировать и вставлять квадрант ворота в ALDH CD133 файлы Live Cells населения и оценки рака стволовых клеток пропорций на основе ALDH и CD133 пропорций. Этот протокол может быть использован для высокой пропускной способности анализа раковых стволовых клеток, полученных пациентом.Всего 10 клеток на колодец могут образовывать надежные сфероиды, и по мере распространения клеток сфероиды расширяются в размерах. Емкость пролиферации может быть легко количественно с помощью анализа флоресок на основе резазурина. Влияние препаратов на сфероидную морфологию можно визуализировать с помощью фазовой контрастной визуализации и количественно, сравнивая резазуриновую флуоресценцию в необработанных и обработанных клетках.Гибель клеток может быть подтверждена путем добавления Calcein-AM и этидия гомодимера I к сфероидам, а затем изображения на конфокальных микроскопов. Наконец, сфероиды могут быть собраны и рассеяны в одну клетку подвески для анализа с потоком цитометрии, что позволяет различить эффективность различных методов лечения наркотиков на конкретных популяциях клеток. Чтобы избежать потери капель, среднего испарения и изменения размера сфероида, важно обращаться с пластинами тщательно, пипетки с точностью и полностью запечатать висячие пластины падения.Для оценки изменений в экспрессии генов и растворимой сигнализации в связи с медикаментозным лечением, одноклеточное секвенирование РНК и связанные с ферментами иммуносорбентные анализы могут быть использованы для содействия развитию терапии. Этот метод позволяет исследованиям в области онкологии, точной медицины и разработки лекарственных средств для изучения внутри- и межбольгетической неоднородности, а также химиоустойчивости через высокую пропускную способность скрининга наркотиков малых биопсий. При выполнении этого протокола, не забудьте носить все стандартные средства индивидуальной защиты.Включая перчатки, защитные очки, лабораторные пальто, брюки и обувь с близкого к нося.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Поколение высокопроизводительных трехмерных опухоли сфероидов для скрининга наркотиков

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Моделирование остеосаркома, используя синдром ли Фраумени, которую пациент производные индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Скрининг наркотиков первичного пациента, полученных опухоли Xenografts в зебрафиш

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

Экспланты опухолей, полученные от пациентов, как «живая» доклиническая платформа для прогнозирования лекарственной устойчивости у пациентов

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Быстрый процесс скрининга для определения потенциальной комбинированной терапии GBM с использованием стволовых клеток глиомы, полученных от пациента

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Изучение митохондриального энергетического метаболизма одиночных 3D-сфероидов микротизюса с использованием анализа внеклеточного потока

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

Объединенный скрининг библиотеки шРНК для выявления факторов, модулирующих фенотип лекарственной устойчивости

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Создание 3-мерных сфероидов из образцов опухолей, полученных от пациентов, и оценка их чувствительности к лекарствам

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Ортотопическая имплантация раковых клеток, полученных от пациентов, у мышей повторяет прогрессирующий колоректальный рак

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies

Генерация 3D-опухолевых сфероидов для исследований по оценке лекарственных средств

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the ...