Name: use of the invertebrate galleria mellonella as an infection model to study the mycobacterium tuberculosis complex
Uploaded: 2019-06-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex at JoVE.com

このプロジェクトは、PRLとYL(BB/P001262/1)に授与されたバイオテクノロジー・生物科学研究協議会(BBSRC)の助成金と、PRLに授与された国立研究動物の置き換え、精製、還元のための国立センター(NC3R)の助成金によって支援されました。SMN、BDR、および YL (NC/R001596/1)。

注:以下に説明するすべての作業は、地域の健康と安全に関するガイドラインに従って、クラス2の微生物学的安全キャビネット(MSC)内のCL2実験室で行われる予定です。
1. 感染に対するM.ボビスBCGルクスの調製
<ol><li>冷凍1.2 mLグリセロールを解凍する (15%)M.ボビスBCGルクスのストックは、ルシフェラーゼ酵素19をコードするビブリオハーヴェイ?...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Global tuberculosis report 2018. , (2018).</li><li>Colditz, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+BCG+Vaccine+in+the+prevention+of+tuberculosis:+meta-analysis+of+the+published+literature.">Efficacy of BCG Vaccine in the prevention of tuberculosis: meta-analysis of the published literature.</a> Journal of the American Medical Association. 271 (9), 698-702 (1994).</li><li>Meijer, A. H., Spaink, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions+made+transparent+with+the+zebrafish+model.">Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model.</a> Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).</li><li>Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+tuberculosis+in+translational+and+precision+medicine.">Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 717 (2017).</li><li>Gumbo, T., Lenaerts, A. J., Hanna, D., Romero, K., Nuermberger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclinical+models+for+antituberculosis+drug+development:+a+landscape+analysis.">Nonclinical models for antituberculosis drug development: a landscape analysis.</a> Journal of Infectious Diseases. 211 (Suppl 3), S83-S95 (2015).</li><li>Williams, A., Orme, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+tuberculosis:+an+overview.">Animal models of tuberculosis: an overview.</a> Microbiology Spectrum. 4 (4), (2016).</li><li>Myllym&#228;ki, H., Niskanen, M., Oksanen, K. E., R&#228;met, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+in+tuberculosis+research+-+where+is+the+beef?.">Animal models in tuberculosis research - where is the beef?.</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (8), 871-883 (2015).</li><li>Flynn, J. L., Gideon, H. P., Mattila, J. T., Lin, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+studies+in+non-human+primate+models+of+tuberculosis.">Immunology studies in non-human primate models of tuberculosis.</a> Immunological Reviews. 264 (1), 60-73 (2015).</li><li>Cook, S. M., McArthur, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+Galleria+mellonella+as+a+model+host+for+human+pathogens.">Developing Galleria mellonella as a model host for human pathogens.</a> Virulence. 4 (5), 350-353 (2013).</li><li>Tsai, C. J. -. Y., Loh, J. M. S., Proft, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galleria+mellonella+infection+models+for+the+study+of+bacterial+diseases+and+for+antimicrobial+drug+testing.">Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing.</a> Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).</li><li>Wojda, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+of+the+greater+wax+moth+Galleria+mellonella.">Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella.</a> Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).</li><li>Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+structural+and+functional+similarities+of+insect+hemocytes+and+mammalian+phagocytes.">An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes.</a> Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).</li><li>Arteaga Blanco, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+cellular+immune+response+of+Galleria+mellonella+to+Actinobacillus+pleuropneumoniae.">Differential cellular immune response of Galleria mellonella to Actinobacillus pleuropneumoniae.</a> Cell and Tissue Research. 370 (1), 153-168 (2017).</li><li>L&#243;pez Hern&#225;ndez, Y., Yero, D., Pinos-Rodr&#237;guez, J. M., Gibert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animals+devoid+of+pulmonary+system+as+infection+models+in+the+study+of+lung+bacterial+pathogens.">Animals devoid of pulmonary system as infection models in the study of lung bacterial pathogens.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 38 (2015).</li><li>Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Insect+Galleria+mellonella+as+a+powerful+infection+model+to+investigate+bacterial+pathogenesis.">The Insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galleria+mellonella+-+a+novel+infection+model+for+the+Mycobacterium+tuberculosis+complex.">Galleria mellonella - a novel infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex.</a> Virulence. 9 (1), 1126-1137 (2018).</li><li>Meir, M., Grosfeld, T., Barkan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+validation+of+Galleria+mellonella+as+a+novel+model+organism+to+study+Mycobacterium+abscessus+infection,+pathogenesis,+and+treatment.">Establishment and validation of Galleria mellonella as a novel model organism to study Mycobacterium abscessus infection, pathogenesis, and treatment.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (4), (2018).</li><li>Entwistle, F. M., Coote, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+greater+wax+moth+larvae,+Galleria+mellonella,+as+a+novel+in+vivo+model+for+non-tuberculosis+mycobacteria+infections+and+antibiotic+treatments.">Evaluation of greater wax moth larvae, Galleria mellonella, as a novel in vivo model for non-tuberculosis mycobacteria infections and antibiotic treatments.</a> Journal of Medical Microbiology. 67 (4), 585-597 (2018).</li><li>Snewin, V. A., Gares, M., #211;gaora, P., Hasan, Z., Brown, I. N., Young, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+immunity+to+mycobacterial+infection+with+luciferase+reporter+constructs.">Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs.</a> Infection and Immunity. 67 (9), 4586-4593 (1999).</li><li>Newton, S., Martineau, A., Kampmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+whole+blood+assay+to+measure+viability+of+mycobacteria,+using+reporter-gene+tagged+BCG+or+M.Tb+(BCG+lux/M.Tb+lux).">A functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux).</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Jorj&#227;o, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+moths+to+caterpillars:+Ideal+conditions+for+Galleria+mellonella+rearing+for+in+vivo+microbiological+studies.">From moths to caterpillars: Ideal conditions for Galleria mellonella rearing for in vivo microbiological studies.</a> Virulence. 9 (1), 383-389 (2018).</li><li>Kavanagh, K., Sheehan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+Galleria+mellonella+larvae+to+identify+novel+antimicrobial+agents+against+fungal+species+of+medical+interest.">The use of Galleria mellonella larvae to identify novel antimicrobial agents against fungal species of medical interest.</a> Journal of Fungi. 4 (3), 113 (2018).</li><li>Champion, O., Titball, R., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+G.+mellonella+larvae+to+provide+reliable+and+reproducible+results+in+the+study+of+fungal+pathogens.">Standardization of G. mellonella larvae to provide reliable and reproducible results in the study of fungal pathogens.</a> Journal of Fungi. 4 (3), 108 (2018).</li><li>Wojda, I., Taszlow, P., Jakubowicz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cold+shock+on+the+immune+response+of+the+greater+wax+moth+Galleria+mellonella+after+infection+with+entomopathogenic+bacteria+Bacillus+thuringiensis.">The effect of cold shock on the immune response of the greater wax moth Galleria mellonella after infection with entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis.</a> Journal of Maria Curie-Sklodowska University. 69 (2), 7-18 (2015).</li><li>Nascimento, I. P., Leite, L. C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+passaging+in+liquid+media+and+storage+on+Mycobacterium+bovis+-+BCG+growth+capacity+and+infectivity.">The effect of passaging in liquid media and storage on Mycobacterium bovis - BCG growth capacity and infectivity.</a> FEMS Microbiology Letters. 243 (1), 81-86 (2005).</li><li>De Groote, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+studies+evaluating+mouse+models+used+for+efficacy+testing+of+experimental+drugs+against+Mycobacterium+tuberculosis.">Comparative studies evaluating mouse models used for efficacy testing of experimental drugs against Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (3), 1237-1247 (2011).</li><li>Grosset, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+early+bactericidal+activity+in+murine+tuberculosis+provides+insights+into+the+activity+of+isoniazid+and+pyrazinamide.">Modeling early bactericidal activity in murine tuberculosis provides insights into the activity of isoniazid and pyrazinamide.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 109 (37), 15001-15005 (2012).</li><li>Vogel, H., Altincicek, B., Gl&#246;ckner, G., Vilcinskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+transcriptome+and+immune-gene+repertoire+of+the+lepidopteran+model+host+Galleria+mellonella.">A comprehensive transcriptome and immune-gene repertoire of the lepidopteran model host Galleria mellonella.</a> BMC Genomics. 12, 308 (2011).</li></ol>

感染モデルとしてのG.メロネラの使用は、ウイルス、宿主病原体相互作用の研究のための細菌および真菌病原体の数のために確立され、および新規治療のためのスクリーンとして10,22。以下の議論は、MTBCの感染モデルとしてG.メロネラを使用するための実験的手順に基づいている。
実験前の素朴な幼虫の健?...

結核(結核)は、年間900万人の新しい症例と150万人の死亡者1人と世界の公衆衛生に対する主要な脅威です。さらに、世界人口の4分の1が、結核菌(Mtb)の原因原因剤に感染していると推定されている。感染した集団の中で、5−10%が生涯にわたって活動性結核疾患を発症する。さらに、多剤耐性(MDR)および広範囲薬剤(XDR)耐性Mtbの出現と広がりは、疾病管理に深刻な脅威をもたらし、123カ国が少なくとも1つのXDR症例1を報告している。結核の治療は、少なくとも4つの抗マイコバクテリア薬のカクテルを必要とします, イゾニアジドとリファンピシンは、6ヶ月の最小期間のために処方されています;治療は、多くの場合、複雑な副作用や毒性に関連付けられています。結核に対する唯一のライセンスワクチンからの保護,マイコバクテリウムボビスバチルスカルメット-ゲリン (BCG),可変 2.結核の病因の不完全な理解は、新しい治療およびワクチン接種戦略の開発を著しく妨げる。
何十年もの間、動物感染モデルは、結核研究が感染に対する基本的な病因と宿主応答を理解し、新規の抗マイコバクテリア剤、免疫療法および新しいワクチン候補を評価するために不可欠であった3、 4.しかし、結核感染の病因と進行が複雑であり、疾患の全スペクトルと重要な特徴を模倣する単一の動物モデルがないため、結核の動物感染モデルを用いた研究は難しいことで知られています5 、6.さらに、動物実験は高価であり、引き受けるには時間がかかり、完全な倫理的正当化が必要です。それにもかかわらず、結核の動物感染モデルは、非ヒト霊長類(例えば、マカク)、モルモット、ウサギ、ウタ、ブタ、マウスおよびゼブラフィッシュに記載されており、それぞれにその制限3、4を有する。マウスモデルは、コスト、交配ラインの利用可能性、感染の再現性および免疫学的試薬の豊富さのために最も一般的に使用されるモデルである。しかし、それらは通常、潜在結核感染(LTBI)6の特徴である低酸素症の領域に関連する肉芽腫を形成しない。モルモットはMtb感染の影響を非常に受けやすく、病理や初期肉芽腫の形成はヒトと同様であり、ワクチン検査で広く使用されています。しかし、免疫学的試薬の欠如は、感染モデル7としての使用を妨げる。ゼブラフィッシュは、小型、迅速な繁殖、高度な遺伝的ツールによる初期前臨床試験における大規模なスクリーニングに適していますが、解剖学的および生理学的に人間とは異なり、ヒトの影響を受けやすくなっています。マイコバクテリウム・マリナム感染症3.ヒトMtb感染に最も近い動物モデルは、非ヒト霊長類(例えば、マカク)であるが、それらは高価であり、その使用をかなり制限する重要な倫理的および実用的な考慮事項を有する8。
より大きなワックス蛾またはハニカム蛾の昆虫幼虫、ガレリアメロネラは、細菌および真菌病原体9の様々な感染モデルとしてますます人気が高まっており、新しい抗菌薬候補のスクリーンとして10. G. メロネラは、脊椎動物のそれと高い程度の構造的および機能的類似性を共有する高度な自然免疫系(細胞および体液防御からなる)による成功した無脊椎動物モデルです11.これには、ヘモサイトによる病原体の食細胞症(哺乳類のマクロファージおよび好中球に機能的に類似)12、13、抗微生物ペプチド(AMP)の産生および循環などの免疫機構が含まれる。G.メロネラ11のヘモリンパ内の補体様タンパク質(哺乳類の血液に類似)。モデルとしてのG.メロネラ幼虫の他の利点9、14、15は、簡単な操作と感染を可能にするその大きなサイズ(20−30ミリメートル)だけでなく、組織のコレクションを含みます分析のためのヘモリンパ、2)37°Cでの容易な維持、ヒト病原体の研究に適した、3)麻酔を必要としない注射による精密な感染、4)抗菌剤の有効性は、評価のためのより少ない薬剤を利用して評価することができ、5)の欠如哺乳類の使用に比べて倫理的な制約は、6)大きなグループサイズは、より大きな再現性を可能にする動物モデルと比較して使用することができ、7)感染実験のためのより短い時間が必要とされる。
最近の研究では、G.メロネラは、生物発光M.ボビスBCGルクス、ワクチン株およびメンバーの遺伝子改変バージョンによる感染の病因を研究するための新しい感染モデルとして使用できることを実証しました。Mtb複合体 (MTBC)16の .G.メロネラは、以前は非結核マイコバクテリア(NTM)の感染モデルとして使用されてきましたが、主にM.マリナムおよびマイコバクテリウム膿瘍17、18を用いた研究は、MTBCを用いた研究に限定されています。Li et al.16の.Mtbの代理として封じ込めレベル(CL)2で使用できるバイオルミネッセンス非病原性マイコバクテリア株は、病原性マイコバクテリアに対する安全性と実用性の利点を提供します。BCGルクスに感染した後、幼虫は早期肉芽腫様構造を開発し始め、結核感染16の確立における自然免疫の役割に関する貴重な洞察を提供することができる。さらに、この単純な無脊椎動物感染モデルは、再現性のために制御された課題と複数の反復を組み込んだ結核病因の迅速かつ低コストかつ信頼性の高い評価を提供する可能性を有する。さらに、このモデルは、早期開発における新規な抗結核薬およびワクチン候補のスクリーニングに使用される可能性を有し、実験における動物の総数を減少させる。宿主および病原体構造の変化を測定する能力、転写物およびプロテオームは、薬物標的を決定し、新規薬物および治療ワクチンの作用機序を評価することも有利である。
ここでは、マイコバクテリア感染に対する生物発光M.ボビスBCGルクス接種およびG.メロネラ幼虫の調製のための実験プロトコルと、幼虫とマイコバクテリアの両方の決定について説明します。感染に応じて生存する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5ml reaction tube (Eppendorf)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20, 200 and 1000 &#181;l pipette and filtered tips</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well culture plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 ml pipettes and pipette boy</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 compartment Petri dish (94/15mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>637102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II saftey cabinet</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask with vented cap (250 ml)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS40183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (&#62;99.7%)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>208221.321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galleria mellonella (250 per pk)</td>
			<td>Livefood Direct UK</td>
			<td>W250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogeniser (FastPrep-24 5G )</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116005500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-240CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer (Autolumat LB 953)</td>
			<td>Berthold</td>
			<td>34622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing matrix (S, 2.0ml)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116925500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro syringe (25 &#181;l, 25 ga)</td>
			<td>SGE</td>
			<td>3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H11 agar</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>283810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 broth</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook ADC enrichment</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>212352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook OADC enrichment</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>212240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium bovis BCG lux</td>
			<td>Various</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-decyl aldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7384-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaking incubator</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 80 (Tween-80)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8074-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small box</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>dark vented or non-sealed box recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Short and narrow tipped/Blunt long tweezers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Winterm (V1.08)</td>
			<td>Berthold</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Program LB953.TTB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (94/15mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>633181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper (94mm)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cut to fit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of the invertebrate galleria mellonella as an infection model to study the mycobacterium tuberculosis complex

結核は感染症死亡率の主要な世界的原因であり、世界の人口のおよそ4分の1が結核菌に感染していると考えられています。何十年もの研究にもかかわらず、病原性生物としての結核の成功の背後にあるメカニズムの多くは調査されるべきであり、より安全で効果的な抗マイコバクテリア薬の開発は、その上昇に取り組むために緊急に必要とされ、薬剤耐性結核の広がり。しかし、結核研究の進行は、高価で時間がかかり、倫理的に困難な伝統的な哺乳類感染モデルによってボトルネックとなっています。以前は、M.結核複合体のメンバーのための新規、再現性、低コスト、高スループットおよび倫理的に許容可能な感染モデルとして、昆虫ガレリアメロネラ(より大きなワックス蛾)の幼虫を確立しました。ここでは、生物発光マイコバクテリウム・ボビスBCGルクスを用いたG.メロネラの維持、調製、および感染について説明する。この感染モデルを用いて、マイコバクテリア用量依存性が観察され、生物発光測定を用いた生体内マイコバクテリア負荷の迅速な読み出しが容易に達成でき、再現可能である。トランスクリプトーミクス分析用に完全にアノテ付きゲノムが欠如するなどの限界は存在するが、遺伝的に類似した昆虫に対するオンロジカルな分析を行うことができる。結核の低コスト、迅速かつ倫理的に許容可能なモデルとして、G.メロネラは、薬剤の有効性と毒性を決定し、従来の哺乳動物の使用前に比較マイコバクテリアウイルス性を決定するために、事前スクリーンとして使用することができますモデル。G.メロネラ-マイコバクテリアモデルの使用は、現在結核研究で使用されている動物の実質的な数の減少につながります。

ここでは、G.メロネラ-BCGルクス感染モデルを用いて得られる代表的なデータを提示し、MTBCのメンバーの感染モデルとしてのG.メロネラの利点を強調する(図1)。重要な技術的なポイントを持つ実験手順を図 2に概説します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/...

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Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

結核複合体を研究するための感染モデルとしての無脊椎動物ガレリアメロネラの使用

ガレリアメロネラは最近、結核複合体の再現性、安価、倫理的に許容可能な感染モデルとして設立されました。ここでは、生物発光マイコバクテリウム・ボビスBCGルクスを用いたG.メロネラの正常な感染を確立するためのステップを説明し、実証する。

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...

このプロトコルは、ガレリアメロネラを結核を研究するための代替感染モデルとして使用し、研究に使用される哺乳類モデルの数を減らすことを説明する。マウスなどの従来の哺乳類モデルと比較すると、ガレリアメロネラは結核を研究するための安価で倫理的に受け入れられ、よりアクセスしやすいモデルです。このモデルのさらなる最適化は、候補の抗菌薬の有効性と毒性のスクリーニングを可能にし、結核に対する緊急に必要な新しい治療薬の開発に貢献するであろう。ガレリアメロネラは、哺乳類に匹敵する複雑な自然免疫系を有する。宿主と病原体の相互作用の研究は、結核における自然免疫の役割をさらに明らかにすることができる。感染モデルとしてのガレリアメロネラの使用は結核に限定されず、過去10年間に他の細菌および真菌病原体に広く使用されてきた。まず、マイコバクテリウムボビスBCGルクスの凍結1.2ミリリットルグリセロールストックを解凍し、モントリオールワクチン株はluxAB遺伝子を運ぶシャトルプラスミドpSMT1で形質転換した。標識された250ミリリットルのエルレンマイヤーフラスコでは、BCGルクスの解凍された1.2ミリリットルのアリコートを含むミドルブルック7H9ブロスの15ミリリットルを接種する。密閉されたバイオセーフティ容器にフラスコを入れ、220rpmの軌道シェーカーインキュベーターで摂氏37度で72時間インキュベートします。インキュベーション後、リン酸緩衝生理食塩基の1:10希釈液を、光度計管、渦、照明計管に集め、ルミノメーターにロードします。絶対エタノール中の1%nデシルアルデヒドを注入プラットフォームに積み込み、生物発光を測定します。生物発光をコロニー形成ユニットに変換し、BCGルクス培養の成長を確認します。培養液を遠心管及び遠心分離機に2、175回gを室温で10分間移し、細胞をペレット化する。上清を、既知のマイコバクテリダル活性を有する適切な消毒剤に廃棄する。細胞ペレットをPBS-Tの50ミリリットルで2回、2で遠心分離して10分間175回洗浄し、細菌の凝集を防ぎます。最終洗浄後、無駄な上清をデカントし、必要な量のPBS-Tでマイコバクテリア細胞ペレットを再懸濁し、マイコバクテリア懸濁液を所望の細胞密度に希釈します。次に、PBS-Tを用いて24ウェルプレートに接種物の10倍の連続希釈液を調製する。各希釈液の10マイクロリットルをミドルブルック7H11寒天プレートに重し、接種CFUカウントを列挙します。到着時に摂氏18度で暗闇の中で購入したインスター幼虫を維持し、購入後1週間以内に使用してください。均一なクリーム色、適切なサイズと体重、高い運動性、そしてひっくり返ったときに自分自身を右にする能力を持って、実験のための健康な幼虫を識別し、選択します。鈍端のピンセットを使用して、慎重に濾紙の層が並ぶペトリ皿に健康な幼虫を数え、使用するまで暗闇の中で室温で保存します。直径94ミリの円形フィルターペーパーを平らな隆起面にテーピングして、射出プラットフォームを準備します。70%エタノールの3つのボリュームを25マイクロシリンジに吸い込み、滅菌、廃棄、さらに3巻の滅菌PBS-Tでリンスします。次いで、調製したBCG lux inoculumを再懸濁し、滅菌したマイクロシリンジに10マイクロリットルを吸引する。別のシリンジを使用して、陰性対照のためにPBS-Tを吸引する。10回の注射に続いて、均一な細胞懸濁液を確保するためにBCG lux接種を再中断する。ピンセットを使用して1つの幼虫を拾い、注射プラットフォームに配置します。プラットフォーム上で、幼虫を背中にひっくり返し、ピンセットで頭と尾を固定して固定します。幼虫の頭からカウントダウンし、慎重に水平面に10〜20度の角度で深さ5〜6ミリメートルの針の先端を挿入し、最後の左のプロレッグを見つけます。注射器から接種物を注入する。各感染後、感染した幼虫を濾紙の層が並ぶペトリ皿に移す。1つの94ミリメートルのペトリ皿は30までの幼虫を収容できる。ペトリ皿を5%の二酸化炭素で摂氏37度のインキュベーター内の通気入りの暗い箱に保管します。24時間ごとに幼虫の生存を監視します。幼虫は、彼らがタッチに応答して移動するために失敗したときに死んだと見なされます。生存を記録し、マンテル-コックス検定で統計的有意性を評価する。24時間ごとに、感染した5匹の幼虫を無作為に選択し、70%エタノールに浸した綿棒綿棒を使用して幼虫表面を穏やかに殺菌する。幼虫を800マイクロリットルの無菌PBSを含む2ミリリットルの溶菌マトリックスチューブに個別に入れる。次に、ホモジナイザーを使用して、幼虫を毎秒6メートルで60秒間ホモジナイズします。3、500回gで500回の間に500回の遠心分離チューブは、蓋からホモゲネートを除去し、慎重に5つの無菌ルルミノメーターチューブにホモゲネートを個別にデカントする。滅菌1.5ミリリットル反応管にホモゲネートの100マイクロリットルを予約します。PBS-Tとピペットを1ミリリットルで溶精マトリックスチューブを対応するルミノメーターチューブに洗浄して、残りのホモゲネートを回収します。照明計管を渦、そして、照明計のホモジネートの生物発光を測定する。次いで、PBS-Tを用いて24ウェル培養プレートに100マイクロリットルのホモジネートを予約した10倍の連続希釈液を調製する。各ミドルブルック7H11寒天板に希釈のピペット10マイクロリットル及び広がりに滅菌プレートスプレッダーを使用する。摂氏37度で2週間インキュベートします。その後、コロニー形成ユニットを数えます。インビボ感染後のBCGルクスのRLU対CFU比を決定する。この実験では、96時間のインキュベーション期間にわたってG.メロネラ幼虫でBCG lux用量依存性の毒性が観察された。50%幼虫死亡率に必要な致死量は、7つのCFUの力に対して10倍であると判断した。PBS-Tの10マイクロリットル用量を注射した対照群または単に針の傷害をシミュレートしたものは、幼虫の健康に影響を与えなかったか、死亡率の増加につながった。BCGルクスの7回CFU線量の2回10に感染した幼虫について、感染後48時間から幼虫背部線のメラニンが観察され、感染後96時間から全身メラニンが観察された。BCGルクスの7つのCFU用量の1倍の10の感染は、感染後の最初の72時間以内に生物発光の最初の減少をもたらした。しかし、感染後72時間後、BCGルクスの生物発光が高原に始まり、持続性感染の確立を示す。この特定の感染系では、RLUとCFUのインビボ比は2:1から5:1の範囲で、168時間のタイムコースで平均4:1でした。注射中は、侵入のリスクが最小限になるように幼虫を確保することを忘れないでください。腸の偶発的な穿刺は、死亡率の増加につながる可能性があります。組織病理学的解析を行うことにより、宿主細胞を用いたマイコバクテリアの導入を可視化できる。さらなる転写分析は、ゲノムレベルでの相互作用を明らかにすることができる。この感染モデルの使用は、開発の初期段階で新しい薬物候補の迅速な検査を可能にし、薬物スクリーニングに使用される動物の数を大幅に減らすことができる。この感染モデルは、針刺しの傷害に関連付けることができる注射器の使用を必要とする。このようなリスクを最小限に抑えるために、注射技術の使用をお勧めします。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

細菌付着の研究ではせん断応力を導入する

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The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

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Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

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使用<em&gt;ハチノスツヅリガ</em&gt;モデル生物として研究する<em&gt;レジオネラ·ニューモフィラ</em&gt;感染症

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Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

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Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

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Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

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