Name: use of the invertebrate galleria mellonella as an infection model to study the mycobacterium tuberculosis complex
Uploaded: 2019-06-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex at JoVE.com

وقد تم دعم هذا المشروع بمنح من مجلس بحوث التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية (BBSRC)، التي منحت لPRL وYL (BB/P001262/1)، والمركز الوطني لاستبدال الحيوانات في البحوث وصقلها والحد منها (NC3Rs) الممنوحة لـ PRL، SMN, BDR, and YL (NC/R001596/1).

ملاحظة: جميع الأعمال الموصوفة أدناه يجب القيام بها في مختبر CL2 ضمن خزانة السلامة الميكروبيولوجية من الفئة 2 (MSC) باتباع المبادئ التوجيهية المحلية للصحة والسلامة.
1. إعداد M. بوفيس BCG لوكس للعدوى
<ol><li>تذويب الجلسرين المجمد 1.2 مل (15%) الأسهم من M. بوفيس BCG لوكس, سل...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Global tuberculosis report 2018. , (2018).</li><li>Colditz, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+BCG+Vaccine+in+the+prevention+of+tuberculosis:+meta-analysis+of+the+published+literature.">Efficacy of BCG Vaccine in the prevention of tuberculosis: meta-analysis of the published literature.</a> Journal of the American Medical Association. 271 (9), 698-702 (1994).</li><li>Meijer, A. H., Spaink, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions+made+transparent+with+the+zebrafish+model.">Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model.</a> Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).</li><li>Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+tuberculosis+in+translational+and+precision+medicine.">Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 717 (2017).</li><li>Gumbo, T., Lenaerts, A. J., Hanna, D., Romero, K., Nuermberger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclinical+models+for+antituberculosis+drug+development:+a+landscape+analysis.">Nonclinical models for antituberculosis drug development: a landscape analysis.</a> Journal of Infectious Diseases. 211 (Suppl 3), S83-S95 (2015).</li><li>Williams, A., Orme, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+tuberculosis:+an+overview.">Animal models of tuberculosis: an overview.</a> Microbiology Spectrum. 4 (4), (2016).</li><li>Myllym&#228;ki, H., Niskanen, M., Oksanen, K. E., R&#228;met, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+in+tuberculosis+research+-+where+is+the+beef?.">Animal models in tuberculosis research - where is the beef?.</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (8), 871-883 (2015).</li><li>Flynn, J. L., Gideon, H. P., Mattila, J. T., Lin, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+studies+in+non-human+primate+models+of+tuberculosis.">Immunology studies in non-human primate models of tuberculosis.</a> Immunological Reviews. 264 (1), 60-73 (2015).</li><li>Cook, S. M., McArthur, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+Galleria+mellonella+as+a+model+host+for+human+pathogens.">Developing Galleria mellonella as a model host for human pathogens.</a> Virulence. 4 (5), 350-353 (2013).</li><li>Tsai, C. J. -. Y., Loh, J. M. S., Proft, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galleria+mellonella+infection+models+for+the+study+of+bacterial+diseases+and+for+antimicrobial+drug+testing.">Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing.</a> Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).</li><li>Wojda, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+of+the+greater+wax+moth+Galleria+mellonella.">Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella.</a> Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).</li><li>Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+structural+and+functional+similarities+of+insect+hemocytes+and+mammalian+phagocytes.">An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes.</a> Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).</li><li>Arteaga Blanco, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+cellular+immune+response+of+Galleria+mellonella+to+Actinobacillus+pleuropneumoniae.">Differential cellular immune response of Galleria mellonella to Actinobacillus pleuropneumoniae.</a> Cell and Tissue Research. 370 (1), 153-168 (2017).</li><li>L&#243;pez Hern&#225;ndez, Y., Yero, D., Pinos-Rodr&#237;guez, J. M., Gibert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animals+devoid+of+pulmonary+system+as+infection+models+in+the+study+of+lung+bacterial+pathogens.">Animals devoid of pulmonary system as infection models in the study of lung bacterial pathogens.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 38 (2015).</li><li>Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Insect+Galleria+mellonella+as+a+powerful+infection+model+to+investigate+bacterial+pathogenesis.">The Insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galleria+mellonella+-+a+novel+infection+model+for+the+Mycobacterium+tuberculosis+complex.">Galleria mellonella - a novel infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex.</a> Virulence. 9 (1), 1126-1137 (2018).</li><li>Meir, M., Grosfeld, T., Barkan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+validation+of+Galleria+mellonella+as+a+novel+model+organism+to+study+Mycobacterium+abscessus+infection,+pathogenesis,+and+treatment.">Establishment and validation of Galleria mellonella as a novel model organism to study Mycobacterium abscessus infection, pathogenesis, and treatment.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (4), (2018).</li><li>Entwistle, F. M., Coote, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+greater+wax+moth+larvae,+Galleria+mellonella,+as+a+novel+in+vivo+model+for+non-tuberculosis+mycobacteria+infections+and+antibiotic+treatments.">Evaluation of greater wax moth larvae, Galleria mellonella, as a novel in vivo model for non-tuberculosis mycobacteria infections and antibiotic treatments.</a> Journal of Medical Microbiology. 67 (4), 585-597 (2018).</li><li>Snewin, V. A., Gares, M., #211;gaora, P., Hasan, Z., Brown, I. N., Young, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+immunity+to+mycobacterial+infection+with+luciferase+reporter+constructs.">Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs.</a> Infection and Immunity. 67 (9), 4586-4593 (1999).</li><li>Newton, S., Martineau, A., Kampmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+whole+blood+assay+to+measure+viability+of+mycobacteria,+using+reporter-gene+tagged+BCG+or+M.Tb+(BCG+lux/M.Tb+lux).">A functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux).</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Jorj&#227;o, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+moths+to+caterpillars:+Ideal+conditions+for+Galleria+mellonella+rearing+for+in+vivo+microbiological+studies.">From moths to caterpillars: Ideal conditions for Galleria mellonella rearing for in vivo microbiological studies.</a> Virulence. 9 (1), 383-389 (2018).</li><li>Kavanagh, K., Sheehan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+Galleria+mellonella+larvae+to+identify+novel+antimicrobial+agents+against+fungal+species+of+medical+interest.">The use of Galleria mellonella larvae to identify novel antimicrobial agents against fungal species of medical interest.</a> Journal of Fungi. 4 (3), 113 (2018).</li><li>Champion, O., Titball, R., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+G.+mellonella+larvae+to+provide+reliable+and+reproducible+results+in+the+study+of+fungal+pathogens.">Standardization of G. mellonella larvae to provide reliable and reproducible results in the study of fungal pathogens.</a> Journal of Fungi. 4 (3), 108 (2018).</li><li>Wojda, I., Taszlow, P., Jakubowicz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cold+shock+on+the+immune+response+of+the+greater+wax+moth+Galleria+mellonella+after+infection+with+entomopathogenic+bacteria+Bacillus+thuringiensis.">The effect of cold shock on the immune response of the greater wax moth Galleria mellonella after infection with entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis.</a> Journal of Maria Curie-Sklodowska University. 69 (2), 7-18 (2015).</li><li>Nascimento, I. P., Leite, L. C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+passaging+in+liquid+media+and+storage+on+Mycobacterium+bovis+-+BCG+growth+capacity+and+infectivity.">The effect of passaging in liquid media and storage on Mycobacterium bovis - BCG growth capacity and infectivity.</a> FEMS Microbiology Letters. 243 (1), 81-86 (2005).</li><li>De Groote, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+studies+evaluating+mouse+models+used+for+efficacy+testing+of+experimental+drugs+against+Mycobacterium+tuberculosis.">Comparative studies evaluating mouse models used for efficacy testing of experimental drugs against Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (3), 1237-1247 (2011).</li><li>Grosset, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+early+bactericidal+activity+in+murine+tuberculosis+provides+insights+into+the+activity+of+isoniazid+and+pyrazinamide.">Modeling early bactericidal activity in murine tuberculosis provides insights into the activity of isoniazid and pyrazinamide.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 109 (37), 15001-15005 (2012).</li><li>Vogel, H., Altincicek, B., Gl&#246;ckner, G., Vilcinskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+transcriptome+and+immune-gene+repertoire+of+the+lepidopteran+model+host+Galleria+mellonella.">A comprehensive transcriptome and immune-gene repertoire of the lepidopteran model host Galleria mellonella.</a> BMC Genomics. 12, 308 (2011).</li></ol>

وقد تم تأسيس استخدام G. ميلونيلا كنموذج للعدوى لعدد من مسببات الأمراض البكتيرية والفطرية لدراسة الفوعة، والتفاعل بين المضيف وممرض، وكشاشة لعلاجات جديدة10،22. وتستند المناقشة التالية على الإجراء التجريبي لاستخدام G. ميلونيلا كنموذج للعدوى MTBC.</...

السل هو تهديد كبير للصحة العامة في العالم مع 9 ملايين حالة جديدة سنويا و 1.5 مليون حالة وفاة1. وبالإضافة إلى ذلك، ويقدر أن ربع سكان العالم مصابون بالعامل المسبب للمرض، وهو مرض السل الميكوباكتيريوم (Mtb). ومن بين المصابين، سيصاب 5-10% بمرض السل النشط على مدى حياتهم. وعلاوة على ذلك، فإن ظهور وانتشار مقاومة للأدوية المتعددة ومقاومة للأدوية على نطاق واسع يشكل تهديدا خطيرا لمكافحة الأمراض، حيث أبلغ 123 بلدا عن حالة واحدة على الأقل من حالات الـ XDR1. ويتطلب علاج السل تناول ما لا يقل عن أربعة عقاقير مضادة للبكتيريا، توصف منها الإيزونيازيد والريفامبيتسين لمدة لا تقل عن ستة أشهر؛ غالباً ما يرتبط العلاج مع الآثار الجانبية المعقدة والسموم. الحماية من اللقاح الوحيد المرخص ضد السل، الميكوباكتريوم بوفيس عصية كالميت-غيرين (BCG)، هو المتغير2. إن الفهم غير الكامل لمسببات الإمراض التي تسببها السل يعوق بشكل كبير وضع استراتيجيات علاجية وتطعيمجديدة.
على مدى عقود كانت نماذج العدوى الحيوانية حيوية لأبحاث السل لفهم مسببات الأمراض الأساسية واستجابة المضيف للعدوى، وتقييم العوامل الجديدة المضادة للبكتيريا، والعلاجات المناعية والمرشحات لقاح جديد3، 4. ومع ذلك، فإن البحوث التي تستخدم نماذج العدوى الحيوانية من السل من الصعب جدا ً ً ً، حيث أن الإمراض وتطور عدوى السل معقدة، ولا يوجد نموذج واحد للأنواع الحيوانية يحاكي الطيف الكامل والسمات الهامة للمرض5 6. وعلاوة على ذلك، فإن التجارب على الحيوانات مكلفة، وتستغرق وقتا طويلا للقيام بها وتتطلب تبريرا أخلاقيا كاملا. ومع ذلك، تم وصف نماذج العدوى الحيوانية للسل في الرئيسيات غير البشرية (مثل المكاك)، وخنازير غينيا، والأرانب، والماشية، والخنازير، والفئران وأسماك الحمار الوحشي، مع وجود حدود كل منها3،4. نموذج المورين هو النموذج الأكثر استخداما بسبب التكلفة، وتوافر خطوط أصيلة، وإمكانية تكرار العدوى ووفرة الكواشف المناعية. ومع ذلك، فإنها لا تشكل عادة الأورام الحبيبية المرتبطة بمناطق نقص الأكسجة التي هي سمة من سمات عدوى السل الكامنة (LTBI)6. والخنازير الغينية شديدة التأثر بعدوى الفيتامين المتري، مع الإصابة بأمراض الأمراض وتشكيل الورم الحبيبي المبكر على غرار تلك الموجودة لدى البشر، وتستخدم على نطاق واسع في اختبار اللقاحات؛ بعد عدم وجود الكواشف المناعية يعوق استخدامها كنموذج العدوى7. أسماك حمار وحشي مناسبة للفحص على نطاق واسع في الدراسات قبل السريرية في مرحلة مبكرة بسبب صغر حجمها، والتكاثر السريع والأدوات الوراثية المتقدمة، ولكنها مختلفة تشريحيا وفسولوجيا للبشر وغير عرضة فقط ل الميكوباكتيريوم المانوم العدوى3. النماذج الحيوانية تشبه عن كثب عدوى Mtb البشرية هي الرئيسيات غير البشرية (على سبيل المثال، المكاك)، لكنها مكلفة ولها اعتبارات أخلاقية وعملية كبيرة التي تحد إلى حد كبير من استخدامها8.
اليرقة الحشرات من العثة الشمع أكبر أو عثة العسل، غاليريا ميلونيلا ، أصبحت شعبية متزايدة كنموذج للعدوى لمجموعة متنوعة من مسببات الأمراض البكتيرية والفطرية9، وكشاشة لمرشحين المخدرات المضادة للميكروبات رواية 10. ج. ميلونيلا هو نموذج لافقاري ناجح بسبب جهازه المناعي الفطري المتطور (المؤلف من دفاعات خلوية وفكاهية) الذي يتقاسم درجة عالية من التشابه الهيكلي والوظيفي مع نسبة الفقاريات11 . وهذا يشمل آليات المناعة مثل البلوسيات من مسببات الأمراض من قبل الخلايا الهيموسيد (وظيفيا مماثلة لبلبلة الثدييات والعدلات)12،13، وإنتاج وتداول الببتيدات المضادة للميكروبات (AMPs) و البروتينات الشبيهة بالتكامل داخل الهيمولم (مشابهة لدم الثدييات) من G. ميلونيلا11. مزاياأخرى 9،14،15 من اليرقات G. ميلونيلا كنموذج تشمل 1) حجمها الكبير (20-30 ملم) الذي يسمح لسهولة التلاعب والعدوى، فضلا عن جمع الأنسجة و الهيمولم للتحاليل، 2) صيانة سهلة في 37 درجة مئوية، متوافقة لدراسة مسببات الأمراض البشرية، 3) عدوى دقيقة عن طريق الحقن دون الحاجة إلى التخدير، 4) فعالية من العوامل المضادة للميكروبات يمكن تقييماستخدام أقل المخدرات للتقييم، 5) عدم وجود القيود الأخلاقية مقارنة باستخدام الثدييات، 6) يمكن استخدام أحجام المجموعات الكبيرة مقارنة بالنماذج الحيوانية التي تسمح بقدر أكبر من الاستنساخ، و 7) يلزم أوقات أقصر لتجارب العدوى.
في دراسة حديثة، أظهرنا أن G. ميلونيلا يمكن استخدامها كنموذج عدوى جديدة لدراسة مسببات الأمراض من قبل الإضاءة الحيوية M. بوفيس BCG لوكس، وهي نسخة معدلة وراثيا من سلالة اللقاح وعضو 16 ةيلابةةيلاف ةيلاب ةيلاب ةيلاب ةيلاب ةيلاب ةيلاب ةيلا في حين تم سابقا استخدام G. ميلونيلا كنموذج للعدوى للبكتيريا الفطرية غير السلية (NTM), أساسا M. المارينيوم وخراج الميكوباكتيريوم17,18, تقتصر الدراسات باستخدام MTBC إلى أن من لي وآخرون16. سلالات ميكونجتيرية غير مسببة للأمراض، والتي يمكن استخدامها عند مستوى الاحتواء (CL) 2 كبديل لMtb، توفر مزايا السلامة والتطبيق العملي على البكتيريا الفطرية المسببة للأمراض. بعد العدوى مع BCG لوكس، تبدأ اليرقات في تطوير هياكل تشبه الورم الحبيبي المبكر ، والتي يمكن أن توفر نظرة ثاقبة قيمة في دور المناعة الفطرية في إنشاء عدوى السل16. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذا النموذج البسيط من العدوى اللافقارية ينطوي على إمكانية توفير تقييم سريع ومنخفض التكلفة وموثوق به لمسببات مرض السل يتضمن تحديًا خاضعًا للرقابة وتكرارًا متعددًا لإمكانية التكاثر. وعلاوة على ذلك، فإن النموذج ينطوي على إمكانية استخدامه لفحص المرشحين الرواية للأدوية واللقاحات المضادة للسل في مرحلة مبكرة من التطوير، مما يقلل من العدد الإجمالي للحيواناتهم في التجارب. كما أن القدرة على قياس التغيرات في هيكل المضيف والممرض، والنسخ، والبروتيتومي لتحديد أهداف المخدرات وتقييم آليات عمل العقاقير الجديدة واللقاحات العلاجية، هي أيضاً مفيدة.
هنا نحن نوصف البروتوكولات التجريبية لإعداد الإنارة الحيوية M. بوفيس BCG لوكس inoculum وG. ميلونيلا اليرقات للعدوى الفطرية، فضلا عن تحديد كل من اليرقات وmycobacterial البقاء على قيد الحياة استجابة للعدوى.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5ml reaction tube (Eppendorf)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20, 200 and 1000 &#181;l pipette and filtered tips</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well culture plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 ml pipettes and pipette boy</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 compartment Petri dish (94/15mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>637102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II saftey cabinet</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask with vented cap (250 ml)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS40183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (&#62;99.7%)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>208221.321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galleria mellonella (250 per pk)</td>
			<td>Livefood Direct UK</td>
			<td>W250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogeniser (FastPrep-24 5G )</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116005500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-240CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer (Autolumat LB 953)</td>
			<td>Berthold</td>
			<td>34622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing matrix (S, 2.0ml)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116925500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro syringe (25 &#181;l, 25 ga)</td>
			<td>SGE</td>
			<td>3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H11 agar</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>283810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 broth</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook ADC enrichment</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>212352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook OADC enrichment</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>212240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium bovis BCG lux</td>
			<td>Various</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-decyl aldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7384-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaking incubator</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 80 (Tween-80)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8074-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small box</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>dark vented or non-sealed box recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Short and narrow tipped/Blunt long tweezers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Winterm (V1.08)</td>
			<td>Berthold</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Program LB953.TTB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (94/15mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>633181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper (94mm)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cut to fit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of the invertebrate galleria mellonella as an infection model to study the mycobacterium tuberculosis complex

السل هو السبب العالمي الرئيسي لوفيات الأمراض المعدية، ويعتقد أن ما يقرب من ربع سكان العالم مصابون بالسل الميكوباكتيريوم. على الرغم من عقود من البحث، العديد من الآليات الكامنة وراء نجاح M. السل ككائن ممرض لا يزال يتعين التحقيق، وتطوير أكثر أمانا، وأكثر فعالية العقاقير المضادة للبكتيريا هناك حاجة ماسة لمعالجة ارتفاع و انتشار السل المقاوم للأدوية. ومع ذلك، فإن تطور أبحاث السل هو عنق الزجاجة من قبل نماذج عدوى الثدييات التقليدية التي هي مكلفة، وتستغرق وقتا طويلا، وتحديا أخلاقيا. في السابق أنشأنا يرقات الحشرة غاليريا ميلونيلا (عثة الشمع الأكبر) كنموذج جديد، قابل للتكرار، منخفض التكلفة، عالي الإنتاجية ومقبول أخلاقياً لأعضاء مجمع السل M. هنا نحن وصف الصيانة والإعداد، والعدوى من ج. ميلونيلا مع الميكوباكتريوم بوفيس BCG لوكس. باستخدام هذا النموذج العدوى، يمكن ملاحظة جرعة ميكونية تعتمد على الفوعة، وقراءة سريعة من العبء الفطري في الجسم الحي باستخدام قياسات الإضاءة الحيوية يمكن تحقيقها بسهولة وقابلة للاستنساخ. على الرغم من وجود قيود، مثل عدم وجود جينوم مشروح بالكامل للتحليل المستنسخ، يمكن إجراء تحليل الانطولضد ضد الحشرات المتشابهة وراثيا. كنموذج منخفض التكلفة وسريع ومقبول أخلاقيا ً للسل، يمكن استخدام G. ميلونيلا كشاشة مسبقة لتحديد فعالية الدواء وسميته، وتحديد الفيوية البكتيرية النسبية قبل استخدام الثدييات التقليدية نماذج. استخدام نموذج ج. ميلونيلا-البكتيريا الفطرية سيؤدي إلى انخفاض في عدد كبير من الحيوانات المستخدمة حاليا في أبحاث السل.

هنا نقدم البيانات التمثيلية التي يمكن الحصول عليها باستخدام G. ميلونيلا - نموذج العدوى BCG لوكس وتسليط الضوء على فوائد ج. ميلونيلا كنموذج للعدوى لأعضاء MTBC (الشكل 1). ويرد في الشكل 2موجز للإجراءات التجريبية التي تحتوي على نقاط تق...

Watch this Scientific Journal Video about Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex at JoVE.com

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

استخدام اللافقاريات جاليريا ميلونيلا كنموذج للعدوى لدراسة مجمع السل الميكوباكتيريوم

تم تأسيس غاليريا ميلونيلا مؤخرا كنموذج للعدوى القابلة للاستنساخ ورخيصة ومقبولة أخلاقيا لمجمع السل الميكوباكتيريوم. هنا نحن وصف وبيان الخطوات المتخذة لإنشاء عدوى ناجحة من ج. ميلونيلا مع الميكوباكتيريوم بوفيس BCG لوكس.

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...

يصف هذا البروتوكول استخدام جاليريا ميلونيلا كنموذج بديل للعدوى لدراسة السل، مما يقلل من عدد نماذج الثدييات المستخدمة في الأبحاث. بالمقارنة مع نماذج الثدييات التقليدية مثل الفئران، غاليريا ميلونيلا هو أرخص، ومقبول أخلاقيا، وأكثر سهولة في الوصول إلى دراسة مرض السل. وسيتيح المزيد من التحسين لهذا النموذج فحص فعالية سمية الأدوية المضادة للبكتيريا المرشحة وسُمّيتها، وسيسهم في تطوير علاجات جديدة مطلوبة على وجه السرعة لمرض السل.جاليريا ميلونيلا تمتلك جهاز المناعة الفطرية المعقدة مماثلة لتلك التي من الثدييات. وقد تكشف دراسة التفاعل بين المُمْرض المضيفين دور المناعة الفطرية في السل. لا يقتصر استخدام جاليريا ميلونيلا كنموذج للعدوى على السل وقد استخدم على نطاق واسع لمسببات الأمراض البكتيرية والفطرية الأخرى على مدى العقد الماضي.للبدء، قم بتذويب مخزون الجلسرول المجمد 1.2 ملليلتر من Mycobacterium bovis BCG لوكس، سلالة لقاح مونتريال تحولت مع بلازميد المكوك pSMT1 تحمل الجينات luxAB. في قارورة Erlenmeyer المسماة 250 ملليلتر ، تلقيح 15 ملليلتر من مرق Middlebrook 7H9 مع 1.2 ملليلتر مزيل من BCG lux. ضع القارورة في حاوية السلامة البيولوجية المغلقة واحتضانها عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة للحاكر المداري عند 220 دورة في الدقيقة لمدة 72 ساعة.بعد الحضانة، وإعداد 1:10 تخفيفات من الثقافة في المالحة الفوسفات المخزنة في أنابيب مضيئة، دوامة، وتحميل أنابيب مضيئة في المضيء. تحميل الركيزة 1٪ ن ديكيل ألدهيد في الإيثانول المطلق في منصة حاقن وقياس الإضاءة الحيوية. تحويل الإضاءة الحيوية إلى وحدات تشكيل مستعمرة للتحقق من نمو ثقافة BCG لوكس.نقل الثقافة إلى أنبوب الطرد المركزي والطرد المركزي في 2، 175 مرات ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ل بيليه الخلايا. تخلص من المطهر في مطهر مناسب مع نشاط مبيد البكتيريا المعروف. غسل بيليه الخلية مرتين في 50 ملليلتر من برنامج تلفزيوني-T عن طريق الطرد المركزي في 2, 175 مرات ز لمدة 10 دقائق لمنع تكتل البكتيرية.بعد الغسيل النهائي، decant النفايات supernatant و resuspend بيليه الخلية الفطرية في حجم المطلوب من برنامج تلفزيوني-T لتخفيف تعليق mycobacterial إلى كثافة الخلايا المطلوبة. ثم، وإعداد 10 أضعاف التخفيفات التسلسلية من inoculum في لوحات 24-جيدا باستخدام برنامج تلفزيوني-T. لوحة من أصل 10 microliters من كل تخفيف على Middlebrook 7H11 لوحات أجار في مكررة لتعداد التهم CFU inoculum.الحفاظ على اليرقات التي تم شراؤها في الظلام عند 18 درجة مئوية عند الوصول والاستخدام في غضون أسبوع واحد من الشراء. تحديد واختيار اليرقات الصحية للتجريب على أساس لون كريم موحد ، الحجم والوزن المناسبين ، والحركة العالية ، وامتلاك القدرة على الحق في أنفسهم عندما انقلبت. باستخدام ملاقط حادة النهاية ، عد بعناية اليرقات السليمة في طبق بيتري مبطن بطبقة من ورق التصفية ويخزن في درجة حرارة الغرفة في الظلام حتى الاستخدام.إعداد منصة الحقن عن طريق تسجيل ورقة تصفية دائرية قطرها 94 ملليمتر على سطح مسطح، أثار. pirate ثلاثة مجلدات من 70٪ الإيثانول في 25 ميكرولتر microsyringe لتعقيم، والتخلص وشطف مزيد من مع ثلاثة مجلدات من برنامج تلفزيوني عقيمة-T. ثم، resuspend أعدت BCG lux inoculum وpirate 10 ميكرولترات في microsyringe تعقيم.استخدام حقنة منفصلة لpirate PBS-T للسيطرة السلبية. بعد 10 حقن, resuspend BCG لوكس inoculum لضمان تعليق الخلية موحدة. استخدام ملاقط لالتقاط يرقة واحدة ووضعها على منصة الحقن.على المنصة ، اقلب اليرقة على ظهرها وشل حركتها عن طريق تأمين الرأس والذيل مع الملاقط. حدد مكان آخر البرلليج الأيسر ، عد من رأس اليرقة وأدخل بعناية طرف الإبرة بعمق خمسة إلى ستة ملليمترات في زاوية 10 إلى 20 درجة إلى الطائرة الأفقية. حقن inoculum من الحقنة.بعد كل عدوى ، نقل اليرقة المصابة إلى طبق بيتري مبطن بطبقة من ورق التصفية. يمكن لطبق بيتري واحد من 94 ملليمترًا أن يستوعب ما يصل إلى 30 يرقة. تخزين طبق بيتري في تنفيس، مربع الظلام داخل حاضنة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.مراقبة بقاء اليرقات كل 24 ساعة. تعتبر اليرقات ميتة عندما تفشل في التحرك استجابة للمس. سجل البقاء على قيد الحياة وتقييم الأهمية الإحصائية مع اختبار Mantel-Cox.كل 24 ساعة ، اختر عشوائيًا خمس يرقات مصابة واستخدم مسحة برعم قطن غارقة في 70 ٪ من الإيثانول لتعقيم أسطح اليرقات بلطف. ضع اليرقات بشكل فردي في أنابيب مصفوفة مليلتر تحتوي على 800 ميكرولترات من PBS العقيمة. ثم استخدم التجانس لتجانس اليرقات لمدة 60 ثانية في ستة أمتار في الثانية.الطرد المركزي أنابيب اللينينغ في 3، 500 مرات ز لمدة خمس ثوان لإزالة التجانس من الأغطية وdedeant بعناية التجانس في خمسة أنابيب مضيئة العقيمة بشكل فردي. حجز 100 ميكرولترات من التجانس في أنبوب تفاعل معقمة 1.5 ملليلتر. استعادة أي تجانس المتبقية عن طريق غسل أنابيب مصفوفة lysing مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني T والماصات في أنابيب مضيئة المقابلة.دوامة أنابيب مضيئة وقياس الإضاءة الحيوية من تجانس على مضيئة. ثم، وإعداد 10 أضعاف التخفيفات التسلسلية من 100 ميكرولترات محفوظة من تجانس في لوحات ثقافة 24-well باستخدام PBS-T. Pipette 10 ميكرولترات من التخفيف على كل لوحة Middlebrook 7H11 أجار واستخدام موزع لوحة معقمة لنشر.احتضان في 37 درجة مئوية لمدة أسبوعين. بعد ذلك، عد وحدات تشكيل مستعمرة. تحديد نسبة RLU إلى CFU من BCG لوكس التالية في العدوى الجسمية.في هذه التجربة ، لوحظت ضراوة تعتمد على الجرعة BCG في يرقات G.mellonella على مدى فترة حضانة مدتها 96 ساعة. تم تحديد الجرعة القاتلة اللازمة لوفيات اليرقات بنسبة 50٪، لتكون مرة واحدة 10 مرات إلى قوة سبعة CFU. لم تؤثر مجموعات التحكم التي تم حقنها بجرعة 10 ميكرولتر من PBS-T أو تلك التي تم وخزها ببساطة على إصابات إبرة الإبرة على صحة اليرقات أو تؤدي إلى زيادة في الوفيات.بالنسبة لليرقات المصابة بـ 10 مرات إلى قوة سبع جرعة من CFU من BCG lux ، لوحظ اتمّر الخط الظهري من 48 ساعة بعد العدوى وتم ملاحظة الميلانة الجهازية من 96 ساعة بعد العدوى. العدوى مع مرة واحدة 10 إلى قوة جرعة CFU سبع من BCG لوكس أدى إلى انخفاض أولي للضبابية الحيوية في غضون أول 72 ساعة بعد العدوى. ومع ذلك ، بعد 72 ساعة بعد العدوى ، بدأت الإضاءة الحيوية لـ BCG lux في الهضبة ، مما يشير إلى إنشاء عدوى مستمرة.في هذا النظام العدوى خاصة، وتراوحت نسبة في الجسم الحي من RLU و CFU 2:1 إلى 5:1 بمتوسط 4:1 على مدى 168 ساعة دورة زمنية. أثناء الحقن ، تذكر تأمين اليرقات بحيث يتم تقليل خطر الإفراط في البكرة. ثقب عرضي في الأمعاء يمكن أن يؤدي إلى زيادة معدل الوفيات.من خلال إجراء تحليل الهستوباتي ، يمكن تصور إدخال الميكوبتريا مع الخلايا المضيفة. ويمكن أن يكشف المزيد من التحليلات المستنسخة التفاعل على المستوى الجينومي. وقد يسمح استخدام نموذج العدوى هذا بإجراء اختبار سريع لمرشحين رواية للمخدرات في مرحلة مبكرة من التطور، مما يقلل كثيرا من عدد الحيوانات المستخدمة في فحص المخدرات.يتطلب نموذج العدوى هذا استخدام الحقنة ، والتي يمكن أن ترتبط مع إصابة إبرة عصا. نوصي باستخدام تقنية الحقن لتقليل هذه المخاطر.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

إدخال إجهاد القص في دراسة الالتصاق الجرثومي

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

نمو المتفطرة السلية الأغشية الحيوية

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

والحشرات<em&gt; جاليريا mellonella</em&gt; نموذجا عدوى قوية المعنية بالتحقيق في إمراض البكتيرية

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

نموذج تجريبي لدراسة الملاريا والسل عدوى مرافقة على انتقال الطبيعية السل المتفطرة و المتصورة berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

استخدام<em&gt; غاليريا mellonella</em&gt; كما كائن نموذج لدراسة<em&gt; البكتيريا المستروحة</em&gt; عدوى

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

مما يدل على متعدد المخدرات مقاومة<em&gt; السل المتفطرة</em&gt; التضخيم ميكروأري

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

إنشاء والأمثل لإعداد إنتاجية عالية لدراسة<em&gt; المكورات العنقودية البشروية</em&gt; و<em&gt; المتفطرة البحرية</em&gt; عدوى نموذجا لاكتشاف المخدرات

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

نموذج الأنسجة 3D الرئة الإنسان للدراسات وظيفية على<em&gt; المتفطرة السلية</em&gt; العدوى

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

تحليل 18"فدج التصوير" PET/CT كأداة لدراسة بكتريا السل العدوى والعلاج في الإنسان عدم الرئيسات

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

تصوير بكتريا السل في الفئران مع "مراسل إنزيم الأسفار"

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...