Name: use of the invertebrate galleria mellonella as an infection model to study the mycobacterium tuberculosis complex
Uploaded: 2019-06-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex at JoVE.com

Dieses Projekt wurde durch Zuschüsse des Biotechnology and Biological Science Research Council (BBSRC) unterstützt, das PRL und YL (BB/P001262/1) und dem National Center for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (NC3Rs) an PRL, SMN, BDR und YL (NC/R001596/1).

HINWEIS: Alle nachstehend beschriebenen Arbeiten sind in einem CL2-Labor innerhalb eines mikrobiologischen Sicherheitsschranks der Klasse 2 (MSC) gemäß den örtlichen Gesundheits- und Sicherheitsrichtlinien durchzuführen.
1. Vorbereitung von M. bovis BCG lux für Infektionen
<ol><li>Auftauen eines gefrorenen 1,2 ml Glycerins (15%) Bestand von M. bovis BCG lux, dem Montrealer Impfstoffstamm, der mit dem Shuttle-Plasmid pSMT1 transformiert wurde, das die ...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Global tuberculosis report 2018. , (2018).</li><li>Colditz, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+BCG+Vaccine+in+the+prevention+of+tuberculosis:+meta-analysis+of+the+published+literature.">Efficacy of BCG Vaccine in the prevention of tuberculosis: meta-analysis of the published literature.</a> Journal of the American Medical Association. 271 (9), 698-702 (1994).</li><li>Meijer, A. H., Spaink, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions+made+transparent+with+the+zebrafish+model.">Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model.</a> Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).</li><li>Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+tuberculosis+in+translational+and+precision+medicine.">Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 717 (2017).</li><li>Gumbo, T., Lenaerts, A. J., Hanna, D., Romero, K., Nuermberger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclinical+models+for+antituberculosis+drug+development:+a+landscape+analysis.">Nonclinical models for antituberculosis drug development: a landscape analysis.</a> Journal of Infectious Diseases. 211 (Suppl 3), S83-S95 (2015).</li><li>Williams, A., Orme, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+tuberculosis:+an+overview.">Animal models of tuberculosis: an overview.</a> Microbiology Spectrum. 4 (4), (2016).</li><li>Myllym&#228;ki, H., Niskanen, M., Oksanen, K. E., R&#228;met, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+in+tuberculosis+research+-+where+is+the+beef?.">Animal models in tuberculosis research - where is the beef?.</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (8), 871-883 (2015).</li><li>Flynn, J. L., Gideon, H. P., Mattila, J. T., Lin, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+studies+in+non-human+primate+models+of+tuberculosis.">Immunology studies in non-human primate models of tuberculosis.</a> Immunological Reviews. 264 (1), 60-73 (2015).</li><li>Cook, S. M., McArthur, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+Galleria+mellonella+as+a+model+host+for+human+pathogens.">Developing Galleria mellonella as a model host for human pathogens.</a> Virulence. 4 (5), 350-353 (2013).</li><li>Tsai, C. J. -. Y., Loh, J. M. S., Proft, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galleria+mellonella+infection+models+for+the+study+of+bacterial+diseases+and+for+antimicrobial+drug+testing.">Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing.</a> Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).</li><li>Wojda, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+of+the+greater+wax+moth+Galleria+mellonella.">Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella.</a> Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).</li><li>Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+structural+and+functional+similarities+of+insect+hemocytes+and+mammalian+phagocytes.">An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes.</a> Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).</li><li>Arteaga Blanco, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+cellular+immune+response+of+Galleria+mellonella+to+Actinobacillus+pleuropneumoniae.">Differential cellular immune response of Galleria mellonella to Actinobacillus pleuropneumoniae.</a> Cell and Tissue Research. 370 (1), 153-168 (2017).</li><li>L&#243;pez Hern&#225;ndez, Y., Yero, D., Pinos-Rodr&#237;guez, J. M., Gibert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animals+devoid+of+pulmonary+system+as+infection+models+in+the+study+of+lung+bacterial+pathogens.">Animals devoid of pulmonary system as infection models in the study of lung bacterial pathogens.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 38 (2015).</li><li>Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Insect+Galleria+mellonella+as+a+powerful+infection+model+to+investigate+bacterial+pathogenesis.">The Insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galleria+mellonella+-+a+novel+infection+model+for+the+Mycobacterium+tuberculosis+complex.">Galleria mellonella - a novel infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex.</a> Virulence. 9 (1), 1126-1137 (2018).</li><li>Meir, M., Grosfeld, T., Barkan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+validation+of+Galleria+mellonella+as+a+novel+model+organism+to+study+Mycobacterium+abscessus+infection,+pathogenesis,+and+treatment.">Establishment and validation of Galleria mellonella as a novel model organism to study Mycobacterium abscessus infection, pathogenesis, and treatment.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (4), (2018).</li><li>Entwistle, F. M., Coote, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+greater+wax+moth+larvae,+Galleria+mellonella,+as+a+novel+in+vivo+model+for+non-tuberculosis+mycobacteria+infections+and+antibiotic+treatments.">Evaluation of greater wax moth larvae, Galleria mellonella, as a novel in vivo model for non-tuberculosis mycobacteria infections and antibiotic treatments.</a> Journal of Medical Microbiology. 67 (4), 585-597 (2018).</li><li>Snewin, V. A., Gares, M., #211;gaora, P., Hasan, Z., Brown, I. N., Young, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+immunity+to+mycobacterial+infection+with+luciferase+reporter+constructs.">Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs.</a> Infection and Immunity. 67 (9), 4586-4593 (1999).</li><li>Newton, S., Martineau, A., Kampmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+whole+blood+assay+to+measure+viability+of+mycobacteria,+using+reporter-gene+tagged+BCG+or+M.Tb+(BCG+lux/M.Tb+lux).">A functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux).</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Jorj&#227;o, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+moths+to+caterpillars:+Ideal+conditions+for+Galleria+mellonella+rearing+for+in+vivo+microbiological+studies.">From moths to caterpillars: Ideal conditions for Galleria mellonella rearing for in vivo microbiological studies.</a> Virulence. 9 (1), 383-389 (2018).</li><li>Kavanagh, K., Sheehan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+Galleria+mellonella+larvae+to+identify+novel+antimicrobial+agents+against+fungal+species+of+medical+interest.">The use of Galleria mellonella larvae to identify novel antimicrobial agents against fungal species of medical interest.</a> Journal of Fungi. 4 (3), 113 (2018).</li><li>Champion, O., Titball, R., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+G.+mellonella+larvae+to+provide+reliable+and+reproducible+results+in+the+study+of+fungal+pathogens.">Standardization of G. mellonella larvae to provide reliable and reproducible results in the study of fungal pathogens.</a> Journal of Fungi. 4 (3), 108 (2018).</li><li>Wojda, I., Taszlow, P., Jakubowicz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cold+shock+on+the+immune+response+of+the+greater+wax+moth+Galleria+mellonella+after+infection+with+entomopathogenic+bacteria+Bacillus+thuringiensis.">The effect of cold shock on the immune response of the greater wax moth Galleria mellonella after infection with entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis.</a> Journal of Maria Curie-Sklodowska University. 69 (2), 7-18 (2015).</li><li>Nascimento, I. P., Leite, L. C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+passaging+in+liquid+media+and+storage+on+Mycobacterium+bovis+-+BCG+growth+capacity+and+infectivity.">The effect of passaging in liquid media and storage on Mycobacterium bovis - BCG growth capacity and infectivity.</a> FEMS Microbiology Letters. 243 (1), 81-86 (2005).</li><li>De Groote, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+studies+evaluating+mouse+models+used+for+efficacy+testing+of+experimental+drugs+against+Mycobacterium+tuberculosis.">Comparative studies evaluating mouse models used for efficacy testing of experimental drugs against Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (3), 1237-1247 (2011).</li><li>Grosset, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+early+bactericidal+activity+in+murine+tuberculosis+provides+insights+into+the+activity+of+isoniazid+and+pyrazinamide.">Modeling early bactericidal activity in murine tuberculosis provides insights into the activity of isoniazid and pyrazinamide.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 109 (37), 15001-15005 (2012).</li><li>Vogel, H., Altincicek, B., Gl&#246;ckner, G., Vilcinskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+transcriptome+and+immune-gene+repertoire+of+the+lepidopteran+model+host+Galleria+mellonella.">A comprehensive transcriptome and immune-gene repertoire of the lepidopteran model host Galleria mellonella.</a> BMC Genomics. 12, 308 (2011).</li></ol>

Die Verwendung von G. mellonella als Infektionsmodell wurde für eine Reihe von bakteriellen und Pilzpathogenen für die Untersuchung von Virulenz, Wirt-Pathogen-Interaktion, und als Bildschirm für neuartige Therapeutika10,22etabliert. Die folgende Diskussion basiert auf dem experimentellen Verfahren zur Verwendung von G. mellonella als Infektionsmodell für die MTBC.
Die Gesundheit der naiven Larven vor dem...

Tuberkulose (TB) stellt eine große Bedrohung für die globale öffentliche Gesundheit dar, mit 9 Millionen neuen Fällen pro Jahr und 1,5 Millionen Todesfällen1. Darüber hinaus wird geschätzt, dass ein Viertel der Weltbevölkerung mit dem Erreger der Krankheit infiziert ist, Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Unter der infizierten Bevölkerung werden 5 bis 10 % im Laufe ihres Lebens eine aktive TB-Krankheit entwickeln. Darüber hinaus stellt das Aufkommen und die Ausbreitung von multiresistentem (MDR) und extensiv-medikamentösem (XDR) resistentem Mtb eine ernste Bedrohung für die Seuchenbekämpfung dar, wobei 123 Länder mindestens einen XDR-Fallmelden 1. Die Behandlung von TB erfordert einen Cocktail von mindestens vier antimykobakteriellen Medikamenten, von denen Isoniazid und Rifampicin für eine Mindestdauer von sechs Monaten verschrieben werden; Behandlung ist oft mit komplexen Nebenwirkungen und Toxizitäten verbunden. Der Schutz vor dem einzigen zugelassenen Impfstoff gegen TB, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), ist variabel2. Ein unvollständiges Verständnis der Pathogenese von TB behindert die Entwicklung neuer Therapie- und Impfstrategien erheblich.
Seit Jahrzehnten sind Tierinfektionsmodelle für die TB-Forschung von entscheidender Bedeutung, um die grundlegende Pathogenese und die Wirtsreaktion auf Infektionen zu verstehen und neuartige antimykobakterielle Wirkstoffe, Immuntherapeutika und neue Impfstoffkandidaten zu bewerten3, 4. Die Forschung mit Tierinfektionsmodellen von TB ist jedoch notorisch schwierig, da die Pathogenese und das Fortschreiten der TB-Infektion komplex sind und es kein einzelnes Tiermodell gibt, das das gesamte Spektrum und wichtige Merkmale der Krankheit imitiert5 ,6. Darüber hinaus sind Tierversuche teuer, zeitaufwändig und erfordern eine vollständige ethische Rechtfertigung. Dennoch wurden Tierinfektionsmodelle von TB bei nichtmenschlichen Primaten (z. B. Makaken), Meerschweinchen, Kaninchen, Rindern, Schweinen, Mäusen und Zebrafischen beschrieben, wobei jeder seine Einschränkungenhat 3,4. Das murine Modell ist das am häufigsten verwendete Modell aufgrund von Kosten, Verfügbarkeit von inzuchtlinien, Reproduzierbarkeit der Infektion und Fülle von immunologischen Reagenzien. Sie bilden jedoch in der Regel keine Granulome, die mit Hypoxiegebieten assoziiert sind, die für eine latente Tuberkuloseinfektion (LTBI) charakteristisch sind (LTBI)6. Meerschweinchen sind sehr anfällig für Mtb-Infektionen, mit Pathologie und frühe Granulombildung ähnlich denen beim Menschen, und sind weit verbreitet in Impfstofftests verwendet; doch der Mangel an immunologischen Reagenzien behindert ihre Verwendung als Infektionsmodell7. Zebrafische eignen sich aufgrund ihrer geringen Größe, schnellen Fortpflanzung und fortgeschrittenen genetischen Werkzeuge für großangelegte Screenings in präklinischen Studien im Frühstadium, sind aber anatomisch und physiologisch verschieden vom Menschen und nur anfällig für Mycobacterium marinum Infektion3. Die Tiermodelle, die der menschlichen Mtb-Infektion am ehesten ähneln, sind nichtmenschliche Primaten (z.B. der Makaken), aber sie sind teuer und haben erhebliche ethische und praktische Überlegungen, die ihre Verwendung erheblich einschränkt8.
Die Insektenlarven der größeren Wachsmotte oder Wabenmotte,Galleria mellonella, sind als Infektionsmodell für eine Vielzahl von bakteriellen und Pilzpathogenen9und als Bildschirm für neuartige antimikrobielle Wirkstoffkandidaten immer beliebter geworden. 10. G. mellonella ist ein erfolgreiches Wirbellosenmodell aufgrund seines ausgeklügelten angeborenen Immunsystems (bestehend aus zellulären und humoralen Abwehrmaßnahmen), das einen hohen Grad an struktureller und funktioneller Ähnlichkeit mit dem von Wirbeltieren teilt11 . Dazu gehören Immunmechanismen wie die Phagozytose von Krankheitserregern durch Hämozyten (funktionell ähnlich wie Säugetiermakrophagen und Neutrophile)12,13, die Produktion und Zirkulation von antimikrobiellen Peptiden (AMPs) und Komplement-ähnliche Proteine innerhalb der Hämolymphe (analog zum Säugetierblut) von G. mellonella11. Weitere Vorteile9,14,15 von G. mellonella Larven als Modell sind 1) ihre große Größe (20 x 30 mm), die eine einfache Manipulation und Infektion ermöglicht, sowie die Sammlung von Gewebe und Hämolymphe für Analysen, 2) einfache Wartung bei 37 °C, kompatibel zur Untersuchung menschlicher Krankheitserreger, 3) präzise Injektion ohne Anästhesie, 4) Wirksamkeit antimikrobieller Wirkstoffe kann mit weniger Wirkstoff zur Bewertung beurteilt werden, 5) Mangel an ethische Zwänge im Vergleich zur Verwendung von Säugetieren, 6) große Gruppengrößen können im Vergleich zu Tiermodellen verwendet werden, die eine größere Reproduzierbarkeit ermöglichen, und 7) kürzere Zeiten für Infektionsexperimente sind erforderlich.
In einer aktuellen Studie haben wir gezeigt, dass G. mellonella als neuartiges Infektionsmodell zur Untersuchung der Pathogenese von Infektionen durch biolumineszierende M. bovis BCG lux, eine genetisch veränderte Version des Impfstoffstamms und des Mtb-Komplexes (MTBC)16. Während G. mellonella bisher als Infektionsmodell für nicht-tuberkulöse Mykobakterien (NTM) verwendet wurde, sind vor allem M. marinum und Mycobacterium abscessus17,18, Studien mit MTBC auf die von Li et al.16. Biolumineszierende nichtpathogene mykobakterielle Stämme, die auf Containment-Ebene (CL) 2 als Ersatz für Mtb eingesetzt werden können, bieten die Vorteile von Sicherheit und Praktikabilität gegenüber pathogenen Mykobakterien. Nach der Infektion mit BCG luxbeginnen Larven, frühe granulomähnliche Strukturen zu entwickeln, die wertvolle Einblicke in die Rolle der angeborenen Immunität bei der Etablierung einer TB-Infektion bieten könnten16. Darüber hinaus hat dieses einfache Modell für wirbellose Infektionen das Potenzial, eine schnelle, kostengünstige und zuverlässige Bewertung der TB-Pathogenese zu ermöglichen, die eine kontrollierte Herausforderung und mehrere Replikationen zur Reproduzierbarkeit umfasst. Darüber hinaus hat das Modell das Potenzial, in der frühen Entwicklung neue Anti-TB-Medikamente und Impfstoffkandidaten zu testen, wodurch die Gesamtzahl der Versuchstiere reduziert wird. Die Fähigkeit, Veränderungen in der Wirts- und Pathogenstruktur, Transkriptom und Proteom zu messen, um Arzneimittelziele zu bestimmen und Wirkmechanismen neuartiger Medikamente und therapeutischer Impfstoffe zu bewerten, ist ebenfalls von Vorteil.
Hier beschreiben wir die experimentellen Protokolle zur Herstellung eines biolumineszierenden M. bovis BCG lux inoculum und G. mellonella larven für mykobakterielle Infektionen, sowie die Bestimmung von Larven und mykobakteriellen Überleben als Reaktion auf eine Infektion.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5ml reaction tube (Eppendorf)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20, 200 and 1000 &#181;l pipette and filtered tips</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well culture plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 ml pipettes and pipette boy</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 compartment Petri dish (94/15mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>637102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II saftey cabinet</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask with vented cap (250 ml)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS40183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (&#62;99.7%)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>208221.321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galleria mellonella (250 per pk)</td>
			<td>Livefood Direct UK</td>
			<td>W250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogeniser (FastPrep-24 5G )</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116005500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-240CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer (Autolumat LB 953)</td>
			<td>Berthold</td>
			<td>34622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing matrix (S, 2.0ml)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116925500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro syringe (25 &#181;l, 25 ga)</td>
			<td>SGE</td>
			<td>3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H11 agar</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>283810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 broth</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook ADC enrichment</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>212352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook OADC enrichment</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>212240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium bovis BCG lux</td>
			<td>Various</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-decyl aldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7384-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaking incubator</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 80 (Tween-80)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8074-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small box</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>dark vented or non-sealed box recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Short and narrow tipped/Blunt long tweezers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Winterm (V1.08)</td>
			<td>Berthold</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Program LB953.TTB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (94/15mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>633181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper (94mm)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cut to fit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of the invertebrate galleria mellonella as an infection model to study the mycobacterium tuberculosis complex

Tuberkulose ist die weltweit führende Ursache für die Sterblichkeit von Infektionskrankheiten und etwa ein Viertel der Weltbevölkerung wird angenommen, dass sie mit Mycobacterium tuberculosisinfiziert ist. Trotz jahrzehntelanger Forschung müssen viele der Mechanismen hinter dem Erfolg von M. tuberculosis als pathogener Organismus noch untersucht werden, und die Entwicklung sichererer, wirksamerer antimykobakterieller Medikamente ist dringend erforderlich, um dem Anstieg und der Ausbreitung der medikamentenresistenten Tuberkulose. Das Fortschreiten der Tuberkuloseforschung wird jedoch durch traditionelle Säugetierinfektionsmodelle, die teuer, zeitaufwändig und ethisch anspruchsvoll sind, in einen Engpass gesteckt. Zuvor haben wir die Larven des Insekts Galleria mellonella (größere Wachsmotte) als neuartiges, reproduzierbares, kostengünstiges, hochdurchlässiges und ethisch akzeptables Infektionsmodell für Mitglieder des M. tuberculosis-Komplexes etabliert. Hier beschreiben wir die Erhaltung, Zubereitung und Infektion von G. mellonella mit biolumineszierendem Mycobacterium bovis BCG lux. Mit diesem Infektionsmodell kann eine mykobakterielle dosisabhängige Virulenz beobachtet werden, und eine schnelle Auslesung der in vivo mykobakteriellen Belastung mittels Biolumineszenzmessungen ist leicht erreichbar und reproduzierbar. Obwohl es Einschränkungen gibt, wie das Fehlen eines vollständig kommentierten Genoms für die transkriptomische Analyse, kann eine ontologische Analyse gegen genetisch ähnliche Insekten durchgeführt werden. Als kostengünstiges, schnelles und ethisch akzeptables Modell für Tuberkulose kann G. mellonella als Vorscreen verwendet werden, um die Wirksamkeit und Toxizität von Arzneimitteln zu bestimmen und die vergleichende mykobakterielle Virulenz vor der Anwendung konventioneller Säugetiere zu bestimmen. Modelle. Die Verwendung des G. mellonella-Mykobakterien-Modells wird zu einer Verringerung der beträchtlichen Anzahl von Tieren führen, die derzeit in der Tuberkuloseforschung verwendet werden.

Hier stellen wir repräsentative Daten vor, die mit dem Modell g. mellonella — BCG lux infektionsmodell erhalten werden können und heben die Vorteile von G. mellonella als Infektionsmodell für Mitglieder des MTBC hervor (Abbildung 1). Experimentelle Verfahren mit wichtigen technischen Punkten sind in Abbildung 2beschrieben.
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Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Verwendung der wirbellosen Galleria mellonella als Infektionsmodell zur Untersuchung des Mycobacterium tuberculosis Complex

Galleria mellonella wurde vor kurzem als reproduzierbares, billiges und ethisch akzeptables Infektionsmodell für den Mycobacterium tuberculosis-Komplex etabliert. Hier beschreiben und zeigen wir die Schritte, die unternommen wurden, um eine erfolgreiche Infektion von G. mellonella mit biolumineszierendem Mycobacterium bovis BCG lux zu etablieren.

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Galleria mellonella als alternatives Infektionsmodell zur Untersuchung der Tuberkulose, wodurch die Anzahl der in der Forschung verwendeten Säugetiermodelle reduziert wird. Im Vergleich zu herkömmlichen Säugetiermodellen wie Mäusen ist Galleria mellonella ein billigeres, ethisch akzeptables und zugänglicheres Modell zur Untersuchung von Tuberkulose. Eine weitere Optimierung dieses Modells wird das Screening der Wirksamkeit und Toxizität von Kandidaten antimykobakteriellen Arzneimitteln ermöglichen und zur Entwicklung dringend benötigter neuartiger Therapeutika für Tuberkulose beitragen.Galleria mellonella besitzt ein komplexes angeborenes Immunsystem, das mit dem von Säugetieren vergleichbar ist. Die Untersuchung der Wirts-Pathogen-Wechselwirkung kann die Rolle der angeborenen Immunität bei Tuberkulose weiter aufzeigen. Die Verwendung von Galleria mellonella als Infektionsmodell ist nicht auf Tuberkulose beschränkt und wurde in den letzten zehn Jahren häufig für andere bakterielle und Pilzerreger verwendet.Zunächst entfrosten Sie einen gefrorenen 1,2-Milliliter-Glyzerinbestand von Mycobacterium bovis BCG lux, dem Montrealer Impfstoffstamm, der mit dem Shuttle-Plasmid pSMT1 mit den LuxAB-Genen transformiert wurde. In einem beschrifteten 250-Milliliter-Erlenmeyer-Kolben impfen Sie 15 Milliliter Middlebrook 7H9-Brühe mit einem aufgetauten 1,2-Milliliter-Aliquot von BCG Lux. Legen Sie den Kolben in einen versiegelten Biosicherheitsbehälter und brüten Sie bei 37 Grad Celsius in einem Orbital-Shaker-Inkubator bei 220 U/min für 72 Stunden.Nach der Inkubation 1:10 Verdünnungen der Kultur in phosphatgepufferter Kochsaline in Luminometerröhren, Wirbel vorbereiten und die Luminometerröhren in das Luminometer laden. Das Substrat 1%n-decylaldehyd in absolutem Ethanol in die Injektorplattform laden und die Biolumineszenz messen. Konvertieren Sie die Biolumineszenz in koloniebildende Einheiten, um das Wachstum der BCG-Luxkultur zu überprüfen.Übertragen Sie die Kultur auf ein Zentrifugenrohr und eine Zentrifuge bei 2, 175 mal g für 10 Minuten bei Raumtemperatur, um die Zellen zu pellet. Entsorgen Sie den Überstand in ein geeignetes Desinfektionsmittel mit bekannter mykobakterizider Aktivität. Waschen Sie das Zellpellet zweimal in 50 Milliliter PBS-T durch Zentrifugieren bei 2, 175 mal g für 10 Minuten, um bakterielle Verklumpung zu verhindern.Nach der Endwäsche dekantieren Sie den Abfallüberstand und setzen Sie das mykobakterielle Zellpellet im erforderlichen Volumen von PBS-T wieder auf, um die mykobakterielle Suspension auf die gewünschte Zelldichte zu verdünnen. Bereiten Sie dann 10-fache serielle Verdünnungen des Inokulums in 24-Well-Platten mit PBS-T vor. 10 Mikroliter jeder Verdünnung auf Middlebrook 7H11 Agarplatten in Doppelter Ausführung aufteilen, um inokulum CFU-Zahlen aufzuzählen.Halten Sie die gekauften Instar Larven in der Dunkelheit bei 18 Grad Celsius bei der Ankunft und verwenden Sie innerhalb einer Woche nach dem Kauf. Identifizieren und wählen Sie gesunde Larven für Experimente basierend auf gleichmäßiger Cremefarbe, geeigneter Größe und Gewicht, hoher Beweglichkeit und besitzen die Fähigkeit, sich selbst zu recht, wenn sie umgedreht. Mit stumpfer End-Pinzette die gesunden Larven sorgfältig in eine Petrischale zu zählen, die mit einer Schicht Filterpapier ausgekleidet ist, und bei Raumtemperatur im Dunkeln bis zum Gebrauch aufbewahren.Bereiten Sie die Injektionsplattform vor, indem Sie ein kreisförmiges Filterpapier mit 94 Millimeterdurchmesser auf eine flache, erhöhte Oberfläche kleben. Aspirieren Sie drei Volumina von 70% Ethanol in eine 25-Mikroliter-Mikrospritze, um sie mit drei Volumen sterilem PBS-T zu sterilisieren, zu entsorgen und weiter zu spülen. Dann setzen Sie das vorbereitete BCG lux inoculum wieder auf und aspirieren 10 Mikroliter in die sterilisierte Mikrospritze.Verwenden Sie eine separate Spritze, um PBS-T für eine Negative Kontrolle zu aspirieren. Nach 10 Injektionen, setzen Sie das BCG lux Inoculum wieder auf, um eine gleichmäßige Zellsuspension zu gewährleisten. Verwenden Sie eine Pinzette, um eine Larve aufzunehmen und auf die Injektionsplattform zu legen.Auf der Plattform, kippen Sie die Larve auf den Rücken und immobilisieren, indem Sie den Kopf und Schwanz mit der Pinzette zu sichern. Suchen Sie das letzte linke Proleg, zählen Sie vom Kopf der Larve herunter und legen Sie die Spitze der Nadel vorsichtig fünf bis sechs Millimeter tief in einem 10 bis 20-Grad-Winkel auf die horizontale Ebene ein. Injizieren Sie das Inokulum aus der Spritze.Nach jeder Infektion, übertragen Sie die infizierte Larve in eine Petrischale mit einer Schicht Filterpapier ausgekleidet. Eine einzelne 94-Millimeter-Petrischale bietet Platz für bis zu 30 Larven. Bewahren Sie die Petrischale in einer entlüfteten, dunklen Box in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid auf.Überwachen Sie das Überleben der Larven alle 24 Stunden. Larven gelten als tot, wenn sie sich nicht als Reaktion auf Berührung bewegen. Zeichnen Sie das Überleben auf und bewerten Sie die statistische Signifikanz mit dem Mantel-Cox-Test.Wählen Sie alle 24 Stunden nach dem Zufallsprinzip fünf infizierte Larven aus und verwenden Sie einen in 70% Ethanol getränkten Wattestäbchen, um die Larvenoberflächen sanft zu sterilisieren. Die Larven einzeln in zwei Milliliter Lysing-Matrixröhren mit 800 Mikrolitersterilen PBS. Dann verwenden Sie einen Homogenisator, um die Larven für 60 Sekunden bei sechs Metern pro Sekunde zu homogenisieren.Zentrifugieren Sie die Lysing-Rohre bei 3, 500 mal g für fünf Sekunden, um das Homogenat von den Deckeln zu entfernen und das Homogenat sorgfältig einzeln in fünf sterile Luminometer-Röhren zu dekannieren. Reserve 100 Mikroliter Homogenat in einem sterilen 1,5-Milliliter-Reaktionsrohr. Stellen Sie alle verbleibenden Homogenate wieder her, indem Sie die Lysing-Matrixröhren mit einem Milliliter PBS-T und Pipette in die entsprechenden Luminometer-Röhren waschen.Wirbeln Sie die Luminometerröhren und messen Sie die Biolumineszenz der Homogenate auf einem Luminometer. Bereiten Sie dann 10-fache serielle Verdünnungen der reservierten 100 Mikroliter Homogenat in 24-Well-Kulturplatten mit PBS-T vor. 10 Mikroliter der Verdünnung auf jede Middlebrook 7H11 Agarplatte pipette und mit einem sterilen Plattenstreuer aufverbreiten.Zwei Wochen lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Danach zählen Kolonie-bildende Einheiten. Bestimmen Sie das RLU-Zu-KBE-Verhältnis von BCG Lux nach in vivo-Infektion.In diesem Experiment wurde BCG Lux dosisabhängige Virulenz bei G.mellonella Larven über eine 96-stündige Inkubationszeit beobachtet. Die tödliche Dosis, die für die Sterblichkeit von 50% Larven erforderlich ist, wurde als ein mal 10 bis zur Leistung von sieben KBE bestimmt. Kontrollgruppen, die mit einer 10-Mikroliter-Dosis VON PBS-T injiziert wurden, oder solche, die einfach simulierte Nadelverletzungen gestochen haben, hatten keinen Einfluss auf die Gesundheit der Larven oder führten zu einer Erhöhung der Sterblichkeit.Bei Larven, die mit der zweifachen 10-KBE-Dosis von BCG Lux infiziert waren, wurde die Melanisierung der Larven-Rückenlinie ab 48 Stunden nach der Infektion beobachtet und die systemische Melanisierung wurde ab 96 Stunden nach der Infektion beobachtet. Eine Infektion mit einer einmaligen 10 auf die Leistung von sieben KBE-Dosis von BCG Lux führte zu einem anfänglichen Rückgang der Biolumineszenz innerhalb der ersten 72 Stunden nach der Infektion. Jedoch, nach 72 Stunden nach der Infektion, die Biolumineszenz von BCG Lux begann Plateau, was auf die Etablierung einer anhaltenden Infektion.In diesem speziellen Infektionssystem lag das In-vivo-Verhältnis von RLU und CFU zwischen 2:1 und 5:1 mit einem Durchschnitt von 4:1 über den 168-Stunden-Zeitkurs. Denken Sie während der Injektion daran, die Larven zu sichern, so dass das Risiko einer Überdringung minimiert wird. Eine versehentliche Punktion des Darms kann zu einer erhöhten Sterblichkeit führen.Durch histopathologische Analysen kann die Einführung von Mykobakterien mit den Wirtszellen visualisiert werden. Weitere transkriptomische Analysen könnten die Wechselwirkung auf genomischer Ebene aufdecken. Die Verwendung dieses Infektionsmodells kann die schnelle Prüfung neuartiger Arzneimittelkandidaten in einem frühen Entwicklungsstadium ermöglichen, wodurch die Zahl der Tiere, die bei Medikamentenscreenings verwendet werden, deutlich reduziert wird.Dieses Infektionsmodell erfordert die Verwendung einer Spritze, die mit Nadelstichverletzungen in Verbindung gebracht werden kann. Wir empfehlen den Einsatz unserer Injektionstechnik, um ein solches Risiko zu minimieren.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introducing Schubspannung in der Studie der bakteriellen Adhäsion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Wachstum von Mycobacterium tuberculosis Biofilme

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

Das Insekt<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Als leistungsfähiges Infektion Modell zur bakterielle Pathogenität Untersuchen

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Eine experimentelle Modell zum Studium Tuberkulose-Koinfektion auf Natur Malaria Übertragung von Mycobacterium tuberculosis Und Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Die Verwendung von<em&gt; Galleria mellon</em&gt; Als Modellorganismus zum Studium<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infektion

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Der Nachweis eines multiresistenten<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Verstärkung Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Aufbau und Optimierung eines Hochdurchsatz-Setup zum Studium<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Und<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infektion als Modell für Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Ein 3D-humanem Lungengewebe Modell für funktionelle Studien auf<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infektions

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analyse der 18FDG PET/CT Imaging als Werkzeug für Studium Mycobacterium-Tuberkulose -Infektion und Behandlung bei nicht-menschlichen Primaten

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Mycobacterium Tuberculosis in Mäusen mit Reporter Enzym Fluoreszenz Imaging

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...