Name: use of the invertebrate galleria mellonella as an infection model to study the mycobacterium tuberculosis complex
Uploaded: 2019-06-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex at JoVE.com

פרויקט זה היה נתמך על ידי מענקים של ביוטכנולוגיה ומועצת המחקר הביולוגי מחקר (BBSRC), הוענק PRL ו YL (BB/P001262/1), ואת המרכז הלאומי להחלפת, עידון וצמצום של בעלי חיים במחקר (NC3Rs) הוענק PRL, SMN, BDR, ו YL (NC/R001596/1).

הערה: כל העבודות המתוארות להלן מתבצעות במעבדת CL2 בתוך ארון בטיחות מיקרוביולוגי מסוג 2 (MSC) בעקבות הנחיות בריאות ובטיחות מקומיות.
1. הכנת M. סטרפטקוקוס bcg לוקס לזיהום
<ol><li>הפשרה קפוא 1.2 mL גליצרול (15%) מלאי של M. סטרפטקוקוס bcg lux, זן החיסון מונטריאול השתנה עם המעבו?...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Global tuberculosis report 2018. , (2018).</li><li>Colditz, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+BCG+Vaccine+in+the+prevention+of+tuberculosis:+meta-analysis+of+the+published+literature.">Efficacy of BCG Vaccine in the prevention of tuberculosis: meta-analysis of the published literature.</a> Journal of the American Medical Association. 271 (9), 698-702 (1994).</li><li>Meijer, A. H., Spaink, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions+made+transparent+with+the+zebrafish+model.">Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model.</a> Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).</li><li>Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+tuberculosis+in+translational+and+precision+medicine.">Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 717 (2017).</li><li>Gumbo, T., Lenaerts, A. J., Hanna, D., Romero, K., Nuermberger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclinical+models+for+antituberculosis+drug+development:+a+landscape+analysis.">Nonclinical models for antituberculosis drug development: a landscape analysis.</a> Journal of Infectious Diseases. 211 (Suppl 3), S83-S95 (2015).</li><li>Williams, A., Orme, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+tuberculosis:+an+overview.">Animal models of tuberculosis: an overview.</a> Microbiology Spectrum. 4 (4), (2016).</li><li>Myllym&#228;ki, H., Niskanen, M., Oksanen, K. E., R&#228;met, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+in+tuberculosis+research+-+where+is+the+beef?.">Animal models in tuberculosis research - where is the beef?.</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (8), 871-883 (2015).</li><li>Flynn, J. L., Gideon, H. P., Mattila, J. T., Lin, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+studies+in+non-human+primate+models+of+tuberculosis.">Immunology studies in non-human primate models of tuberculosis.</a> Immunological Reviews. 264 (1), 60-73 (2015).</li><li>Cook, S. M., McArthur, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+Galleria+mellonella+as+a+model+host+for+human+pathogens.">Developing Galleria mellonella as a model host for human pathogens.</a> Virulence. 4 (5), 350-353 (2013).</li><li>Tsai, C. J. -. Y., Loh, J. M. S., Proft, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galleria+mellonella+infection+models+for+the+study+of+bacterial+diseases+and+for+antimicrobial+drug+testing.">Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing.</a> Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).</li><li>Wojda, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+of+the+greater+wax+moth+Galleria+mellonella.">Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella.</a> Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).</li><li>Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+structural+and+functional+similarities+of+insect+hemocytes+and+mammalian+phagocytes.">An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes.</a> Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).</li><li>Arteaga Blanco, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+cellular+immune+response+of+Galleria+mellonella+to+Actinobacillus+pleuropneumoniae.">Differential cellular immune response of Galleria mellonella to Actinobacillus pleuropneumoniae.</a> Cell and Tissue Research. 370 (1), 153-168 (2017).</li><li>L&#243;pez Hern&#225;ndez, Y., Yero, D., Pinos-Rodr&#237;guez, J. M., Gibert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animals+devoid+of+pulmonary+system+as+infection+models+in+the+study+of+lung+bacterial+pathogens.">Animals devoid of pulmonary system as infection models in the study of lung bacterial pathogens.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 38 (2015).</li><li>Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Insect+Galleria+mellonella+as+a+powerful+infection+model+to+investigate+bacterial+pathogenesis.">The Insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galleria+mellonella+-+a+novel+infection+model+for+the+Mycobacterium+tuberculosis+complex.">Galleria mellonella - a novel infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex.</a> Virulence. 9 (1), 1126-1137 (2018).</li><li>Meir, M., Grosfeld, T., Barkan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+validation+of+Galleria+mellonella+as+a+novel+model+organism+to+study+Mycobacterium+abscessus+infection,+pathogenesis,+and+treatment.">Establishment and validation of Galleria mellonella as a novel model organism to study Mycobacterium abscessus infection, pathogenesis, and treatment.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (4), (2018).</li><li>Entwistle, F. M., Coote, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+greater+wax+moth+larvae,+Galleria+mellonella,+as+a+novel+in+vivo+model+for+non-tuberculosis+mycobacteria+infections+and+antibiotic+treatments.">Evaluation of greater wax moth larvae, Galleria mellonella, as a novel in vivo model for non-tuberculosis mycobacteria infections and antibiotic treatments.</a> Journal of Medical Microbiology. 67 (4), 585-597 (2018).</li><li>Snewin, V. A., Gares, M., #211;gaora, P., Hasan, Z., Brown, I. N., Young, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+immunity+to+mycobacterial+infection+with+luciferase+reporter+constructs.">Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs.</a> Infection and Immunity. 67 (9), 4586-4593 (1999).</li><li>Newton, S., Martineau, A., Kampmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+whole+blood+assay+to+measure+viability+of+mycobacteria,+using+reporter-gene+tagged+BCG+or+M.Tb+(BCG+lux/M.Tb+lux).">A functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux).</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Jorj&#227;o, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+moths+to+caterpillars:+Ideal+conditions+for+Galleria+mellonella+rearing+for+in+vivo+microbiological+studies.">From moths to caterpillars: Ideal conditions for Galleria mellonella rearing for in vivo microbiological studies.</a> Virulence. 9 (1), 383-389 (2018).</li><li>Kavanagh, K., Sheehan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+Galleria+mellonella+larvae+to+identify+novel+antimicrobial+agents+against+fungal+species+of+medical+interest.">The use of Galleria mellonella larvae to identify novel antimicrobial agents against fungal species of medical interest.</a> Journal of Fungi. 4 (3), 113 (2018).</li><li>Champion, O., Titball, R., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+G.+mellonella+larvae+to+provide+reliable+and+reproducible+results+in+the+study+of+fungal+pathogens.">Standardization of G. mellonella larvae to provide reliable and reproducible results in the study of fungal pathogens.</a> Journal of Fungi. 4 (3), 108 (2018).</li><li>Wojda, I., Taszlow, P., Jakubowicz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cold+shock+on+the+immune+response+of+the+greater+wax+moth+Galleria+mellonella+after+infection+with+entomopathogenic+bacteria+Bacillus+thuringiensis.">The effect of cold shock on the immune response of the greater wax moth Galleria mellonella after infection with entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis.</a> Journal of Maria Curie-Sklodowska University. 69 (2), 7-18 (2015).</li><li>Nascimento, I. P., Leite, L. C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+passaging+in+liquid+media+and+storage+on+Mycobacterium+bovis+-+BCG+growth+capacity+and+infectivity.">The effect of passaging in liquid media and storage on Mycobacterium bovis - BCG growth capacity and infectivity.</a> FEMS Microbiology Letters. 243 (1), 81-86 (2005).</li><li>De Groote, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+studies+evaluating+mouse+models+used+for+efficacy+testing+of+experimental+drugs+against+Mycobacterium+tuberculosis.">Comparative studies evaluating mouse models used for efficacy testing of experimental drugs against Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (3), 1237-1247 (2011).</li><li>Grosset, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+early+bactericidal+activity+in+murine+tuberculosis+provides+insights+into+the+activity+of+isoniazid+and+pyrazinamide.">Modeling early bactericidal activity in murine tuberculosis provides insights into the activity of isoniazid and pyrazinamide.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 109 (37), 15001-15005 (2012).</li><li>Vogel, H., Altincicek, B., Gl&#246;ckner, G., Vilcinskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+transcriptome+and+immune-gene+repertoire+of+the+lepidopteran+model+host+Galleria+mellonella.">A comprehensive transcriptome and immune-gene repertoire of the lepidopteran model host Galleria mellonella.</a> BMC Genomics. 12, 308 (2011).</li></ol>

השימוש ב -G. מלאבלה כמודל זיהום הוקם עבור מספר פתוגנים חיידקיים ופטרייתיים לחקר התקפה אלימה, הפתוגן הפונדקאי אינטראקציה, וכמסך עבור הרומן therapeutics10,22. הדיון הבא מבוסס על הליך ניסיוני לשימוש G. מלאבלה כמודל זיהום עבור mtbc.
בריאותם של...

שחפת (TB) הוא איום גדול על בריאות הציבור העולמי עם 9,000,000 מקרים חדשים בשנה ו 1,500,000 מקרי מוות1. בנוסף, מעריכים כי רבעון אחד של אוכלוסיית העולם נגוע בסוכן סיבתי של המחלה, שחפת של פטרת (Mtb). בין האוכלוסייה הנגועה, 5-10% יפתחו מחלת שחפת פעילה במהלך חייהם. יתר על כן, הופעתה והתפשטות של עמיד בפני סמים עמידים (MDR) ובאופן מקיף-סמים (XDR) עמידים Mtb מהווה איום רציני לבקרת מחלות, עם 123 מדינות לדווח לפחות אחד xdr מקרה1. הטיפול בשחפת דורש קוקטייל של לפחות ארבעה תרופות נגד פטרת, אשר isoniazid ו גריסופלובין מרשם עבור משך המינימום של שישה חודשים; טיפול משויך לעיתים קרובות עם תופעות לוואי מורכבות ורעלים. הגנה מפני החיסון היחיד ברישיון נגד שחפת, משתנה בונגד בוגקטריה באקלוס-Guérin(bcg). הבנה לא מלאה של הפתוגנזה של TB הסלים באופן משמעותי את התפתחותם של אסטרטגיות טיפוליות חדשות וחיסונים.
במשך עשרות שנים מודלים לזיהום בעלי חיים היו חיוניים עבור מחקר TB להבין את בסיסי התגובה ואת תגובת מארח לזיהום, וכלה להעריך הרומן אנטי פטרת סוכנים, אימונוtherapeutics ומועמדים חדשים חיסון3, 4. עם זאת, מחקר באמצעות מודלים לזיהום בעלי חיים של tb הוא קשה לשמצה כמו פתוגנזה והתקדמות של הידבקות בשחפת הם מורכבים, ואין מודל בעלי חיים יחיד מחקה את הספקטרום המלא ותכונות חשובות של המחלה5 ,6. יתרה מזאת, ניסויים בבעלי חיים הם יקרים, זמן רב להתחייב ודורשים צידוק מוסרי מלא. אף על פי כן, מודלים לזיהום בעלי חיים של TB תוארו בפרימטים שאינם אנושיים (למשל, קופי מאני), שרקנים, ארנבים, בקר, חזירים, עכברים ודגי זברדג, עם כל אחד שיש להם את המגבלות שלהם3,4. מודל murine הוא המודל הנפוץ ביותר בשל עלות, זמינות של קווים מסוג, שימוש בזיהום ושפע של ריאגנטים אימונולוגיים. עם זאת, הם לא בדרך כלל טופס גרשמות הקשורים באזורים של היפוקסיה האופייניים לזיהום שחפת סמויה (LTBI)6. שרקנים הם רגישים מאוד לזיהום Mtb , עם היווצרות גרגירומה מוקדם דומה לאלה בבני אדם, והם בשימוש נרחב בבדיקות החיסון; ובכל זאת, העדר ריאגנטים אימונולוגיים מסלים את השימוש בהם כמודל זיהום7. Zebrafish מתאימים ההקרנה בקנה מידה גדול בשלב מוקדם מחקרים טרום קליניים בשל גודלם הקטן, הרבייה מהירה וכלים גנטיים מתקדמים, אבל הם מבחינה אנטומית ושונה פיזיולוגית לבני אדם והם רגישים רק ל הזיהום של פטרת מרינום3. מודלים של בעלי חיים הדומים ביותר לזיהום האנושי Mtb הם בני אדם שאינם יונקים אנושיים (למשל, מקוק), אבל הם יקרים ויש להם שיקולים אתיים ומעשיים משמעותיים אשר מגביל במידה ניכרת את השימוש8.
זחל חרק של עש שעווה גדול או החלת דבש, גלריה מלאבלה, הפכו פופולרי יותר ויותר כמודל זיהום עבור מגוון של פתוגנים חיידקים ופטריות9, וכמסך עבור מועמדים הרומן מיקרוביאלית סמים 10. G. מלונולה היא מודל חסרי חוליות מוצלח בשל המערכת החיסונית מתוחכמת שלה (מורכב הגנות הסלולר וההומוראלית) החולקת רמה גבוהה של דמיון מבניים ופונקציונלי זה של בעלי חוליות11 . זה כולל מנגנונים החיסונית כגון phagocyציטוזה של פתוגנים על ידי הומוציטים (פונקציונלית דומה למקרופאג ונויטרופילים)12,13, הייצור והסירקולציה של אנטי חיידקים פפטידים (אמפר) ו משלים כמו חלבונים בתוך המוליקמ (מקבילה לדם של יונקים) של G. מלבלה11. יתרונות אחרים9,14,15 של G. מלונולה הזחלים כמודל כוללים 1) גודל גדול שלהם (20-30 מ"מ) אשר מאפשר מניפולציה קלה וזיהום, כמו גם אוסף של רקמה המוליקמ לניתוח, 2) תחזוקה קלה ב 37 ° c, תואם לחקר פתוגנים אנושיים, 3) זיהום מדויק על ידי הזרקה ללא צורך הרדמה, 4) היעילות של סוכנים מיקרוביאלית ניתן להעריך ניצול פחות סמים עבור הערכה, 5) חוסר אילוצים מוסריים בהשוואה לשימוש ביונקים, 6) גדלים של קבוצות גדולות ניתן להשתמש בהשוואה למודלים של בעלי חיים המאפשרים שימוש ביותר, ו -7) פעמים קצרות יותר עבור ניסויים בזיהום נדרשים.
במחקר שנערך לאחרונה, הדגמנו כי G. מלונו יכול לשמש כמודל זיהום הרומן לחקר הפתוגנזה של זיהום על ידי biלומינטאז M. סטרפטקוקוס bcg lux, גרסה ששונתה גנטית של זן החיסון וחבר של קומפלקס Mtb (mtbc)16. בעוד G. מלונולה כבר שימש בעבר כמודל זיהום עבור חיידקים שאינם בעלי בקטריות (ntm), בעיקר M. מרנום ו- פטרת abscessus17,18, מחקרים באמצעות mtbc מוגבלים ל זה של לי ואח '16. ביולומילטיות ללא פתוגניים זנים מפטרת, אשר ניתן להשתמש ברמת הבלימה (CL) 2 כפונדקאית עבור Mtb, להציע את היתרונות של בטיחות ומעשיות על פני החיידקים פתוגניים. לאחר הזיהום עם BCG lux, הזחלים מתחילים לפתח מבנים כמו גרגירומה מוקדם, אשר יכול לספק תובנה יקר לתפקיד של חסינות מולדת בהקמת שחפת זיהום16. בנוסף, זה מודל זיהום פשוט חסרי חוליות יש את הפוטנציאל לספק מהירה, בעלות נמוכה, הערכה אמינה של שחפת הפתוגנזה המשלבת אתגר מבוקר ומשכפל מרובים עבור התוכסות. יתר על כן, המודל יש את הפוטנציאל לשמש למסך הרומן anti-TB מועמדים החיסון בפיתוח מוקדם, הפחתת מספר כולל של בעלי חיים בניסויים. היכולת למדוד שינויים במבנה הפונדקאי והפתוגן, הטרנס והפרוטפה כדי לקבוע יעדי סמים ולהעריך מנגנוני פעולה של תרופות מעשיות וחיסונים טיפוליים, גם הם יתרון.
כאן אנו מתארים את הפרוטוקולים הניסיוניים להכנת ביולומינסיום . סטרפטקוקוס bcg lux לוקס ו -g. מרכך זחלים עבור זיהום פטרת, כמו גם את הנחישות של הזחל וגם מפטרת הישרדות בתגובה לזיהום.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5ml reaction tube (Eppendorf)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20, 200 and 1000 &#181;l pipette and filtered tips</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well culture plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 ml pipettes and pipette boy</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 compartment Petri dish (94/15mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>637102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II saftey cabinet</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask with vented cap (250 ml)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS40183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (&#62;99.7%)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>208221.321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galleria mellonella (250 per pk)</td>
			<td>Livefood Direct UK</td>
			<td>W250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogeniser (FastPrep-24 5G )</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116005500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-240CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer (Autolumat LB 953)</td>
			<td>Berthold</td>
			<td>34622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing matrix (S, 2.0ml)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116925500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro syringe (25 &#181;l, 25 ga)</td>
			<td>SGE</td>
			<td>3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H11 agar</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>283810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 broth</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook ADC enrichment</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>212352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook OADC enrichment</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>212240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium bovis BCG lux</td>
			<td>Various</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-decyl aldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7384-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaking incubator</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 80 (Tween-80)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8074-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small box</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>dark vented or non-sealed box recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Short and narrow tipped/Blunt long tweezers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Winterm (V1.08)</td>
			<td>Berthold</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Program LB953.TTB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (94/15mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>633181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper (94mm)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cut to fit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of the invertebrate galleria mellonella as an infection model to study the mycobacterium tuberculosis complex

שחפת היא הגורם הגלובלי המוביל של תמותת מחלות זיהומיות ובערך רבע מאוכלוסיית העולם הוא האמין להידבק בשחפת של פטרת. למרות שנים רבות של מחקר, רבים מן המנגנונים שמאחורי ההצלחה של שחפת משנת השחפת כאורגניזם פתוגניים להישאר נחקר, ופיתוח בטוח יותר, תרופות antimycobacterial יעיל יותר יש צורך דחוף להתמודד עם עלייה ו התפשטות של שחפת עמיד בפני סמים. עם זאת, ההתקדמות של מחקר שחפת היא בקבוק בצווארי מודלים מסורתיים של זיהום היונקים היקרים, זמן רב, ומאתגרת מבחינה אתית. בעבר הקמנו את הזחלים של גלריה החרק מובלה (עש שעווה גדול יותר) כרומן, הדבקה, עלות נמוכה, תפוקה גבוהה, מודל זיהום מקובל מבחינה אתית עבור חברי מתחם שחפת M . כאן אנו מתארים את התחזוקה, ההכנה, והזיהום של G. מלבלה עם biלובאוקטריה בואוויס bcg lux. באמצעות מודל זה זיהום, מינון פטרת תלוי התקפה אלימה ניתן לצפות, ואת הבדיקה המהירה של נטל vivo פטרת באמצעות מדידות biלומינסנציה הוא בקלות השגה הניתן לקריאה. למרות שההגבלות קיימות, כגון חוסר הגנום המלא לניתוח הטרנססקריפט, ניתוח אונטולוגי נגד חרקים דומים מבחינה גנטית ניתן לבצע. כעלות נמוכה, מהירה, ומקובל המודל המקובל עבור שחפת, G. מלאבלה ניתן להשתמש בתור המסך מראש כדי לקבוע את יעילות הסמים ואת הרעילות, וכדי לקבוע את התקפה השוואתית מפטרת לפני השימוש של יונקים קונבנציונליים ודלים. השימוש G.מלאבלה-מודל החיידק יוביל לירידה במספר משמעותי של בעלי חיים המשמשים כיום במחקר שחפת.

כאן אנו מציגים את הנתונים הנציגים שניתן להשיג באמצעות G. מלאבלה — bcg לוקס מודל הזיהום ולהדגיש את היתרונות של G. מלונולה כמודל זיהום עבור חברי הmtbc (איור 1). הליכים ניסיוניים עם נקודות מפתח טכניות מתוארים באיור 2.
<p class="jove_content" f...

Watch this Scientific Journal Video about Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex at JoVE.com

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

השימוש חסרי חוליות גלריה מלאבלה כמודל זיהום לחקור את מתחם שחפת של פטרת

גלריה מלאבלה הוקמה לאחרונה כמודל מבחינה מוסרית, זולה, ומקובלת מבחינה אתית עבור קומפלקס השחפת של החיידק . כאן אנו מתארים ולהדגים את הצעדים שננקטו כדי ליצור זיהום מוצלח של G. מלובלה עם biלומילאוקטריה בואוויס bcg lux.

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בגליה מלונלה כמודל זיהום אלטרנטיבי לחקר שחפת, מה שמקטין את מספר המודלים של יונקים המשמשים במחקר. בהשוואה למודלים קונבנציונליים של יונקים כגון עכברים, Mellonella גלריה הוא מודל זול יותר, מקובל מבחינה אתית, ונגיש יותר ללמוד שחפת. אופטימיזציה נוספת של מודל זה תאפשר סינון של יעילות התרופה האנטימקובקטריאלית המועמדת ורעילות ותתרום לפיתוח טיפולים חדשניים הדרושים בדחיפות לשחפת.גלריה mellonella בעל מערכת חיסונית המולדת מורכבת דומה לזו של יונקים. המחקר של אינטראקציה מארח-פתוגן עשוי לחשוף עוד יותר את התפקיד של חסינות innate בשחפת. השימוש mellonella גלריה כמודל זיהום אינו מוגבל שחפת כבר בשימוש נרחב עבור פתוגנים חיידקיים ופטריות אחרים בעשור האחרון.כדי להתחיל, להפשיר מלאי גליצרול קפוא 1.2 מיליליטר של Mycobacterium bovis BCG לוקס, זן החיסון במונטריאול השתנה עם המעבורת פלסמיד pSMT1 נושאת את הגנים luxAB. בבקבוק ארלנפייר 250 מיליליטר, לחסן 15 מיליליטר של מרק מידלברוק 7H9 עם aliquot מופשר 1.2 מיליליטר של לוקס BCG. מניחים את הבקבוק במיכל ביו-בטיחותי אטום ומאירים ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור שייקר מסלולי ב-220 סל"ד למשך 72 שעות.לאחר הדגירה, הכינו דילול של 1:10 של התרבות בתמיסת מלח עם אגירת פוספט בצינורות לומינומטר, מערבולת, והעמיסו את צינורות הזוהר לתוך מד הזוהר. לטעון את המצע 1%n-decyl אלדהיד באתנול מוחלט לתוך פלטפורמת המזרק ולמדוד את הביולומינציה. המר את הביולומינציה ליחידות יוצרות מושבה כדי לבדוק את הצמיחה של תרבות לוקס BCG.מעבירים את התרבות לצינור צנטריפוגה וצנטריפוגה ב 2, 175 פעמים גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי גלולה את התאים. השלך את העל-טבעי לחיטוי מתאים עם פעילות ידועה של מיקובקטריצ'ידאלית. לשטוף את גלולת התא פעמיים ב 50 מיליליטר של PBS-T על ידי צנטריפוגה ב 2, 175 פעמים גרם במשך 10 דקות כדי למנוע גושים חיידקיים.לאחר הכביסה הסופית, decant הפסולת supernatant ולתלות מחדש את גלולת התא mycobacterial בנפח הנדרש של PBS-T כדי לדלל את ההשעיה mycobacterial לצפיפות התא הרצוי. לאחר מכן, הכינו דילול סדרתי פי 10 של ה-inoculum בצלחות של 24 בארות באמצעות PBS-T. צלחת החוצה 10 microliters של כל דילול על מידלברוק 7H11 צלחות אגר כפול כדי למנות ספירת CFU inoculum.יש לשמור על הזחלים הנרכשים בחושך ב-18 מעלות צלזיוס עם ההגעה ולהשתמש בהם תוך שבוע מיום הרכישה. זהה ובחר זחלים בריאים לניסויים המבוססים על צבע קרם אחיד, גודל ומשקל מתאימים, תנועתיות גבוהה, ובעל יכולת לימין את עצמם כאשר התהפכו. בעזרת פינצטה קהה, סופרים בזהירות את הזחלים הבריאים לתוך צלחת פטרי מרופדת בשכבה של נייר סינון ומאחסנים בטמפרטורת החדר בחושך עד לשימוש.הכן את פלטפורמת ההזרקה על-ידי הקשה על נייר סינון עגול בקוטר 94 מ"מ למשטח שטוח מוגבה. שאפו שלושה כרכים של 70% אתנול למיקרו-זירה של 25 מיקרוליטר כדי לחסן, להשליך ולשטוף עוד יותר בשלושה כרכים של PBS-T סטרילי. לאחר מכן, תוכלו למפות את ה-BCG lux inoculum המוכן ולשאוף 10 מיקרוליטרים למיקרו-מזנון הסטרילי.השתמש במזרק נפרד כדי לשאוף PBS-T עבור פקד שלילי. לאחר 10 זריקות, יש להשתמש מחדש ב- BCG lux inoculum כדי להבטיח השעיית תאים אחידה. השתמש פינצטה להרים זחל אחד ולהמקום על פלטפורמת ההזרקה.על הרציף, להפוך את הזחל על גבו ולשתק על ידי אבטחת הראש והזנב עם פינצטה. אתר את הפרולג השמאלי האחרון, ספירה לאחור מראש הזחל והכנס בזהירות את קצה המחט בעומק של חמישה עד שישה מילימטרים בזווית של 10 עד 20 מעלות למישור האופקי. להזריק את inoculum מהמזרק.לאחר כל זיהום, להעביר את הזחל הנגוע לתוך צלחת פטרי מרופד בשכבה של נייר מסנן. צלחת פטרי אחת של 94 מ"מ יכולה להכיל עד 30 זחלים. אחסן את צלחת פטרי בקופסה חשוכה ומאווררת בתוך אינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.לפקח על הישרדות הזחלים כל 24 שעות. זחלים נחשבים מתים כאשר הם אינם מצליחים לנוע בתגובה למגע. לתעד את ההישרדות ולהעריך את המשמעות הסטטיסטית עם מבחן מנטל-קוקס.כל 24 שעות, בחר באקראי חמישה זחלים נגועים ולהשתמש ספוג ניצן כותנה ספוג 70% אתנול כדי לעקר בעדינות את משטחי הזחל. מניחים את הזחלים בנפרד לתוך צינורות מטריצה lysing שני מיליליטר המכיל 800 microliters של PBS סטרילי. לאחר מכן, השתמש homogenizer כדי הומוגניזציה הזחלים במשך 60 שניות בשישה מטרים לשנייה.צנטריפוגה צינורות lysing ב 3, 500 פעמים גרם במשך חמש שניות כדי להסיר את homogenate מן המכסים בזהירות decant הומוגנית לתוך חמישה צינורות לומינומטר סטרילי בנפרד. שמור 100 מיקרוליטרים של הומוגונט בצינור תגובה סטרילי של 1.5 מיליליטר. לשחזר כל הומוגנית שנותרה על ידי שטיפת צינורות מטריצה lysing עם מיליליטר אחד של PBS-T ו pipette לתוך צינורות זוהר המתאים.מערבולת צינורות הזוהר ולמדוד את הביולומינציה של homogenates על לומינומטר. לאחר מכן, הכינו דילול סדרתי פי 10 של 100 המיקרוליטרים השמורים של הומוגונטים בצלחות תרבות של 24 בארות באמצעות PBS-T. פיפטה 10 מיקרוליטרים של הדילול על כל צלחת אגר מידלברוק 7H11 ולהשתמש מפזר צלחת סטרילית להתפשט.דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שבועיים. לאחר מכן, לספור יחידות להרכיב מושבה. קבע את יחס RLU ל- CFU של לוקס BCG בעקבות זיהום vivo.בניסוי זה, ארסיות תלוית מינון לוקס BCG נצפתה בזחלי G.mellonella על פני תקופת דגירה של 96 שעות. המינון הקטלני הנדרש לתמותה של 50% זחל נקבע להיות אחד פעמים 10 לכוחו של שבעה CFU. קבוצות ביקורת מוזרק עם מנה 10 מיקרוליטר של PBS-T או אלה פשוט נדקר הדמיה פציעות מחט לא השפיעו על בריאות הזחל או להוביל לעלייה בתמותה.עבור זחלים נגועים פעמיים 10 לעוצמה של שבעה מינון CFU של לוקס BCG, מלניזציה של קו הגב הזחל נצפתה מ 48 שעות לאחר זיהום מלניזציה מערכתית נצפתה מ 96 שעות לאחר ההדבקה. זיהום עם פעם אחת 10 לעוצמה של שבעה מינון CFU של לוקס BCG הביא לירידה ראשונית של bioluminescence בתוך 72 השעות הראשונות לאחר ההדבקה. עם זאת, לאחר 72 שעות לאחר ההדבקה, הביולומינציה של לוקס BCG החלה לרמה, מה שמצביע על הקמת זיהום מתמשך.במערכת זיהום מסוימת זו, יחס ה-vivo של RLU ו- CFU נע בין 2:1 ל- 5:1 עם ממוצע של 4:1 במהלך 168 שעות. במהלך ההזרקה, זכרו לאבטח את הזחלים כך שהסיכון של התהזנה יתר ממוזער. ניקוב מקרי של המעיים עלול להוביל לתמותה מוגברת.על ידי ביצוע ניתוח היסטופתולוגי, הקדמה של mycobacteria עם התאים המארחים ניתן לדמיין. ניתוח תעתיק נוסף יכול לחשוף את האינטראקציה ברמה הגנומית. השימוש במודל זיהום זה עשוי לאפשר בדיקה מהירה של מועמדים לתרופות חדשניות בשלב מוקדם בפיתוח, מה שמקטין באופן משמעותי את מספר בעלי החיים המשמשים להקרנת סמים.מודל זיהום זה דורש שימוש במזרק, אשר יכול להיות קשור לפציעה מקל מחט. אנו ממליצים על השימוש בטכניקת ההזרקה שלנו כדי למזער את הסיכון הזה.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

גידול של שחפת Mycobacterium Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

החרקים<em&gt; גלרית mellonella</em&gt; כדגם זיהום רב עצמה כדי לחקור פתוגנזה קטריאלי

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

מודל ניסיוני לחקר המלריה שחפת-coinfection על הילוכים טבעיים של חפת Mycobacterium ו Berghei Plasmodium</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

שימוש<em&gt; Mellonella Galleria</em&gt; כאורגניזם מודל לחקר<em&gt; הלגיונלה pneumophila</em&gt; זיהום

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

הוכחת סמים רבים עמידים<em&gt; חפת Mycobacterium</em&gt; Microarray ההגברה

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

הקמה ואופטימיזציה של הגדרת תפוקה גבוהה ללמוד<em&gt; סטפילוקוקוס epidermidis</em&gt; ו<em&gt; Marinum Mycobacterium</em&gt; זיהום כמודל לגילוי תרופות

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

דגם רקמות 3D ריאות אדם ללימודים פונקציונליים ב<em&gt; חפת Mycobacterium</em&gt; זיהום

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

ניתוח של 18FDG PET/CT הדמיה ככלי לימודי שחפת Mycobacterium זיהום וטיפול פרימטים לא אנושית

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

הדמיה שחפת Mycobacterium בעכברים עם הכתב אנזים קרינה פלואורסצנטית

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...