Name: use of the invertebrate galleria mellonella as an infection model to study the mycobacterium tuberculosis complex
Uploaded: 2019-06-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex at JoVE.com

इस परियोजना को पीआरएल और वाईएल (बीबी/पी001262/1) को प्रदान किए गए जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद (बीबीएसआरसी) से अनुदान द्वारा सहायता प्रदान की गई थी, और पीआरएल को दिए गए अनुसंधान में पशुओं के प्रतिस्थापन, परिशोधन और कमी के लिए राष्ट्रीय केंद्र, SMN, BDR, और YL (NC/

नोट: नीचे वर्णित सभी कार्य स्थानीय स्वास्थ्य और सुरक्षा दिशानिर्देशों का पालन करते हुए एक वर्ग 2 माइक्रोबायोलोलॉजिकल सुरक्षा कैबिनेट (एमएससी) के भीतर एक CL2 प्रयोगशाला में किया जाना है।
1. संक्?...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Global tuberculosis report 2018. , (2018).</li><li>Colditz, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+BCG+Vaccine+in+the+prevention+of+tuberculosis:+meta-analysis+of+the+published+literature.">Efficacy of BCG Vaccine in the prevention of tuberculosis: meta-analysis of the published literature.</a> Journal of the American Medical Association. 271 (9), 698-702 (1994).</li><li>Meijer, A. H., Spaink, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions+made+transparent+with+the+zebrafish+model.">Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model.</a> Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).</li><li>Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+tuberculosis+in+translational+and+precision+medicine.">Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 717 (2017).</li><li>Gumbo, T., Lenaerts, A. 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P., Leite, L. C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+passaging+in+liquid+media+and+storage+on+Mycobacterium+bovis+-+BCG+growth+capacity+and+infectivity.">The effect of passaging in liquid media and storage on Mycobacterium bovis - BCG growth capacity and infectivity.</a> FEMS Microbiology Letters. 243 (1), 81-86 (2005).</li><li>De Groote, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+studies+evaluating+mouse+models+used+for+efficacy+testing+of+experimental+drugs+against+Mycobacterium+tuberculosis.">Comparative studies evaluating mouse models used for efficacy testing of experimental drugs against Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (3), 1237-1247 (2011).</li><li>Grosset, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+early+bactericidal+activity+in+murine+tuberculosis+provides+insights+into+the+activity+of+isoniazid+and+pyrazinamide.">Modeling early bactericidal activity in murine tuberculosis provides insights into the activity of isoniazid and pyrazinamide.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 109 (37), 15001-15005 (2012).</li><li>Vogel, H., Altincicek, B., Gl&#246;ckner, G., Vilcinskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+transcriptome+and+immune-gene+repertoire+of+the+lepidopteran+model+host+Galleria+mellonella.">A comprehensive transcriptome and immune-gene repertoire of the lepidopteran model host Galleria mellonella.</a> BMC Genomics. 12, 308 (2011).</li></ol>

एक संक्रमण मॉडल के रूप में जी मेलोनेला का उपयोग उग्रता, मेजबान-रोगजनक बातचीत के अध्ययन के लिए कई जीवाणु और कवक रोगजनकों के लिए और उपन्यास चिकित्सा के लिए एक स्क्रीन के रूप में स्थापित किया गया है<sup class...

क्षय रोग (टीबी) वैश्विक जन स्वास्थ्य के लिए एक बड़ा खतरा है जिसमें प्रति वर्ष 9 मिलियन नए मामले और 15 मिलियन मौतें1. इसके अतिरिक्त, यह अनुमान लगाया गया है कि विश्व की एक चौथाई जनसंख्या रोग के कारक एजेंट, माइकोबैक्टीरियम तपेदिक (एमटीबी) से संक्रमितहै। संक्रमित आबादी के बीच, 5 डिग्री 10% अपने जीवनकाल में सक्रिय टीबी रोग का विकास होगा। इसके अलावा, बहु-औषध प्रतिरोधी (एमडीआर) और बड़े पैमाने पर दवा (एक्सडीआर) प्रतिरोधी Mtb के उद्भव और प्रसार रोग नियंत्रण के लिए एक गंभीर खतरा बन गया है, 123 देशों के साथ कम से कम एक XDR मामले1रिपोर्टिंग . टीबी के उपचार के लिए कम से कम चार एंटी-माइकोबैक्टीरियल दवाओं के कॉकटेल की आवश्यकता होती है, जिनमें से आइसोनियाज़्ड और रिफाम्पिकिन को कम से कम छह महीने की अवधि के लिए निर्धारित किया जाता है; उपचार अक्सर जटिल दुष्प्रभाव और toxicities के साथ जुड़ा हुआ है. टीबी के खिलाफ केवल लाइसेंस प्राप्त टीके से संरक्षण, माइकोबैक्टीरियम बोविस बैसिलस कलमेट-गुएरिन (बीसीजी), चर2है। टीबी के रोगजनन की एक अधूरी समझ नई चिकित्सीय और टीकाकरण रणनीतियों के विकास में काफी बाधा डालती है।
दशकों के लिए पशु संक्रमण मॉडल टीबी अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण किया गया है बुनियादी रोगजनन और संक्रमण के लिए मेजबान प्रतिक्रिया को समझने के लिए, और उपन्यास विरोधी mycobactrial एजेंटों का मूल्यांकन करने के लिए, प्रतिरक्षा चिकित्सा और नए टीका उम्मीदवारों3, 4. हालांकि, टीबी के पशु संक्रमण मॉडल का उपयोग कर अनुसंधान बेहद मुश्किल है क्योंकि रोगजनन और टीबी संक्रमण की प्रगति जटिल है, और कोई भी पशु मॉडल नहीं है जो पूरे स्पेक्ट्रम और रोग की महत्वपूर्ण विशेषताओं की नकल करता है5 ,6. इसके अलावा, पशु प्रयोगों महंगे हैं, समय लेने के लिए शुरू करने और पूर्ण नैतिक औचित्य की आवश्यकता है. फिर भी, टीबी के पशु संक्रमण मॉडल गैर मानव primates में वर्णित किया गया है (उदा., मैकैक), गिनी सूअर, खरगोश, पशु, सूअर, चूहों और ज़ेब्राफ़िश, प्रत्येक अपनी सीमाओं के साथ3,4. Murine मॉडल लागत, inbred लाइनों की उपलब्धता, संक्रमण की reproducibility और प्रतिरक्षा अभिकर्मकों की बहुतायत के कारण सबसे अधिक इस्तेमाल किया मॉडल है। हालांकि, वे आम तौर पर गुप्त तपेदिक संक्रमण (एलटीबीआई)6की विशेषता है कि hypoxia के क्षेत्रों के साथ जुड़े granuomaas फार्म नहीं है. गिनी सूअरों अत्यधिक Mtb संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, विकृति और जल्दी दानेदार गठन मनुष्यों में उन लोगों के समान के साथ, और व्यापक रूप से टीका परीक्षण में उपयोग किया जाता है; फिर भी इम्यूनोलॉजिकल अभिकर्मकों की कमी संक्रमण मॉडल7के रूप में उनके उपयोग में बाधा डालती है . ज़ेबराफ़िश उनके छोटे आकार, तेजी से प्रजनन और उन्नत आनुवंशिक उपकरणों के कारण प्रारंभिक चरण पूर्व नैदानिक अध्ययन में बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त हैं, लेकिन शारीरिक और शारीरिक रूप से मनुष्यों के लिए अलग हैं और केवल करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं माइकोबैक्टीरियम मारिनम संक्रमण3| पशु मॉडल सबसे बारीकी से मानव Mtb संक्रमण के समान गैर मानव primates हैं (जैसे, मैके), लेकिन वे महंगे हैं और महत्वपूर्ण नैतिक और व्यावहारिक विचार है जो काफी उनके उपयोग को सीमित करता है8.
अधिक मोम कीट या मधुकोश कीट, गैलेरिया मेलोनेला का कीट लार्वा , विभिन्न प्रकार के जीवाणु और कवक रोगजनकोंकेलिए संक्रमण मॉडल के रूप में तेजी से लोकप्रिय हो गया है , और उपन्यास एंटीमाइक्रोबियल दवा उम्मीदवारों के लिए एक स्क्रीन के रूप में 10. जी मेलोनेला अपने परिष्कृत सहज प्रतिरक्षा प्रणाली (सेल्यूलर और हास्य सुरक्षा के साथ) के कारण एक सफल अकशेरुकी मॉडल है जो कशेरुकियों 11 के लिए संरचनात्मक और कार्यात्मक समानता के एक उच्च डिग्री के शेयरों . इसमें हेमोसाइट्स द्वारा रोगजनकों के फैगोसाइटोसिस जैसे प्रतिरक्षा तंत्र शामिल हैं (कार्यात्मक रूप से स्तनधारी मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल के समान)12,13, एंटी-माइक्रोबायल पेप्टाइड्स (एएमपी) का उत्पादन और परिसंचरण और जी मेलोनेला11के हेमोलिम्फ (स्तनीय रक्त के अनुरूप) के भीतर पूरक प्रोटीन की तरह । अन्य लाभ9,14,15 जी मेलोनेला लार्वा के एक मॉडल के रूप में शामिल 1) उनके बड़े आकार (20 डिग्री 30 मिमी) जो आसान हेरफेर और संक्रमण के लिए अनुमति देता है, साथ ही ऊतक के संग्रह और विश्लेषण के लिए हेमोलिम्फ, 2) 37 डिग्री सेल्सियस पर आसान रखरखाव, मानव रोगजनकों का अध्ययन करने के लिए संगत, 3) संज्ञाहरण की आवश्यकता के बिना इंजेक्शन द्वारा सटीक संक्रमण, 4) एंटीमाइक्रोबियल एजेंटों की प्रभावकारिता मूल्यांकन के लिए कम दवा का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है, 5) की कमी स्तनधारियों के उपयोग की तुलना में नैतिक बाधाओं, 6) बड़े समूह के आकार पशु अधिक reproducibility की अनुमति मॉडल की तुलना में इस्तेमाल किया जा सकता है, और 7) संक्रमण प्रयोगों के लिए कम समय की आवश्यकता है.
हाल ही में एक अध्ययन में, हमने दिखा दिया है कि जी melonella bioluminescent एम bovis BCG लक्स,टीका तनाव और सदस्य के एक आनुवंशिक रूप से संशोधित संस्करण द्वारा संक्रमण के रोगजनन का अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास संक्रमण मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है Mtb परिसर (MTBC)16की. जबकि जी मेलोनेला पहले गैर-ट्यूबरकुलस माइकोबैक्टीरिया (एनटीएम) के लिए एक संक्रमण मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है, मुख्य रूप से एम मैरिनम और माइकोबैक्टीरियम फोड़ा17,18, एमटीबीसी का उपयोग कर अध्ययन करने के लिए सीमित कर रहे हैं कि ली एट अल16. Bioluminescent गैर-रोगजनक माइकोबैक्टीरियल उपभेदों, जो रोकथाम के स्तर पर इस्तेमाल किया जा सकता है (सीएल) 2 Mtb के लिए एक किराए के रूप में, रोगजनक माइकोबैक्टीरिया पर सुरक्षा और व्यावहारिकता के फायदे प्रदान करते हैं. बीसीजी लक्सके साथ संक्रमण के बाद, लार्वा जल्दी ग्रैन्युलोमा जैसी संरचनाओं का विकास शुरू करते हैं, जो टीबी संक्रमण16की स्थापना में जन्मजात प्रतिरक्षा की भूमिका के बारे में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। इसके अलावा, इस सरल अकशेरुकी संक्रमण मॉडल में टीबी रोगजनन के एक तेजी से, कम लागत, और विश्वसनीय मूल्यांकन प्रदान करने की क्षमता है जिसमें नियंत्रित चुनौती को शामिल किया गया है और प्रजनन क्षमता के लिए कई प्रतिकृतियां हैं। इसके अलावा, मॉडल के लिए जल्दी विकास में उपन्यास विरोधी टीबी दवा और टीका उम्मीदवारों स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने की क्षमता है, प्रयोग में पशुओं की कुल संख्या को कम करने. मेजबान और रोगजनक संरचना में परिवर्तन को मापने की क्षमता, ट्रांसप्टोम और प्रोटीओम दवा लक्ष्य निर्धारित करने और उपन्यास दवाओं और चिकित्सीय टीकों की कार्रवाई के तंत्र का आकलन करने के लिए, भी फायदेमंद हैं।
यहाँ हम एक bioluminescent एम bovis BCG लक्स inoculum और जी मेलॉनेला लार्वा mycobactrial संक्रमण के लिए तैयार करने के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का वर्णन है, साथ ही दोनों लार्वा और माइकोबैक्टीरियल के निर्धारण संक्रमण के जवाब में अस्तित्व.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5ml reaction tube (Eppendorf)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20, 200 and 1000 &#181;l pipette and filtered tips</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well culture plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 ml pipettes and pipette boy</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 compartment Petri dish (94/15mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>637102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II saftey cabinet</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask with vented cap (250 ml)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS40183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (&#62;99.7%)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>208221.321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galleria mellonella (250 per pk)</td>
			<td>Livefood Direct UK</td>
			<td>W250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogeniser (FastPrep-24 5G )</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116005500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-240CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer (Autolumat LB 953)</td>
			<td>Berthold</td>
			<td>34622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing matrix (S, 2.0ml)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116925500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro syringe (25 &#181;l, 25 ga)</td>
			<td>SGE</td>
			<td>3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H11 agar</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>283810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 broth</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook ADC enrichment</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>212352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook OADC enrichment</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>212240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium bovis BCG lux</td>
			<td>Various</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-decyl aldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7384-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaking incubator</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 80 (Tween-80)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8074-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small box</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>dark vented or non-sealed box recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Short and narrow tipped/Blunt long tweezers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Winterm (V1.08)</td>
			<td>Berthold</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Program LB953.TTB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (94/15mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>633181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper (94mm)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cut to fit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of the invertebrate galleria mellonella as an infection model to study the mycobacterium tuberculosis complex

क्षय रोग संक्रामक रोग मृत्यु का प्रमुख वैश्विक कारण है और दुनिया की लगभग एक चौथाई आबादी माइकोबैक्टीरियम तपेदिकसे संक्रमित माना जाता है. अनुसंधान के दशकों के बावजूद, एक रोगजनक जीव के रूप में एम तपेदिक की सफलता के पीछे कई तंत्र की जांच की जानी शेष है, और वृद्धि से निपटने के लिए सुरक्षित, अधिक प्रभावी एंटीमाइकोबैक्टीरियल दवाओं के विकास की तत्काल आवश्यकता है और दवा प्रतिरोधी तपेदिक का प्रसार। हालांकि, तपेदिक अनुसंधान की प्रगति पारंपरिक स्तनधारी संक्रमण मॉडल है कि महंगे हैं, समय लेने वाली है, और नैतिक रूप से चुनौतीपूर्ण द्वारा bottlenecked है. इससे पहले हमने एम तपेदिक परिसर के सदस्यों के लिए एक उपन्यास, पुन: उत्पादनीय, कम लागत, उच्च-थ्रूपुट और नैतिक रूप से स्वीकार्य संक्रमण संक्रमण मॉडल के रूप में कीट गैलेरिया मेलोनेला (महान मोम कीट) के लार्वा की स्थापना की। यहाँ हम रखरखाव, तैयारी, और bioluminescent माइकोबैक्टीरियम bovis बीसीजी लक्स के साथ जी melonella के संक्रमण का वर्णन. इस संक्रमण मॉडल का उपयोग करना, माइकोबैक्टीरियल खुराक निर्भर उग्रता मनाया जा सकता है, और bioluminscence माप का उपयोग कर vivo माइकोबैक्टीरियल बोझ में की एक तेजी से readout आसानी से प्राप्त करने और reproduible है. हालांकि सीमाएं मौजूद हैं, जैसे ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण के लिए पूरी तरह से एनोटेट जीनोम की कमी, आनुवंशिक रूप से समान कीड़ों के खिलाफ तार्किक विश्लेषण किया जा सकता है। तपेदिक के लिए एक कम लागत, तेजी से, और नैतिक रूप से स्वीकार्य मॉडल के रूप में, जी मेलोनेला दवा प्रभावकारिता और विषाक्तता का निर्धारण करने के लिए एक पूर्व स्क्रीन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, और पारंपरिक स्तनधारी के उपयोग से पहले तुलनात्मक माइकोबैक्टींगिक उग्रता निर्धारित करने के लिए मॉडल. जीमेलोनेला-माइकोबैक्टीरिया मॉडल के उपयोग से तपेदिक अनुसंधान में वर्तमान में उपयोग किए जाने वाले पशुओं की पर्याप्त संख्या में कमी आएगी।

यहाँ हम प्रतिनिधि डेटा है कि जी melonella का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता प्रस्तुत - BCG लक्स संक्रमण मॉडल और MTBC के सदस्यों के लिए एक संक्रमण मॉडल के रूप में जी melonella के लाभों पर प्रकाश डाला (<st...

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Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

माइकोबैक्टीरियम तपेदिक परिसर का अध्ययन करने के लिए एक संक्रमण मॉडल के रूप में इनवर्टेब्रेट गैलेरिया मेलोनेला का उपयोग

गैलेरिया मेलोनेला हाल ही में माइकोबैक्टीरियम तपेदिक परिसर के लिए एक पुनरुत्पाद्य, सस्ते, और नैतिक रूप से स्वीकार्य संक्रमण मॉडल के रूप में स्थापित किया गया था। यहाँ हम वर्णन और bioluminescent माइकोबैक्टीरियम बीवीजी बीसीजी लक्स के साथ जी melonella के सफल संक्रमण स्थापित करने के लिए उठाए गए कदमों का वर्णन और प्रदर्शन.

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...

यह प्रोटोकॉल तपेदिक का अध्ययन करने के लिए एक वैकल्पिक संक्रमण मॉडल के रूप में गैलेरिया मेलोनेला के उपयोग का वर्णन करता है, जिससे अनुसंधान में उपयोग किए जाने वाले स्तनधारी मॉडलों की संख्या कम हो गई है। चूहों जैसे पारंपरिक स्तनधारी मॉडलों की तुलना में, गैलेरिया मेलोनेला तपेदिक का अध्ययन करने के लिए एक सस्ता, नैतिकता की दृष्टि से स्वीकार्य और अधिक सुलभ मॉडल है। इसके अलावा इस मॉडल के अनुकूलन उंमीदवार एंटीमाइकॉबैक्टीरियल दवा प्रभावकारिता और विषाक्तता की स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देगा और तपेदिक के लिए तत्काल आवश्यक उपन्यास चिकित्सा के विकास में योगदान देगा ।गैलेरिया मेलोनेला में स्तनधारियों की तुलना में एक जटिल जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली होती है। मेजबान-रोगजनक बातचीत के अध्ययन से तपेदिक में जन्मजात प्रतिरक्षा की भूमिका का और पता चल सकता है । एक संक्रमण मॉडल के रूप में गैलेरिया मेलोनेला का उपयोग तपेदिक तक ही सीमित नहीं है और पिछले एक दशक में अन्य जीवाणु और फंगल रोगजनकों के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया गया है।शुरू करने के लिए, माइकोबैक्टीरियम बोविस बीसीजी लक्स के एक जमे हुए 1.2-मिलीलीटर ग्लाइस्रोल स्टॉक को डिफ्रॉस्ट करें, मॉन्ट्रियल वैक्सीन तनाव लस्बास जीन ले जाने वाले शटल प्लाज्मिड पीएसएमटी1 के साथ बदल गया। एक लेबल २५०-मिलीलीटर Erlenmeyer flask में, एक defrosted १.२-BCG लक्स के मिलीलीटर aliquot के साथ मिडलब्रुक 7H9 शोरबा के 15 मिलीलीटर टीका । एक सील बायोसेफ्टी कंटेनर में फ्लास्क रखें और 72 घंटे के लिए 220 आरपीएम पर एक कक्षीय शेखर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।इनक्यूबेशन के बाद, ल्यूमिनोमीटर ट्यूब, भंवर में फॉस्फेट-बफर नमकीन में संस्कृति के 1:10 कमजोर पड़ने तैयार करें, और ल्यूमिनोमीटर ट्यूबों को ल्यूमिनोमीटर में लोड करें। सब्सट्रेट 1% एन-डेसिल एल्डिहाइड को पूर्ण इथेनॉल में इंजेक्टर प्लेटफॉर्म में लोड करें और बायोल्यूमिनेसेंस को मापें। बीसीजी लक्स संस्कृति के विकास को रोकने के लिए बायोल्यूमिनेसेंस को कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों में परिवर्तित करें।कोशिकाओं को गोली मारने के लिए कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 2, 175 बार जी पर एक अपकेंद्रित्र ट्यूब और अपकेंद्रित्र पर संस्कृति स्थानांतरित करें। ज्ञात माइकोबैक्टीरिडल गतिविधि के साथ एक उपयुक्त कीटाणुनाशक में सुपरनेट्ट को त्यागें। बैक्टीरियल क्लंपिंग को रोकने के लिए 10 मिनट के लिए 2, 175 बार जी पर अपकेंद्री द्वारा पीबीएस-टी के 50 मिलीलीटर में सेल पेलेट को दो बार धोएं।अंतिम धोने के बाद, अपशिष्ट सुपरनैक्टेंट को कम करें और वांछित सेल घनत्व में माइकोबैक्टीरियल निलंबन को पतला करने के लिए पीबीएस-टी की आवश्यक मात्रा में माइकोबैक्टीरियल सेल पेलेट को फिर से खर्च करें। इसके बाद पीबीएस-टी का इस्तेमाल करते हुए 24-वेल प्लेट्स में इनोकुलम के 10 गुना सीरियल कमजोर करने की तैयारी करें । इनोकुलम सीएलयू की गणना करने के लिए डुप्लिकेट में मिडलब्रुक 7H11 एगर प्लेटों पर प्रत्येक कमजोर पड़ने के 10 माइक्रोलीटर बाहर प्लेट करें।खरीद के एक सप्ताह के भीतर आगमन और उपयोग पर 18 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में खरीदे गए इंस्टार लार्वा को बनाए रखें। एक समान क्रीम रंग, उचित आकार और वजन, उच्च गतिशीलता, और जब खत्म हो जाता है तो खुद को सही करने की क्षमता रखने के आधार पर प्रयोग के लिए स्वस्थ लार्वा की पहचान और चयन करें। कुंद अंत चिमटी का उपयोग करना, ध्यान से एक पेट्री फिल्टर कागज की एक परत के साथ लाइन में खड़ा पकवान में स्वस्थ लार्वा गिनती और उपयोग तक अंधेरे में कमरे के तापमान पर स्टोर ।एक फ्लैट, उठाया सतह के लिए एक ९४ मिलीमीटर व्यास परिपत्र फिल्टर पेपर टेप द्वारा इंजेक्शन मंच तैयार करें । बाँझ पीबीएस-टी के तीन खंडों के साथ स्टरलाइज, डिस्कार्ड और आगे कुल्ला करने के लिए 25 माइक्रोलीटर माइक्रोसिरिंग में 70% इथेनॉल के तीन वॉल्यूम को एस्पिरेट करें। फिर, तैयार बीसीजी लक्स इनोकुलम को फिर से खर्च करें और 10 माइक्रोलीटर को निष्फल माइक्रोसिरिंग में असंयमित करें।नकारात्मक नियंत्रण के लिए पीबीएस-टी को एस्पिरेट करने के लिए एक अलग सिरिंज का उपयोग करें। 10 इंजेक्शन के बाद, एक समान सेल निलंबन सुनिश्चित करने के लिए बीसीजी लक्स इनोकुलम को फिर से खर्च करें। एक लार्वा लेने और इंजेक्शन मंच पर जगह करने के लिए चिमटी का उपयोग करें।मंच पर, लार्वा को अपनी पीठ पर पलटें और चिमटी के साथ सिर और पूंछ को सुरक्षित करके स्थिर करें। लार्वा के सिर से नीचे गिनते हुए अंतिम बाएं प्रोलेग का पता लगाएं और ध्यान से क्षैतिज विमान में 10 से 20 डिग्री कोण पर पांच से छह मिलीमीटर गहरी सुई की नोक डालें। सिरिंज से इनोकुलम इंजेक्ट करें।प्रत्येक संक्रमण के बाद, संक्रमित लार्वा को फिल्टर पेपर की एक परत के साथ लाइन में खड़ा पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। एक एकल 94 मिलीमीटर पेट्री डिश 30 लार्वा तक समायोजित कर सकती है। पेट्री डिश को 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर के अंदर एक वेंटेड, डार्क बॉक्स में स्टोर करें।हर 24 घंटे में लार्वा के अस्तित्व की निगरानी करें। लार्वा को मृत माना जाता है जब वे छूने के जवाब में स्थानांतरित करने में विफल रहते हैं। अस्तित्व को रिकॉर्ड करें और मैनटेल-कॉक्स परीक्षण के साथ सांख्यिकीय महत्व का आकलन करें।हर 24 घंटे में, बेतरतीब ढंग से पांच संक्रमित लार्वा का चयन करें और लार्वा सतहों को धीरे से निष्फल करने के लिए 70% इथेनॉल में भिगोए गए कपास कली झाड़ू का उपयोग करें। लार्वा को व्यक्तिगत रूप से बाँझ पीबीएस के 800 माइक्रोलीटर युक्त दो मिलीलीटर lysing मैट्रिक्स ट्यूबों में रखें। फिर, छह मीटर प्रति सेकंड पर 60 सेकंड के लिए लार्वा को समरूप बनाने के लिए एक समरूप का उपयोग करें।लिड से समरूप को हटाने के लिए पांच सेकंड के लिए 3, 500 बार जी पर लिसिंग ट्यूबों को अपकेंद्रित्र करें और व्यक्तिगत रूप से पांच बाँझ ल्यूमिनोमीटर ट्यूबों में समरूप को सावधानी से डिकंट करें। एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में समरूप के 100 माइक्रोलीटर आरक्षित करें। पीबीएस-टी के एक मिलीलीटर और पिपेट के साथ lysing मैट्रिक्स ट्यूबों को इसी ल्यूमिनोमीटर ट्यूबों में धोने के द्वारा किसी भी शेष समरूप को ठीक करें।भंवर ल्यूमिनोमीटर ट्यूब और एक ल्यूमिनोमीटर पर समरूपता के बायोल्यूमिनेसेंस को मापने। फिर, पीबीएस-टी का उपयोग करके 24-वेल कल्चर प्लेटों में समरूप के आरक्षित 100 माइक्रोलीटर के 10 गुना धारावाहिक कमजोर करने को तैयार करें। प्रत्येक मिडलब्रुक 7H11 आगर प्लेट पर कमजोर पड़ने के पिपेट 10 माइक्रोलीटर और प्रसार करने के लिए एक बाँझ प्लेट स्प्रेडर का उपयोग करें।दो सप्ताह के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट । उसके बाद, कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों की गिनती करें। वीवो संक्रमण में निम्नलिखित बीसीजी लक्स के सीएफयू अनुपात को आरएलयू निर्धारित करें।इस प्रयोग में, बीसीजी लक्स खुराक पर निर्भर उग्रता एक ९६ घंटे की इनक्यूबेशन अवधि में G.mellonella लार्वा में मनाया गया था । ५०% लार्वा मृत्यु दर के लिए आवश्यक घातक खुराक सात सीएलयू की शक्ति के लिए एक गुना 10 होना निर्धारित किया गया था । नियंत्रण समूहों PBS-टी की एक 10 माइक्रोलीटर खुराक के साथ इंजेक्शन या उन बस चुभती नकली सुई चोटों लार्वा स्वास्थ्य को प्रभावित नहीं किया या मृत्यु दर में वृद्धि करने के लिए नेतृत्व ।बीसीजी लक्स की सात सीएफयू खुराक की शक्ति के लिए दो बार 10 से संक्रमित लार्वा के लिए, लार्वा पृष्ठीय रेखा का मेलनीकरण संक्रमण के बाद 48 घंटे से मनाया गया और संक्रमण के बाद 96 घंटे से प्रणालीगत मेलनाइजेशन देखा गया। बीसीजी लक्स की सात सीएफयू खुराक की शक्ति के लिए एक बार 10 के साथ संक्रमण के परिणामस्वरूप संक्रमण के बाद पहले 72 घंटों के भीतर बायोल्यूमिनेसेंस की प्रारंभिक गिरावट हुई। हालांकि, संक्रमण के बाद 72 घंटे के बाद, बीसीजी लक्स की बायोल्यूमिनेसेंस ने पठार करना शुरू कर दिया, जो लगातार संक्रमण की स्थापना का संकेत है।इस विशेष संक्रमण प्रणाली में, आरएलयू और सीएलयू का वीवो अनुपात 168 घंटे के समय पाठ्यक्रम पर 4:1 के औसत के साथ 2:1 से 5:1 तक था। इंजेक्शन के दौरान, लार्वा को सुरक्षित करना याद रखें ताकि अधिक पश्चाताप का जोखिम कम हो। आंत के आकस्मिक पंचर से मृत्यु दर बढ़ सकती है।हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण करके, मेजबान कोशिकाओं के साथ माइकोबैक्टीरिया की शुरूआत की कल्पना की जा सकती है। इसके अलावा प्रतिलिपि विश्लेषण जीनोमिक स्तर पर बातचीत प्रकट कर सकता है । इस संक्रमण मॉडल का उपयोग विकास में प्रारंभिक चरण में उपन्यास दवा उम्मीदवारों के तेजी से परीक्षण के लिए अनुमति दे सकता है, जिससे दवा स्क्रीनिंग में उपयोग किए जाने वाले जानवरों की संख्या में काफी कमी आ सकती है।इस संक्रमण मॉडल के लिए एक सिरिंज के उपयोग की आवश्यकता होती है, जो सुई-छड़ी चोट से जुड़ी हो सकती है। हम इस तरह के जोखिम को कम करने के लिए हमारे इंजेक्शन तकनीक के उपयोग की सलाह देते हैं।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

बैक्टीरियल आसंजन के अध्ययन में कतरें तनाव का परिचय

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

के विकास माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

कीट<em&gt; Galleria मेल्लोनेल्ला</em&gt; एक शक्तिशाली संक्रमण बैक्टीरियल रोगजनन की जांच के लिए मॉडल के रूप में

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

प्राकृतिक ट्रांसमिशन पर क्षय रोग मलेरिया coinfection अध्ययन करने के लिए एक प्रयोगात्मक मॉडल माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग और प्लाज्मोडियम berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

का प्रयोग करें<em&gt; गैलेरिया मेल्लोनेल्ला</em&gt; एक मॉडल जीव के रूप में अध्ययन करने के लिए<em&gt; लीजोनेला pneumophila</em&gt; संक्रमण

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

एक बहु दवा प्रतिरोधी दिखाते<em&gt; माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग</em&gt; प्रवर्धन माइक्रोएरे

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

स्थापना और अध्ययन करने के लिए एक उच्च throughput सेटअप का अनुकूलन<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; और<em&gt; माइकोबैक्टीरियम marinum</em&gt; संक्रमण ड्रग डिस्कवरी के लिए एक मॉडल के रूप में

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

पर कार्यात्मक अध्ययन के लिए एक 3 डी मानव फेफड़े के ऊतकों मॉडल<em&gt; माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग</em&gt; संक्रमण

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

18FDG पीईटी का विश्लेषण/ माइकोबैक्टीरियम तपेदिक संक्रमण और गैर-मानव रहनुमाओं में उपचार के लिए एक उपकरण के रूप में सीटी इमेजिंग

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

इमेजिंग रिपोर्टर एंजाइम प्रतिदीप्ति के साथ चूहों में माइकोबैक्टीरियम तपेदिक

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...