Name: use of the invertebrate galleria mellonella as an infection model to study the mycobacterium tuberculosis complex
Uploaded: 2019-06-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex at JoVE.com

이 프로젝트는 생명 공학 및 생물 과학 연구 위원회 (BBSRC)의 보조금에 의해 지원되었다, PRL및 YL에 수여 (BB / P001262/1), 및 연구에 동물의 교체, 정제 및 감소를위한 국립 센터 (NC3Rs) PRL에 수여, SMN, BDR 및 YL(NC/R001596/1).

참고: 아래에 설명된 모든 작업은 지역 보건 및 안전 지침에 따라 클래스 2 미생물 안전 캐비닛(MSC) 내의 CL2 실험실에서 수행되어야 합니다.
1. M. 보비스 BCG 럭스의 제조 감염
<ol><li>냉동 1.2 mL 글리세롤 해동 (15%) M. bovis BCG lux의 재고, 몬트리올 백신 균주는 루시프라아효소19를코딩하는 비브리오 하비이로부터 luxAB 유?...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Global tuberculosis report 2018. , (2018).</li><li>Colditz, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+BCG+Vaccine+in+the+prevention+of+tuberculosis:+meta-analysis+of+the+published+literature.">Efficacy of BCG Vaccine in the prevention of tuberculosis: meta-analysis of the published literature.</a> Journal of the American Medical Association. 271 (9), 698-702 (1994).</li><li>Meijer, A. H., Spaink, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions+made+transparent+with+the+zebrafish+model.">Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model.</a> Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).</li><li>Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+tuberculosis+in+translational+and+precision+medicine.">Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 717 (2017).</li><li>Gumbo, T., Lenaerts, A. J., Hanna, D., Romero, K., Nuermberger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclinical+models+for+antituberculosis+drug+development:+a+landscape+analysis.">Nonclinical models for antituberculosis drug development: a landscape analysis.</a> Journal of Infectious Diseases. 211 (Suppl 3), S83-S95 (2015).</li><li>Williams, A., Orme, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+tuberculosis:+an+overview.">Animal models of tuberculosis: an overview.</a> Microbiology Spectrum. 4 (4), (2016).</li><li>Myllym&#228;ki, H., Niskanen, M., Oksanen, K. E., R&#228;met, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+in+tuberculosis+research+-+where+is+the+beef?.">Animal models in tuberculosis research - where is the beef?.</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (8), 871-883 (2015).</li><li>Flynn, J. L., Gideon, H. P., Mattila, J. T., Lin, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+studies+in+non-human+primate+models+of+tuberculosis.">Immunology studies in non-human primate models of tuberculosis.</a> Immunological Reviews. 264 (1), 60-73 (2015).</li><li>Cook, S. M., McArthur, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+Galleria+mellonella+as+a+model+host+for+human+pathogens.">Developing Galleria mellonella as a model host for human pathogens.</a> Virulence. 4 (5), 350-353 (2013).</li><li>Tsai, C. J. -. Y., Loh, J. M. S., Proft, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galleria+mellonella+infection+models+for+the+study+of+bacterial+diseases+and+for+antimicrobial+drug+testing.">Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing.</a> Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).</li><li>Wojda, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+of+the+greater+wax+moth+Galleria+mellonella.">Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella.</a> Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).</li><li>Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+structural+and+functional+similarities+of+insect+hemocytes+and+mammalian+phagocytes.">An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes.</a> Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).</li><li>Arteaga Blanco, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+cellular+immune+response+of+Galleria+mellonella+to+Actinobacillus+pleuropneumoniae.">Differential cellular immune response of Galleria mellonella to Actinobacillus pleuropneumoniae.</a> Cell and Tissue Research. 370 (1), 153-168 (2017).</li><li>L&#243;pez Hern&#225;ndez, Y., Yero, D., Pinos-Rodr&#237;guez, J. M., Gibert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animals+devoid+of+pulmonary+system+as+infection+models+in+the+study+of+lung+bacterial+pathogens.">Animals devoid of pulmonary system as infection models in the study of lung bacterial pathogens.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 38 (2015).</li><li>Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Insect+Galleria+mellonella+as+a+powerful+infection+model+to+investigate+bacterial+pathogenesis.">The Insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galleria+mellonella+-+a+novel+infection+model+for+the+Mycobacterium+tuberculosis+complex.">Galleria mellonella - a novel infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex.</a> Virulence. 9 (1), 1126-1137 (2018).</li><li>Meir, M., Grosfeld, T., Barkan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+validation+of+Galleria+mellonella+as+a+novel+model+organism+to+study+Mycobacterium+abscessus+infection,+pathogenesis,+and+treatment.">Establishment and validation of Galleria mellonella as a novel model organism to study Mycobacterium abscessus infection, pathogenesis, and treatment.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (4), (2018).</li><li>Entwistle, F. M., Coote, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+greater+wax+moth+larvae,+Galleria+mellonella,+as+a+novel+in+vivo+model+for+non-tuberculosis+mycobacteria+infections+and+antibiotic+treatments.">Evaluation of greater wax moth larvae, Galleria mellonella, as a novel in vivo model for non-tuberculosis mycobacteria infections and antibiotic treatments.</a> Journal of Medical Microbiology. 67 (4), 585-597 (2018).</li><li>Snewin, V. A., Gares, M., #211;gaora, P., Hasan, Z., Brown, I. N., Young, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+immunity+to+mycobacterial+infection+with+luciferase+reporter+constructs.">Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs.</a> Infection and Immunity. 67 (9), 4586-4593 (1999).</li><li>Newton, S., Martineau, A., Kampmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+whole+blood+assay+to+measure+viability+of+mycobacteria,+using+reporter-gene+tagged+BCG+or+M.Tb+(BCG+lux/M.Tb+lux).">A functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux).</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Jorj&#227;o, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+moths+to+caterpillars:+Ideal+conditions+for+Galleria+mellonella+rearing+for+in+vivo+microbiological+studies.">From moths to caterpillars: Ideal conditions for Galleria mellonella rearing for in vivo microbiological studies.</a> Virulence. 9 (1), 383-389 (2018).</li><li>Kavanagh, K., Sheehan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+Galleria+mellonella+larvae+to+identify+novel+antimicrobial+agents+against+fungal+species+of+medical+interest.">The use of Galleria mellonella larvae to identify novel antimicrobial agents against fungal species of medical interest.</a> Journal of Fungi. 4 (3), 113 (2018).</li><li>Champion, O., Titball, R., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+G.+mellonella+larvae+to+provide+reliable+and+reproducible+results+in+the+study+of+fungal+pathogens.">Standardization of G. mellonella larvae to provide reliable and reproducible results in the study of fungal pathogens.</a> Journal of Fungi. 4 (3), 108 (2018).</li><li>Wojda, I., Taszlow, P., Jakubowicz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cold+shock+on+the+immune+response+of+the+greater+wax+moth+Galleria+mellonella+after+infection+with+entomopathogenic+bacteria+Bacillus+thuringiensis.">The effect of cold shock on the immune response of the greater wax moth Galleria mellonella after infection with entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis.</a> Journal of Maria Curie-Sklodowska University. 69 (2), 7-18 (2015).</li><li>Nascimento, I. P., Leite, L. C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+passaging+in+liquid+media+and+storage+on+Mycobacterium+bovis+-+BCG+growth+capacity+and+infectivity.">The effect of passaging in liquid media and storage on Mycobacterium bovis - BCG growth capacity and infectivity.</a> FEMS Microbiology Letters. 243 (1), 81-86 (2005).</li><li>De Groote, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+studies+evaluating+mouse+models+used+for+efficacy+testing+of+experimental+drugs+against+Mycobacterium+tuberculosis.">Comparative studies evaluating mouse models used for efficacy testing of experimental drugs against Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (3), 1237-1247 (2011).</li><li>Grosset, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+early+bactericidal+activity+in+murine+tuberculosis+provides+insights+into+the+activity+of+isoniazid+and+pyrazinamide.">Modeling early bactericidal activity in murine tuberculosis provides insights into the activity of isoniazid and pyrazinamide.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 109 (37), 15001-15005 (2012).</li><li>Vogel, H., Altincicek, B., Gl&#246;ckner, G., Vilcinskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+transcriptome+and+immune-gene+repertoire+of+the+lepidopteran+model+host+Galleria+mellonella.">A comprehensive transcriptome and immune-gene repertoire of the lepidopteran model host Galleria mellonella.</a> BMC Genomics. 12, 308 (2011).</li></ol>

감염 모델로 G. mellonella의 사용은 독성의 연구를위한 세균및 곰팡이 병원체의 수에 대해 설립되었다, 숙주 병원체 상호 작용, 및 새로운 치료법에 대한 화면으로10,22. 다음 논의는 MTBC에 대한 감염 모델로 G. 멜로넬라의 사용에 대한 실험 절차에 기초한다.
실험 전에 순진한 애벌레의 건강은 실험의 결과에 상당한 ...

결핵 (TB)는 연간 9백만 건의 새로운 사례와 150만 명의 사망자1을가진 글로벌 공중 위생에 중요한 위협입니다. 또한, 세계 인구의 1/4이 질병의 원인인 결핵(Mtb)에 감염된 것으로 추정된다. 감염된 인구 중 5-10%는 일생 동안 활성 결핵 질환을 앓게 됩니다. 더욱이, 다중 약 저항하는 (MDR) 및 광용약 (XDR) 저항하는 Mtb의 출현 그리고 퍼짐은 질병 통제에심각한 위협을 제기합니다, 와 123 국가는 적어도 1개의 XDR 케이스 1를 보고했습니다. 결핵의 치료는 적어도 4 개의 항 균제 의 칵테일을 필요로하며, 그 중 는 리팜피신이 최소 6 개월 동안 처방됩니다. 치료는 종종 복잡 한 부작용 및 독성과 관련 된. 결핵에 대하여 유일한 허가된 백신에서 보호, 진균 bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), 가변 2입니다. 결핵의 병인에 대한 불완전한 이해는 새로운 치료 및 예방 접종 전략의 개발을 크게 방해합니다.
수십 년 동안 동물 감염 모델은 결핵 연구가 감염에 대한 기본 병인 및 숙주 반응을 이해하고 새로운 항균제, 면역 치료제 및 새로운 백신 후보물질을 평가하는 데 필수적이었습니다3, 4. 그러나 결핵의 동물 감염 모델을 사용한 연구는 결핵 감염의 발병 기전과 진행이 복잡하기 때문에 악명이 높고 질병의 전체 스펙트럼과 중요한 특징을 모방하는 단일 동물 모델이 없습니다5 ,6. 또한, 동물 실험은 비용이 많이 들고, 수행해야 하는 시간이 많이 걸리며 완전한 윤리적 정당성이 필요합니다. 그럼에도 불구하고, 결핵의 동물 감염 모델은 비인간 영장류(예를 들어, 원숭이), 기니피그, 토끼, 소, 돼지, 마우스 및 제브라피시각각그들의 한계를 갖는3,4. murine 모형은 비용, 근친 선의 가용성, 감염의 재현성 및 면역학 시약의 풍부 때문에 가장 일반적으로 이용되는 모형입니다. 그러나, 그(것)들은 전형적으로 잠복 결핵 감염 (LTBI)6의특징인 저산소증의 지역과 관련되었던 육아종을 형성하지 않습니다. 기니 피그는 Mtb 감염에 매우 취약, 병리와 인간에서 그와 유사한 초기 육아종 형성, 백신 테스트에 널리 사용 된다; 그러나 면역 학적 시약의 부족은 감염 모델7로사용을 방해합니다. Zebrafish는 작은 크기, 빠른 번식 및 고급 유전 도구로 인해 초기 단계 의 전임상 연구에서 대규모 스크리닝에 적합하지만 해부학적 및 생리학적으로 인간과 다르며 인간에게만 취약합니다. 마이코박테리움 마리눔 감염3. 인간 Mtb 감염과 가장 밀접하게 유사한 동물 모델은 비인간 영장류(예를 들어, 원숭이)이지만, 그들은 비싸고 그들의 사용을 상당히 제한하는 상당한 윤리적 및 실용적인 고려사항을 가지고있다8.
큰 왁스 나방이나 벌집 나방의 곤충 유충,갤러리아 멜로넬라, 다양한 세균 및 곰팡이 병원균에 대한 감염모델로 서 점점 더 인기를 끌고 있다 9, 그리고 새로운 항균 약물 후보에 대한 화면으로 10. G. mellonella는 척추 동물11과 높은 수준의 구조적 및 기능적 유사성을 공유하는 정교한 선천적 면역 체계 (세포 및 체액 방어로 구성)로 인해 성공적인 무척추 동물 모델입니다. . 이는 혈세포(포유류 대식세포 및 호중구와 기능적으로 유사함)에 의한 병원균의 식균과 같은 면역 기전을 포함하며,12,13,항균 펩티드(AMPs)의 생산 및 순환 및 G. 멜로넬라11의혈림프 (포유류 혈액과 유사) 내의 보체와 유사한 단백질. 다른장점 9,14,15 모델로 G. mellonella 애벌레포함 1) 그들의 큰 크기 (20−30 mm) 쉬운 조작 및 감염에 대 한 허용, 조직의 컬렉션 뿐만 아니라 분석을 위한 헤모림프, 2) 37°C에서의 간편한 유지보수, 인간 병원체 연구를 위한 용이함, 3) 마취없이 주사에 의한 정밀감염, 4) 항균제의 효능평가, 5) 부족 포유류의 사용에 비해 윤리적 제약, 6) 큰 그룹 크기는 더 큰 재현성을 허용하는 동물 모델에 비해 사용될 수 있으며, 7) 감염 실험에 대한 짧은 시간이 필요합니다.
최근 연구에서, 우리는 G. mellonella가 생물 발광 M. bovis BCG lux에 의한 감염의 병인을 연구하기위한 새로운 감염 모델로 사용될 수 있음을 입증, 백신 균주 및 회원의 유전자 변형 버전 Mtb 단지 (MTBC)16. G. mellonella는 이전에 비 결핵 진균 (NTM)에 대한 감염 모델로 사용되었지만, 주로 M. 마리눔 및 진균 농양17,18,MTBC를 이용한 연구는 리 외16. Mtb의 대리로 봉쇄 수준 (CL) 2에서 사용할 수있는 생물 발광 비 병원성 진균 균주는 병원성 진균에 비해 안전성과 실용성의 장점을 제공합니다. BCG 럭스에감염 에 이어, 애벌레는 결핵 감염의 설립에 선천적 면역의 역할에 귀중한 통찰력을 제공 할 수있는 초기 육아종과 같은 구조를 개발하기 시작16. 또한, 이러한 간단한 무척추동물 감염 모델은 재현성을 위해 조절된 도전과 다중 복제를 통합한 결핵 발병기전에 대한 신속하고 저렴한 비용의 신뢰할 수 있는 평가를 제공할 수 있는 잠재력을 가지고 있다. 더욱이, 이 모델은 초기 개발에서 신규한 항결핵 약물 및 백신 후보를 스크리핑하는데 사용될 가능성이 있으며, 실험에서 동물의 전체 수를 감소시킵니다. 숙주 및 병원체 구조의 변화를 측정하는 능력, 전사체 및 프로테오메는 약물 표적을 결정하고 새로운 약물 및 치료 백신의 작용 메커니즘을 평가하는 능력도 유리하다.
여기에서 우리는 생물 발광 M. bovis BCG 럭스 접종및 진균 감염을 위한 G. mellonella 애벌레의 제조를 위한 실험 적인 프로토콜을 기술합니다, 뿐만 아니라 애벌레와 진균균 둘 다의 결정 감염에 응하여 생존.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5ml reaction tube (Eppendorf)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20, 200 and 1000 &#181;l pipette and filtered tips</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well culture plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 ml pipettes and pipette boy</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 compartment Petri dish (94/15mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>637102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II saftey cabinet</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask with vented cap (250 ml)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS40183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (&#62;99.7%)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>208221.321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galleria mellonella (250 per pk)</td>
			<td>Livefood Direct UK</td>
			<td>W250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogeniser (FastPrep-24 5G )</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116005500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-240CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer (Autolumat LB 953)</td>
			<td>Berthold</td>
			<td>34622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing matrix (S, 2.0ml)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116925500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro syringe (25 &#181;l, 25 ga)</td>
			<td>SGE</td>
			<td>3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H11 agar</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>283810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 broth</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook ADC enrichment</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>212352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook OADC enrichment</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>212240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium bovis BCG lux</td>
			<td>Various</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-decyl aldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7384-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaking incubator</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 80 (Tween-80)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8074-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small box</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>dark vented or non-sealed box recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Short and narrow tipped/Blunt long tweezers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Winterm (V1.08)</td>
			<td>Berthold</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Program LB953.TTB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (94/15mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>633181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper (94mm)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cut to fit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of the invertebrate galleria mellonella as an infection model to study the mycobacterium tuberculosis complex

결핵은 전염병 사망률의 주요 한 글로벌 원인이고 세계 인구의 대략 사분의 일은 결핵균에 감염되는 것으로 여겨진다. 수십 년간의 연구에도 불구하고 병원성 유기체로서 M. 결핵의 성공 뒤에 있는 많은 메커니즘이 조사되어야 하며, 보다 안전하고 효과적인 항균 제의 개발이 시급히 증가하고 약물 내성 결핵의 확산. 그러나, 결핵 연구의 진행은 비싸고, 시간이 걸리고, 윤리적으로 도전적인 전통적인 포유류 감염 모형에 의해 병목 현상됩니다. 이전에 우리는 M. 결핵 복합체의 구성원을 위한 소설, 재현가능, 저비용, 높은 처리량 및 윤리적으로 허용되는 감염 모형으로 곤충 갤러리아 mellonella (큰 왁스 나방)의 애벌레를 설치했습니다. 여기에서 우리는 생물 발광 성 진균 bovis BCG 럭스와 G. 멜로넬라의 유지 보수, 준비 및 감염을 설명합니다. 이 감염 모델을 사용하여, 진균 투여 량 의존적 독성을 관찰 할 수 있으며, 생물 발광 측정을 사용하여 생체 내 진균 부담의 신속한 판독은 쉽게 달성하고 재현 할 수 있습니다. 전사분석을 위한 완전 하게 비고를 받은 게놈의 부족과 같은 한계가 존재하지만, 유전적으로 유사한 곤충에 대한 존재론적 분석이 수행될 수 있다. 결핵에 대한 저비용, 신속하고 윤리적으로 수용 가능한 모델로서, G. mellonella는 약물 효능 및 독성을 결정하고, 기존의 포유류를 사용하기 전에 비교 균균 독성을 결정하기 위한 사전 스크린으로 사용될 수 있습니다. 모델. G.mellonella-mycobacteria 모델의 사용은 현재 결핵 연구에 사용되는 동물의 상당수의 감소로 이어질 것입니다.

여기에서 우리는 G. mellonella를 사용하여 얻을 수 있는 대표적인 데이터를 제시합니다 - BCG 럭스 감염 모형 및 MTBC의 일원을 위한 감염 모형으로 G. mellonella의 이득을 강조합니다 (그림 1). 주요 기술 사항이 있는 실험 절차는 그림2에 설명되어 있습니다.
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Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

결핵 균복합체를 연구하기 위한 감염 모델로 무척추동물 갤러리아 멜로넬라 사용

갤러리아 멜로넬라는 최근 결핵 균복합체에 대한 재현가능하고 저렴하며 윤리적으로 허용되는 감염 모델로 설립되었습니다. 여기에서 우리는 생물 발광 균 bovis BCG 럭스와 G. 멜로넬라의 성공적인 감염을 확립하기 위해 취한 단계를 설명하고 보여줍니다.

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...

이 프로토콜은 결핵을 연구하기 위하여 대체 감염 모형으로 Galleria mellonella의 사용을 기술합니다, 연구에 사용된 포유류 모형의 수를 감소시킵니다. 쥐와 같은 기존의 포유류 모델과 비교할 때, 갤러리아 멜로넬라는 결핵을 연구하기 위해 저렴하고 윤리적으로 허용되며 접근 하기 쉬운 모델입니다. 이 모델의 추가 최적화는 후보 항균균 약물 효능 및 독성의 검사를 허용하고 결핵에 대한 긴급하게 필요한 새로운 치료법의 개발에 기여할 것이다.갤러리아 멜로넬라는 포유류에 필적하는 복잡한 타고난 면역 체계를 가지고 있습니다. 숙주 병원체 상호 작용의 연구 결과는 결핵에 있는 타고난 면역의 역할을 더 드러낼 수 있습니다. 감염 모형으로 갤러리아 mellonella의 사용은 결핵에 국한되지 않으며 지난 10 년간 그밖 세균성 및 곰팡이 병원체를 위해 널리 이용되었습니다.우선, 얼어 붙은 1.2 밀리리터 글리세롤 주식인 마이코박테리움 보비스 BCG 럭스, 몬트리올 백신 균주는 luxAB 유전자를 운반하는 셔틀 플라스미드 pSMT1로 변형되었다. 250 밀리리터 에를렌마이어 플라스크로 표시되어 BCG 럭스의 해동 된 1.2 밀리리터 알리쿼트미들브룩 7H9 국물의 15 밀리리터를 접종했습니다. 플라스크를 밀봉된 생물 안전 용기에 넣고 72시간 동안 220rpm의 궤도 셰이커 인큐베이터에 섭씨 37도에 배양합니다.인큐베이션 후, 광미미터 튜브, 소용돌이에서 인산염 완충식식염으로 배양의 1:10 희석을 준비하고 발광계에 발광계관을 적재한다. 기판 1%n-데실 알데히드를 절대 에탄올에 주입기 플랫폼에 적재하고 생체 발광을 측정합니다. 생물 발광을 식민지 형성 단위로 변환하여 BCG 럭스 문화의 성장을 확인하십시오.배양기를 원심분리기 튜브및 원심분리기로 2, 175배 g에서 실온에서 10분간 전달하여 세포를 펠릿합니다. 알려진 진균작용 활성을 가진 적당한 소독제로 상체를 버리십시오. 세균 응집을 방지하기 위해 10 분 동안 2, 175 배 g에서 원심분리하여 PBS-T의 50 밀리리터에서 세포 펠릿을 두 번 세척하십시오.최종 세척후, 폐수제를 염수하고 PBS-T의 필요한 부피에서 균균 세포 펠릿을 재연하여 균질 현탁액을 원하는 세포 밀도로 희석시 한다. 그런 다음 PBS-T를 사용하여 24웰 플레이트에서 접종의 10배 연속 희석을 준비합니다. 접종 CFU 수를 열거하기 위해 미들브룩 7H11 천판에 각 희석제 10마이크로리터를 복제하여 복제합니다.구입 한 인스타 애벌레는 도착 시 섭씨 18도에서 어둠 속에서 유지하고 구매 후 1 주일 이내에 사용하십시오. 균일한 크림 색, 적절한 크기와 무게, 높은 운동성, 그리고 뒤집을 때 올바른 능력을 가진 실험을 위해 건강한 애벌레를 식별하고 선택합니다. 무딘 끝 핀셋을 사용하여 건강한 유충을 필터 종이 층이 늘어선 페트리 접시에 조심스럽게 세고 사용전까지 어둠 속에서 실온에 보관하십시오.94mm 직경의 원형 필터 용지를 평평한 올려진 표면에 테이핑하여 사출 플랫폼을 준비합니다. 멸균 PBS-T의 세 부피로 살균, 폐기 및 더 헹구기 위해 25 마이크로 리터 마이크로 리터 마이크로 시링에 70 % 에탄올의 세 볼륨을 흡인. 그런 다음, 준비된 BCG 럭스 접종을 중단하고 10 마이크로리터를 살균 된 마이크로시링으로 재보종으로 재차 리위퍼드합니다.별도의 주사기를 사용하여 PBS-T를 흡인하여 음수 제어를 합니다. 다음 10 주사, 균일 한 세포 현탁액을 보장하기 위해 BCG 럭스 접종을 중단. 핀셋을 사용하여 애벌레 한 마리를 집어 주입 플랫폼에 배치하십시오.플랫폼에서, 그 뒷면에 애벌레를 뒤집어 핀셋으로 머리와 꼬리를 고정하여 고정. 마지막 왼쪽 프래그릿을 찾아 애벌레의 머리에서 카운트다운하고 조심스럽게 10~ 20도 각도에서 바늘의 끝을 5~6밀리미터 깊이로 수평 평면에 삽입한다. 주사기에서 접종을 주입합니다.각 감염 후 감염된 애벌레를 필터 용지 층이 늘어선 페트리 접시에 옮기습니다. 94mm 페트리 요리 한 개를 사용하면 최대 30개의 애벌레를 수용할 수 있습니다. 페트리 접시를 37°C의 인큐베이터 안에 5%의 이산화탄소를 넣은 통풍이 진 한 어두운 상자에 보관하십시오.24시간마다 애벌레의 생존을 모니터링합니다. 애벌레는 터치에 대한 응답으로 움직이지 않을 때 죽은 것으로 간주됩니다. 생존을 기록하고 Mantel-Cox 시험으로 통계적 유의성을 평가합니다.매 24시간마다 감염된 유충 5마리를 무작위로 선택하고 70%에탄올에 담근 면봉을 사용하여 애벌레 표면을 부드럽게 살균합니다. 애벌레를 멸균 PBS 800 마이크로리터를 함유한 2밀리리터 용액 매트릭스 튜브에 개별적으로 넣습니다. 그런 다음 균질화제를 사용하여 초당 6미터에서 60초 동안 유충을 균질화합니다.3, 500회 g의 리싱 튜브를 원심분리하여 뚜껑에서 균모를 제거하고 5개의 멸균 광막계 튜브로 개별적으로 균일하게 제거합니다. 멸균 1.5 밀리리터 반응 튜브에 100 마이크로리터의 균질리터를 예약하십시오. PBS-T의 1밀리리터와 파이펫을 해당 광미계 튜브에 세척하여 남은 동종유를 회수합니다.광피계 관을 소용돌이치며 발광계에서 균질화의 생물 발광을 측정합니다. 그런 다음 PBS-T를 사용하여 24웰 배양 판에서 예약된 100 마이크로리터의 10배 연속 희석을 준비합니다. 각 미들브룩 7H11 마고 플레이트에 희석제 의 파이펫 10 마이크로리터를 사용하고 멸균 플레이트 스프레더를 사용하여 확산시다.2 주 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오. 그 후, 식민지 형성 단위를 계산합니다. 생체 내 감염에 따라 BCG 럭스의 RLU 대 CFU 비율을 결정한다.이 실험에서, BCG 럭스 용량 의존 독성은 96 시간 잠복기 동안 G.mellonella 애벌레에서 관찰되었다. 50%의 애벌레 사망률에 필요한 치명적인 투여량은 7개의 CFU의 힘에 1회 10회로 결정되었다. PBS-T의 10 마이크로 리터 용량으로 주입 된 대조군 또는 단순히 바늘 부상을 모방 하는 그 애벌레 건강에 영향을 미치지 않았다 또는 사망률의 증가 이어질.BCG 럭스의 7개의 CFU 용량의 힘으로 2회 10에 감염된 애벌레의 경우, 유충 등선의 멜라늄화는 감염 후 48시간 후 감염 및 전신 멜라늄화로부터 관찰되었다 96시간 후 감염 후 감염에서 관찰되었다. BCG 럭스의 7개의 CFU 복용량의 힘에 10번 10의 감염을 가진 감염은 감염 후 첫번째 72 시간 안에 생물 발광의 초기 쇠퇴 귀착되었습니다. 그러나, 감염 후 72 시간 후, BCG 럭스의 생물 발광은 고원하기 시작, 지속적인 감염의 설립을 나타내는.이 특정 감염 시스템에서 RLU 및 CFU의 생체 내 비율은 2:1에서 5:1까지 168시간 동안 평균 4:1로 다양했습니다. 주입 하는 동안, 과잉 침투의 위험을 최소화 되도록 애벌레를 확보 하는 것을 기억. 창자의 우발적인 펑크는 증가한 사망으로 이끌어 낼 수 있었습니다.조직 병리학 적 분석을 수행함으로써 숙주 세포와 함께 균균의 도입을 시각화 할 수 있습니다. 추가 전사 분석은 게놈 수준에서 상호 작용을 밝힐 수 있었습니다. 이 감염 모형의 사용은 발달에 있는 초기 단계에서 새로운 약 후보의 급속한 시험을 허용할 수 있습니다, 크게 약 검열에 사용된 동물의 수를 감소시킵니다.이 감염 모형은 바늘 막대기 상해와 연관될 수 있는 주사기의 사용을 요구합니다. 이러한 위험을 최소화하기 위해 사출 기술을 사용하는 것이 좋습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

연구

면역학 및 감염병학

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

의 성장 결핵은 Mycobacterium Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

곤충<em&gt; 갤러리아 mellonella</em&gt; 세균 Pathogenesis를 조사 할 수있는 강력한 감염 모델로

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

자연의 전송에 결핵 말라리아 동시 감염을 연구하는 실험 모델 결핵균와 변형체 berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

사용<em&gt; 갤러리아 mellonella</em&gt; 모델 생물로 공부하기<em&gt; 레지오넬라 뉴모 필라</em&gt; 감염

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

다중 약물 내성을 보여<em&gt; 결핵균</em&gt; 증폭 마이크로 어레이

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

설립과 연구에 높은 처리량 설정 최적화<em&gt; 표피 포도 구균</em&gt;와<em&gt; Mycobacterium의 박테</em&gt; 감염 신약 개발의 모델로

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

에 대한 기능성 연구를위한 3D 인간의 폐 조직 모델<em&gt; 결핵균</em&gt; 감염

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

18FDG PET/CT 영상 공부 결핵균 감염 및 비 인간 영장류에서 치료 도구로 서의 분석

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

기자 효소 형광와 쥐에서 이미징 결핵균

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...