Name: use of the invertebrate galleria mellonella as an infection model to study the mycobacterium tuberculosis complex
Uploaded: 2019-06-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex at JoVE.com

Dette projekt blev støttet af tilskud fra Forskningsrådet for bioteknologi og biologisk videnskab (BBSRC), der blev tildelt PRL og YL (BB/P001262/1), og det nationale center for erstatning, forbedring og reduktion af dyr i forskning (NC3Rs), der blev tildelt PRL, SMN, BDR og YL (NC/R001596/1).

Bemærk: alt arbejde, der er beskrevet nedenfor, skal udføres i et CL2-laboratorium i et mikrobiologisk sikkerhedskabinet i klasse 2 (MSC) efter lokale sundheds-og sikkerhedsretningslinjer.
1. klargøring af M. bovis BCG Lux for infektion
<ol><li>Optøning af en frossen 1,2 mL glycerol (15%) lager af M. bovis BCG Lux, blev Montreal vaccinestammen omdannet med shuttle plasmid pSMT1 transporterer Luxab gener fra Vibrio harveyi kodning af l...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Global tuberculosis report 2018. , (2018).</li><li>Colditz, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+BCG+Vaccine+in+the+prevention+of+tuberculosis:+meta-analysis+of+the+published+literature.">Efficacy of BCG Vaccine in the prevention of tuberculosis: meta-analysis of the published literature.</a> Journal of the American Medical Association. 271 (9), 698-702 (1994).</li><li>Meijer, A. H., Spaink, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions+made+transparent+with+the+zebrafish+model.">Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model.</a> Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).</li><li>Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+tuberculosis+in+translational+and+precision+medicine.">Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 717 (2017).</li><li>Gumbo, T., Lenaerts, A. J., Hanna, D., Romero, K., Nuermberger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclinical+models+for+antituberculosis+drug+development:+a+landscape+analysis.">Nonclinical models for antituberculosis drug development: a landscape analysis.</a> Journal of Infectious Diseases. 211 (Suppl 3), S83-S95 (2015).</li><li>Williams, A., Orme, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+tuberculosis:+an+overview.">Animal models of tuberculosis: an overview.</a> Microbiology Spectrum. 4 (4), (2016).</li><li>Myllym&#228;ki, H., Niskanen, M., Oksanen, K. E., R&#228;met, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+in+tuberculosis+research+-+where+is+the+beef?.">Animal models in tuberculosis research - where is the beef?.</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (8), 871-883 (2015).</li><li>Flynn, J. L., Gideon, H. P., Mattila, J. T., Lin, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+studies+in+non-human+primate+models+of+tuberculosis.">Immunology studies in non-human primate models of tuberculosis.</a> Immunological Reviews. 264 (1), 60-73 (2015).</li><li>Cook, S. M., McArthur, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+Galleria+mellonella+as+a+model+host+for+human+pathogens.">Developing Galleria mellonella as a model host for human pathogens.</a> Virulence. 4 (5), 350-353 (2013).</li><li>Tsai, C. J. -. Y., Loh, J. M. S., Proft, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galleria+mellonella+infection+models+for+the+study+of+bacterial+diseases+and+for+antimicrobial+drug+testing.">Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing.</a> Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).</li><li>Wojda, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+of+the+greater+wax+moth+Galleria+mellonella.">Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella.</a> Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).</li><li>Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+structural+and+functional+similarities+of+insect+hemocytes+and+mammalian+phagocytes.">An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes.</a> Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).</li><li>Arteaga Blanco, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+cellular+immune+response+of+Galleria+mellonella+to+Actinobacillus+pleuropneumoniae.">Differential cellular immune response of Galleria mellonella to Actinobacillus pleuropneumoniae.</a> Cell and Tissue Research. 370 (1), 153-168 (2017).</li><li>L&#243;pez Hern&#225;ndez, Y., Yero, D., Pinos-Rodr&#237;guez, J. M., Gibert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animals+devoid+of+pulmonary+system+as+infection+models+in+the+study+of+lung+bacterial+pathogens.">Animals devoid of pulmonary system as infection models in the study of lung bacterial pathogens.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 38 (2015).</li><li>Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Insect+Galleria+mellonella+as+a+powerful+infection+model+to+investigate+bacterial+pathogenesis.">The Insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galleria+mellonella+-+a+novel+infection+model+for+the+Mycobacterium+tuberculosis+complex.">Galleria mellonella - a novel infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex.</a> Virulence. 9 (1), 1126-1137 (2018).</li><li>Meir, M., Grosfeld, T., Barkan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+validation+of+Galleria+mellonella+as+a+novel+model+organism+to+study+Mycobacterium+abscessus+infection,+pathogenesis,+and+treatment.">Establishment and validation of Galleria mellonella as a novel model organism to study Mycobacterium abscessus infection, pathogenesis, and treatment.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (4), (2018).</li><li>Entwistle, F. M., Coote, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+greater+wax+moth+larvae,+Galleria+mellonella,+as+a+novel+in+vivo+model+for+non-tuberculosis+mycobacteria+infections+and+antibiotic+treatments.">Evaluation of greater wax moth larvae, Galleria mellonella, as a novel in vivo model for non-tuberculosis mycobacteria infections and antibiotic treatments.</a> Journal of Medical Microbiology. 67 (4), 585-597 (2018).</li><li>Snewin, V. A., Gares, M., #211;gaora, P., Hasan, Z., Brown, I. N., Young, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+immunity+to+mycobacterial+infection+with+luciferase+reporter+constructs.">Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs.</a> Infection and Immunity. 67 (9), 4586-4593 (1999).</li><li>Newton, S., Martineau, A., Kampmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+whole+blood+assay+to+measure+viability+of+mycobacteria,+using+reporter-gene+tagged+BCG+or+M.Tb+(BCG+lux/M.Tb+lux).">A functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux).</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Jorj&#227;o, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+moths+to+caterpillars:+Ideal+conditions+for+Galleria+mellonella+rearing+for+in+vivo+microbiological+studies.">From moths to caterpillars: Ideal conditions for Galleria mellonella rearing for in vivo microbiological studies.</a> Virulence. 9 (1), 383-389 (2018).</li><li>Kavanagh, K., Sheehan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+Galleria+mellonella+larvae+to+identify+novel+antimicrobial+agents+against+fungal+species+of+medical+interest.">The use of Galleria mellonella larvae to identify novel antimicrobial agents against fungal species of medical interest.</a> Journal of Fungi. 4 (3), 113 (2018).</li><li>Champion, O., Titball, R., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+G.+mellonella+larvae+to+provide+reliable+and+reproducible+results+in+the+study+of+fungal+pathogens.">Standardization of G. mellonella larvae to provide reliable and reproducible results in the study of fungal pathogens.</a> Journal of Fungi. 4 (3), 108 (2018).</li><li>Wojda, I., Taszlow, P., Jakubowicz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cold+shock+on+the+immune+response+of+the+greater+wax+moth+Galleria+mellonella+after+infection+with+entomopathogenic+bacteria+Bacillus+thuringiensis.">The effect of cold shock on the immune response of the greater wax moth Galleria mellonella after infection with entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis.</a> Journal of Maria Curie-Sklodowska University. 69 (2), 7-18 (2015).</li><li>Nascimento, I. P., Leite, L. C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+passaging+in+liquid+media+and+storage+on+Mycobacterium+bovis+-+BCG+growth+capacity+and+infectivity.">The effect of passaging in liquid media and storage on Mycobacterium bovis - BCG growth capacity and infectivity.</a> FEMS Microbiology Letters. 243 (1), 81-86 (2005).</li><li>De Groote, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+studies+evaluating+mouse+models+used+for+efficacy+testing+of+experimental+drugs+against+Mycobacterium+tuberculosis.">Comparative studies evaluating mouse models used for efficacy testing of experimental drugs against Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (3), 1237-1247 (2011).</li><li>Grosset, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+early+bactericidal+activity+in+murine+tuberculosis+provides+insights+into+the+activity+of+isoniazid+and+pyrazinamide.">Modeling early bactericidal activity in murine tuberculosis provides insights into the activity of isoniazid and pyrazinamide.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 109 (37), 15001-15005 (2012).</li><li>Vogel, H., Altincicek, B., Gl&#246;ckner, G., Vilcinskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+transcriptome+and+immune-gene+repertoire+of+the+lepidopteran+model+host+Galleria+mellonella.">A comprehensive transcriptome and immune-gene repertoire of the lepidopteran model host Galleria mellonella.</a> BMC Genomics. 12, 308 (2011).</li></ol>

Brugen af G. mellonella som en infektions model er blevet fastlagt for en række bakterielle og svampe patogener til studiet af virulens, Host-pathogen interaktion, og som en skærm for ny terapeutisk medicin10,22. Følgende diskussion er baseret på den eksperimentelle procedure for anvendelse af G. mellonella som en infektion model for mtbc.
Sundhedstilstanden hos de naive larver før eksperimenteren kan ha...

Tuberkulose (TB) er en stor trussel mod den globale folkesundhed med 9.000.000 nye tilfælde om året og 1.500.000 dødsfald1. Desuden skønnes det, at en fjerdedel af verdens befolkning er inficeret med sygdommens sygdomsfremkaldende agens, Mycobacterium tuberkulose (MTB). Blandt den inficerede population vil 5 − 10% udvikle aktiv TB-sygdom i løbet af deres levetid. Desuden udgør fremkomsten og spredningen af multi-drug resistente (MDR) og ekstensivt-Drug (XDR) resistent MTB en alvorlig trussel mod sygdomsbekæmpelse, med 123 lande, der rapporterer mindst én XDR sag1. Behandling af TB kræver en cocktail af mindst fire anti-mykobakterielle lægemidler, hvoraf isoniazid og rifampicin ordineres i en periode på mindst seks måneder; behandling er ofte forbundet med komplekse bivirkninger og toksiciteter. Beskyttelse mod den eneste licenserede vaccine mod TB, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), er variabel2. En ufuldstændig forståelse af patogenesen af TB hæmmer i væsentlig grad udviklingen af nye terapeutiske og vaccinationsstrategier.
I årtier har dyre infektions modeller været afgørende for TB-forskning for at forstå den grundlæggende patogenese og vært respons på infektion, og for at vurdere nye anti-mykobakterielle midler, immuno-Therapeutics og nye vaccinekandidater3, 4. men, forskning ved hjælp af dyre infektion modeller af TB er notorisk svært som patogenesen og progression af TB-infektion er komplekse, og der er ingen enkelt dyr model, der efterligner det fulde spektrum og vigtige træk ved sygdommen5 ,6. Desuden er dyreforsøg dyre, tidskrævende at gennemføre og kræver fuld etisk begrundelse. Ikke desto mindre er dyre infektions modeller af TB blevet beskrevet i ikke-humane primater (f. eks. makakaber), marsvin, kaniner, kvæg, grise, mus og zebrafisk, idet hver af dem har deres begrænsninger på3,4. Den murine model er den mest almindeligt anvendte model på grund af omkostningerne, tilgængeligheden af indavlede linjer, reproducerbarhed af infektion og overflod af immunologiske reagenser. Men, de ikke typisk danner granulomer forbundet med områder af hypoxi, der er karakteristiske for latent tuberkuloseinfektion (LTBI)6. Marsvin er meget modtagelige for MTB infektion, med patologi og tidlig granuloma dannelse svarende til dem i mennesker, og er meget udbredt i vaccine test; men manglen på immunologiske reagenser hæmmer deres anvendelse som en infektion model7. Zebrafish er velegnet til storstilet screening i tidlige stadie prækliniske studier på grund af deres lille størrelse, hurtige reproduktion og avancerede genetiske værktøjer, men er anatomisk og fysiologisk forskellige for mennesker og er kun modtagelige for Mycobacterium Marinum infektion3. De dyremodeller, der mest ligner humane MTB -infektioner, er ikke-menneskelige primater (f. eks. makakkerne), men de er dyre og har væsentlige etiske og praktiske overvejelser, som begrænser deres anvendelse betydeligt8.
Den insekt larve af de større voks møl eller Honeycomb møl, Galleria mellonella, er blevet stadig mere populære som en infektion model for en bred vifte af bakterielle og svampe patogener9, og som en skærm for nye antimikrobielle stof kandidater 10. G. mellonella er en succesfuld Invertebrat model på grund af sit sofistikerede medfødte immunsystem (bestående af cellulære og humorale forsvar), der deler en høj grad af strukturel og funktionel lighed med, at hvirveldyr11 . Dette omfatter immun mekanismer såsom fagocytose af patogener af hæocytter (funktionelt svarer til pattedyrs makrofag og neutrofiler)12,13, produktion og cirkulation af antimikrobielle peptider (ampere) og komplement lignende proteiner i hæmolymph (analogt med pattedyr blod) af G. mellonella11. Andre fordele9,14,15 af G. mellonella larver som model omfatter 1) deres store størrelse (20 − 30 mm), som giver mulighed for nem manipulation og infektion, samt indsamling af væv og hæmolymph til analyser, 2) nem vedligeholdelse ved 37 °C, kompatibel til at studere humane patogener, 3) præcis infektion ved injektion uden behov for anæstesi, 4) effekten af antimikrobielle stoffer kan vurderes udnytte mindre lægemiddel til evaluering, 5) manglende etiske begrænsninger sammenlignet med brug af pattedyr, 6) store gruppestørrelser kan anvendes sammenlignet med dyremodeller, der giver større reproducerbarhed, og 7) kortere tid for infektions forsøg er påkrævet.
I en nylig undersøgelse, viste vi, at G. mellonella kan bruges som en ny infektion model for at studere patogenesen af infektion med bioluminescent M. bovis BCG Lux, en genetisk modificeret version af vaccinestammen og medlems af MTB Complex (mtbc)16. Mens G. mellonella tidligere har været anvendt som infektions model for ikke-tuberkuløse mykobakterier (NTM), hovedsagelig M. Marinum og Mycobacterium abscessus17,18, er studier med mtbc begrænset til af Li et al.16. Bioluminescerende ikke-patogene mykobakterielle stammer, som kan anvendes på indeslutningsniveau (CL) 2 som et surrogat for MTB, tilbyder fordelene ved sikkerhed og funktionalitet over patogene mykobakterier. Efter infektion med BCG Luxbegynder larverne at udvikle tidlige granuloma-lignende strukturer, som kan give værdifuld indsigt i den medfødte Immunitets rolle ved etablering af TB-infektion16. Desuden, denne enkle hvirvelløse infektion model har potentiale til at give en hurtig, billig, og pålidelig evaluering af TB patogenesen indarbejde kontrolleret udfordring og flere replikater for reproducerbarhed. Desuden har modellen potentialet til at blive brugt til at screene nye anti-TB-lægemidler og vaccinekandidater i den tidlige udvikling, hvilket reducerer det samlede antal dyr i eksperimenter. Evnen til at måle ændringer i Host og patogen struktur, transkriptomer og proteom til at bestemme narkotika mål og vurdere virkningsmekanismer af nye lægemidler og terapeutiske vacciner, er også fordelagtige.
Her beskriver vi forsøgsprotokollerne til forberedelse af en bioluminescent M. bovis BCG Lux inokulum og G. mellonella larver til mykobakteriel infektion, samt bestemmelse af både larve og mykobakterielle overlevelse som reaktion på infektion.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5ml reaction tube (Eppendorf)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20, 200 and 1000 &#181;l pipette and filtered tips</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well culture plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 ml pipettes and pipette boy</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 compartment Petri dish (94/15mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>637102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II saftey cabinet</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask with vented cap (250 ml)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS40183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (&#62;99.7%)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>208221.321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galleria mellonella (250 per pk)</td>
			<td>Livefood Direct UK</td>
			<td>W250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogeniser (FastPrep-24 5G )</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116005500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-240CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer (Autolumat LB 953)</td>
			<td>Berthold</td>
			<td>34622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing matrix (S, 2.0ml)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116925500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro syringe (25 &#181;l, 25 ga)</td>
			<td>SGE</td>
			<td>3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H11 agar</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>283810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 broth</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook ADC enrichment</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>212352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook OADC enrichment</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>212240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium bovis BCG lux</td>
			<td>Various</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-decyl aldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7384-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaking incubator</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 80 (Tween-80)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8074-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small box</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>dark vented or non-sealed box recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Short and narrow tipped/Blunt long tweezers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Winterm (V1.08)</td>
			<td>Berthold</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Program LB953.TTB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (94/15mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>633181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper (94mm)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cut to fit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of the invertebrate galleria mellonella as an infection model to study the mycobacterium tuberculosis complex

Tuberkulose er den førende globale årsag til dødeligheden blandt smitsomme sygdomme, og omkring en fjerdedel af verdens befolkning menes at være inficeret med Mycobacterium tuberkulose. Trods årtiers forskning er mange af mekanismerne bag succesen med M. tuberkulose som en patogen organisme endnu ikke undersøgt, og udviklingen af sikrere og mere effektive Antimykobakterielle lægemidler er tvingende nødvendige for at tackle stigningen og spredning af lægemiddel resistent tuberkulose. Udviklingen af tuberkulose forskning er imidlertid flavoret af traditionelle pattedyrs infektions modeller, som er dyre, tidskrævende og etisk udfordrende. Tidligere etablerede vi larverne af insektet Galleria mellonella (større voks møl) som en roman, reproducerbar, lav pris, høj-gennemløb og etisk acceptabel infektion model for medlemmer af M. tuberkulose kompleks. Her beskriver vi vedligeholdelse, klargøring og infektion af G. mellonella med bioluminescent Mycobacterium bovis BCG Lux. Ved hjælp af denne infektions model kan der observeres mykobakteriel dosisafhængig virulens, og en hurtig aflæsning af in vivo-mykobakteriel byrde ved hjælp af bioluminiscenmålinger er let opnåelig og reproducerbar. Selv om der findes begrænsninger, såsom manglen på et fuldt kommenteret genom til transkriptomic analyse, kan der foretages en ontologisk analyse mod genetisk lignende insekter. Som en lav pris, hurtig og etisk acceptabel model for tuberkulose, G. mellonella kan bruges som en pre-Screen til at bestemme lægemidlets virkning og toksicitet, og til at bestemme komparativ mycobakterielle virulens før brugen af konventionelle pattedyr Modeller. Anvendelsen af G. mellonella-mycobakterier-modellen vil føre til en reduktion af det betydelige antal dyr, der i øjeblikket anvendes til tuberkulose forskning.

Her præsenterer vi repræsentative data, der kan opnås ved hjælp af g. mellonella -BCG Lux infektion model og fremhæve fordelene ved g. mellonella som en infektion model for medlemmer af mtbc (figur 1). Eksperimentelle procedurer med vigtige tekniske punkter er skitseret i figur 2.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload...

Watch this Scientific Journal Video about Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex at JoVE.com

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Brug af invertebrate Galleria mellonella som en infektions model til undersøgelse af Mycobacterium tuberkulose komplekset

Galleria mellonella blev for nylig etableret som en reproducerbar, billig, og etisk acceptabel infektion model for Mycobacterium tuberkulose kompleks. Her beskriver og demonstrerer vi de skridt, der er taget for at etablere en vellykket infektion af G. mellonella med bioluminescent Mycobacterium bovis BCG Lux.

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...

Denne protokol beskriver brugen af Galleria mellonella som en alternativ infektion model til at studere tuberkulose, reducere antallet af pattedyr modeller, der anvendes i forskning. Sammenlignet med konventionelle pattedyr modeller såsom mus, Galleria mellonella er en billigere, etisk acceptabel, og mere tilgængelig model til at studere tuberkulose. Yderligere optimering af denne model vil give mulighed for screening af kandidat antimykobakterielle lægemidler effektivitet og toksicitet og vil bidrage til udviklingen af hårdt tiltrænede nye terapeutiske for tuberkulose.Galleria mellonella har et komplekst medfødt immunsystem, der kan sammenlignes med pattedyr. Undersøgelsen af værtspatogen interaktion kan yderligere afsløre den rolle, medfødte immunitet i tuberkulose. Brugen af Galleria mellonella som infektionsmodel er ikke begrænset til tuberkulose og har været meget udbredt til andre bakterie- og svampepatogener i løbet af det seneste årti.Til at begynde, optø en frossen 1,2-milliliter glycerol bestand af Mycobacterium bovis BCG lux, Montreal vaccine stamme omdannet med shuttle plasmid pSMT1 transporterer luxAB gener. I en mærket 250-milliliter Erlenmeyer kolbe, inokulere 15 milliliter Middlebrook 7H9 bouillon med en optøet 1,2-milliliter aliquot af BCG lux. Kolben anbringes i en forseglet biosikkerhedsbeholder og inkuberes ved 37 grader Celsius i en orbitalshalsepumpe ved 220 omdrejninger i 72 timer.Efter inkubation forberedes 1:10 fortyndinger af kulturen i fosfatbufferet saltvand i lysometerrør, vortex, og lysometerrørene indlæses i luminometeret. Underlaget 1%n-decylaldehyd ind i injektorplatformen indlades, og bioluminescens måles. Omvend bioluminescensen til kolonidannende enheder for at kontrollere væksten af BCG lux kultur.Overfør kulturen til et centrifugerør og centrifuge ved 2, 175 gange g i 10 minutter ved stuetemperatur for at pellete cellerne. Supernatanten kasseres i et passende desinfektionsmiddel med kendt mykobaktericidaktivitet. Cellepellet vaskes to gange i 50 milliliter PBS-T ved centrifugering ved 2, 175 gange g i 10 minutter for at forhindre bakterieklumpning.Efter den endelige vask, dekantere affald supernatant og resuspend den mykobakterielle celle pellet i den nødvendige mængde PBS-T at fortynde mykobakterielle suspension til den ønskede celletæthed. Derefter forberedes 10 gange serielle fortyndinger af inokulum i 24-brøndplader ved hjælp af PBS-T. Plade ud 10 mikroliter af hver fortynding på Middlebrook 7H11 agar plader i duplikeret til optælle inoculum CFU tæller.Vedligehold de købte instar larver i mørke ved 18 grader Celsius ved ankomsten og brug inden for en uge efter købet. Identificer og vælg sunde larver til eksperimenter baseret på ensartet creme farve, passende størrelse og vægt, høj motilitet, og besidder evnen til at rette sig selv, når vendt. Brug stump-end pincet, omhyggeligt tælle den sunde larver i en petriskål foret med et lag af filterpapir og opbevares ved stuetemperatur i mørke, indtil brug.Forbered injektionsplatformen ved at tape et cirkulært filterpapir med en diameter på 94 millimeter til en flad, hævet overflade. Aspirere tre volumener af 70% ethanol i en 25-mikroliter microsyringe at sterilisere, kassere og yderligere skylle med tre mængder af sterile PBS-T. Derefter resuspend den forberedte BCG lux inoculum og aspirere 10 mikroliter i steriliserede microsyringe.Brug en separat sprøjte til at aspirere PBS-T for en negativ kontrol. Efter 10 injektioner, resuspend bcg lux inoculum at sikre ensartet celle suspension. Brug en pincet til at afhente en larver og placere på injektion platform.På platformen, flip larverne på ryggen og immobilisere ved at sikre hoved og hale med pincet. Find den sidste venstre proleg, tælle ned fra hovedet af larverne og forsigtigt indsætte spidsen af nålen fem til seks millimeter dyb i en 10 til 20-graders vinkel til det vandrette plan. Injicer inokulumet fra sprøjten.Efter hver infektion, overføre den inficerede larver i en petriskål foret med et lag af filterpapir. En enkelt 94-millimeter petriskål kan rumme op til 30 larver. Opbevar petriskålen i en udluftet, mørk kasse inde i en inkubator ved 37 grader Celsius med 5 % kuldioxid.Overvåg larvernes overlevelse hver 24. Larver betragtes som døde, når de undlader at bevæge sig som reaktion på berøring. Optag overlevelsen og vurder statistisk signifikans med Mantel-Cox-testen.Hver 24 timer, tilfældigt vælge fem inficerede larver og bruge en vatpind dyppet i 70% ethanol til forsigtigt at sterilisere larve overflader. Larverne anbringes individuelt i to milliliterlysende matrixrør indeholdende 800 mikroliter steril PBS. Brug derefter en homogenisator til at homogenisere larverne i 60 sekunder ved seks meter i sekundet.Lysrørene centrifugeres ved 3,500 gange g i fem sekunder for at fjerne homogenatet fra lågene og forsigtigt dekantere homogenatet i fem sterile lysometerrør individuelt. Reserve 100 mikroliter homogen i et sterilt 1,5 milliliter reaktionsrør. Eventuelle resterende homogeniseringer genvindes ved at vaske lysingsmatrixrørene med en milliliter PBS-T og pipette i de tilsvarende lysometerrør.Vortex luminometerrørene og mål homogenens bioluminescens på et luminometer. Derefter forberedes 10 gange serielle fortyndinger af de reserverede 100 mikroliter homogen i 24-brønds kulturplader ved hjælp af PBS-T. Pipette 10 mikroliter af fortyndingen på hver Middlebrook 7H11 agar plade og bruge en steril plade spreder til at sprede.Inkubere ved 37 grader Celsius i to uger. Derefter skal du tælle kolonidannende enheder. RLU-til CFU-forholdet for BCG lux bestemmes efter in vivo-infektion.I dette eksperiment blev DER observeret BCG lux dosisafhængig virulens hos G.mellonella larver over en 96-timers inkubationstid. Den dødelige dosis, der kræves for 50% larvedødelighed blev bestemt til at være en gange 10 til magt syv CFU. Kontrolgrupper injiceret med en 10-mikroliter dosis PBS-T eller dem, der blot prikkede simulerer nåleskader påvirkede ikke larve sundhed eller føre til en stigning i dødeligheden.For larver inficeret med de to gange 10 til magt syv CFU dosis af BCG lux, melanisering af larve dorsale linje blev observeret fra 48 timer efter infektion og systemisk melanisering blev observeret fra 96 timer efter infektion. Infektion med en en gange 10 til magt syv CFU dosis af BCG lux resulterede i en indledende nedgang i bioluminescens inden for de første 72 timer efter infektion. Men efter 72 timer efter infektion, bioluminescens af BCG lux begyndte at plateau, hvilket indikerer etablering af vedvarende infektion.I dette særlige infektionssystem varierede forholdet mellem RLU og CFU fra 2:1 til 5:1 med et gennemsnit på 4:1 i løbet af 168-timers tidsforløbet. Under injektionen skal du huske at fastgøre larverne, så risikoen for overforbrug minimeres. Utilsigtet punktering af tarmen kan føre til øget dødelighed.Ved at udføre histopatologisk analyse kan indførelsen af mycobakterier med værtscellerne visualiseres. Yderligere transskriptionsanalyse kunne afsløre samspillet på genomisk niveau. Brugen af denne infektionsmodel kan give mulighed for hurtig testning af nye lægemiddelkandidater på et tidligt stadium i udviklingen, hvilket reducerer antallet af dyr, der anvendes i lægemiddelscreening, betydeligt.Denne infektion model kræver brug af en sprøjte, som kan være forbundet med nål-stick skade. Vi anbefaler brug af vores injektionsteknik for at minimere en sådan risiko.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Vækst af Mycobacterium tuberculosis Biofilm

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The Insect<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Som en kraftfuld Infektion modellen til bakteriel patogenese

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

En eksperimentel model til at studere tuberkulose-Malaria coinfektion på Natural Transmission af Mycobacterium tuberculosis Og Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Anvendelse af<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Som en model organisme til at studere<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infektion

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Demonstration af en multiresistent<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Forstærkning Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Etablering og optimering af en High Throughput Setup til at studere<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Og<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infektion som model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

En 3D Menneskelig Lung Tissue Model for Funktionelle Undersøgelser om<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infektion

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analyse af 18FDG PET/CT billeddannelse som et redskab til at studere Mycobacterium tuberculosis infektion og behandling i ikke-menneskelige primater

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberkulose i mus med Reporter enzym fluorescens

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...