Name: use of the invertebrate galleria mellonella as an infection model to study the mycobacterium tuberculosis complex
Uploaded: 2019-06-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex at JoVE.com

Dette prosjektet ble støttet av tilskudd fra bioteknologi og biologisk vitenskap Research Council (BBSRC), tildelt PRL og YL (BB/P001262/1), og National Center for utskifting, raffinement og reduksjon av dyr i forskning (NC3Rs) tildelt PRL, SMN, BDR og YL (NC/R001596/1).

Merk: alt arbeid som er beskrevet nedenfor skal utføres i et CL2-laboratorium i et klasse 2 mikrobiologisk sikkerhetskabinett (MSC) etter lokale retningslinjer for helse og sikkerhet.
1. utarbeidelse av M. bovis BCG Lux for infeksjon
<ol><li>Tine en frossen 1,2 mL glyserol (15%) lager av M. bovis BCG Lux, Montreal vaksine stamme forvandlet med shuttle plasmider pSMT1 bærer luxAB gener fra Vibrio harveyi koding av luciferase enzymet<sup ...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Global tuberculosis report 2018. , (2018).</li><li>Colditz, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+BCG+Vaccine+in+the+prevention+of+tuberculosis:+meta-analysis+of+the+published+literature.">Efficacy of BCG Vaccine in the prevention of tuberculosis: meta-analysis of the published literature.</a> Journal of the American Medical Association. 271 (9), 698-702 (1994).</li><li>Meijer, A. H., Spaink, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions+made+transparent+with+the+zebrafish+model.">Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model.</a> Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).</li><li>Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+tuberculosis+in+translational+and+precision+medicine.">Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 717 (2017).</li><li>Gumbo, T., Lenaerts, A. J., Hanna, D., Romero, K., Nuermberger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclinical+models+for+antituberculosis+drug+development:+a+landscape+analysis.">Nonclinical models for antituberculosis drug development: a landscape analysis.</a> Journal of Infectious Diseases. 211 (Suppl 3), S83-S95 (2015).</li><li>Williams, A., Orme, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+tuberculosis:+an+overview.">Animal models of tuberculosis: an overview.</a> Microbiology Spectrum. 4 (4), (2016).</li><li>Myllym&#228;ki, H., Niskanen, M., Oksanen, K. E., R&#228;met, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+in+tuberculosis+research+-+where+is+the+beef?.">Animal models in tuberculosis research - where is the beef?.</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (8), 871-883 (2015).</li><li>Flynn, J. L., Gideon, H. P., Mattila, J. T., Lin, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+studies+in+non-human+primate+models+of+tuberculosis.">Immunology studies in non-human primate models of tuberculosis.</a> Immunological Reviews. 264 (1), 60-73 (2015).</li><li>Cook, S. M., McArthur, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+Galleria+mellonella+as+a+model+host+for+human+pathogens.">Developing Galleria mellonella as a model host for human pathogens.</a> Virulence. 4 (5), 350-353 (2013).</li><li>Tsai, C. J. -. Y., Loh, J. M. S., Proft, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galleria+mellonella+infection+models+for+the+study+of+bacterial+diseases+and+for+antimicrobial+drug+testing.">Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing.</a> Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).</li><li>Wojda, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+of+the+greater+wax+moth+Galleria+mellonella.">Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella.</a> Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).</li><li>Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+structural+and+functional+similarities+of+insect+hemocytes+and+mammalian+phagocytes.">An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes.</a> Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).</li><li>Arteaga Blanco, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+cellular+immune+response+of+Galleria+mellonella+to+Actinobacillus+pleuropneumoniae.">Differential cellular immune response of Galleria mellonella to Actinobacillus pleuropneumoniae.</a> Cell and Tissue Research. 370 (1), 153-168 (2017).</li><li>L&#243;pez Hern&#225;ndez, Y., Yero, D., Pinos-Rodr&#237;guez, J. M., Gibert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animals+devoid+of+pulmonary+system+as+infection+models+in+the+study+of+lung+bacterial+pathogens.">Animals devoid of pulmonary system as infection models in the study of lung bacterial pathogens.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 38 (2015).</li><li>Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Insect+Galleria+mellonella+as+a+powerful+infection+model+to+investigate+bacterial+pathogenesis.">The Insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galleria+mellonella+-+a+novel+infection+model+for+the+Mycobacterium+tuberculosis+complex.">Galleria mellonella - a novel infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex.</a> Virulence. 9 (1), 1126-1137 (2018).</li><li>Meir, M., Grosfeld, T., Barkan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+validation+of+Galleria+mellonella+as+a+novel+model+organism+to+study+Mycobacterium+abscessus+infection,+pathogenesis,+and+treatment.">Establishment and validation of Galleria mellonella as a novel model organism to study Mycobacterium abscessus infection, pathogenesis, and treatment.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (4), (2018).</li><li>Entwistle, F. M., Coote, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+greater+wax+moth+larvae,+Galleria+mellonella,+as+a+novel+in+vivo+model+for+non-tuberculosis+mycobacteria+infections+and+antibiotic+treatments.">Evaluation of greater wax moth larvae, Galleria mellonella, as a novel in vivo model for non-tuberculosis mycobacteria infections and antibiotic treatments.</a> Journal of Medical Microbiology. 67 (4), 585-597 (2018).</li><li>Snewin, V. A., Gares, M., #211;gaora, P., Hasan, Z., Brown, I. N., Young, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+immunity+to+mycobacterial+infection+with+luciferase+reporter+constructs.">Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs.</a> Infection and Immunity. 67 (9), 4586-4593 (1999).</li><li>Newton, S., Martineau, A., Kampmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+whole+blood+assay+to+measure+viability+of+mycobacteria,+using+reporter-gene+tagged+BCG+or+M.Tb+(BCG+lux/M.Tb+lux).">A functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux).</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Jorj&#227;o, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+moths+to+caterpillars:+Ideal+conditions+for+Galleria+mellonella+rearing+for+in+vivo+microbiological+studies.">From moths to caterpillars: Ideal conditions for Galleria mellonella rearing for in vivo microbiological studies.</a> Virulence. 9 (1), 383-389 (2018).</li><li>Kavanagh, K., Sheehan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+Galleria+mellonella+larvae+to+identify+novel+antimicrobial+agents+against+fungal+species+of+medical+interest.">The use of Galleria mellonella larvae to identify novel antimicrobial agents against fungal species of medical interest.</a> Journal of Fungi. 4 (3), 113 (2018).</li><li>Champion, O., Titball, R., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+G.+mellonella+larvae+to+provide+reliable+and+reproducible+results+in+the+study+of+fungal+pathogens.">Standardization of G. mellonella larvae to provide reliable and reproducible results in the study of fungal pathogens.</a> Journal of Fungi. 4 (3), 108 (2018).</li><li>Wojda, I., Taszlow, P., Jakubowicz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cold+shock+on+the+immune+response+of+the+greater+wax+moth+Galleria+mellonella+after+infection+with+entomopathogenic+bacteria+Bacillus+thuringiensis.">The effect of cold shock on the immune response of the greater wax moth Galleria mellonella after infection with entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis.</a> Journal of Maria Curie-Sklodowska University. 69 (2), 7-18 (2015).</li><li>Nascimento, I. P., Leite, L. C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+passaging+in+liquid+media+and+storage+on+Mycobacterium+bovis+-+BCG+growth+capacity+and+infectivity.">The effect of passaging in liquid media and storage on Mycobacterium bovis - BCG growth capacity and infectivity.</a> FEMS Microbiology Letters. 243 (1), 81-86 (2005).</li><li>De Groote, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+studies+evaluating+mouse+models+used+for+efficacy+testing+of+experimental+drugs+against+Mycobacterium+tuberculosis.">Comparative studies evaluating mouse models used for efficacy testing of experimental drugs against Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (3), 1237-1247 (2011).</li><li>Grosset, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+early+bactericidal+activity+in+murine+tuberculosis+provides+insights+into+the+activity+of+isoniazid+and+pyrazinamide.">Modeling early bactericidal activity in murine tuberculosis provides insights into the activity of isoniazid and pyrazinamide.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 109 (37), 15001-15005 (2012).</li><li>Vogel, H., Altincicek, B., Gl&#246;ckner, G., Vilcinskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+transcriptome+and+immune-gene+repertoire+of+the+lepidopteran+model+host+Galleria+mellonella.">A comprehensive transcriptome and immune-gene repertoire of the lepidopteran model host Galleria mellonella.</a> BMC Genomics. 12, 308 (2011).</li></ol>

Bruk av G. mellonella som en infeksjon modell har blitt etablert for en rekke bakterielle og fungal patogener for studiet av virulens, Host-patogen samhandling, og som en skjerm for romanen legemiddel selskap10,22. Følgende diskusjon er basert på den eksperimentelle prosedyren for bruk av G. mellonella som en infeksjons modell for MTBC.
Helsen til naive larver før eksperimentering kan ha en betydelig innvi...

Tuberkulose (TB) er en stor trussel mot global folkehelse med 9 000 000 nye tilfeller per år og 1 500 000 dødsfall1. I tillegg er det anslått at en fjerdedel av verdens befolkning er smittet med utløsende Agent for sykdommen, Mycobacterium tuberkulose (MTB). Blant den infiserte populasjonen vil 5 − 10% utvikle aktiv TB sykdom over levetiden. Videre, fremveksten og spredningen av multi-Drug resistente (MDR) og omfattende-narkotika (XDR) motstandsdyktig MTB utgjør en alvorlig trussel mot sykdom kontroll, med 123 land rapporterer minst ett XDR tilfelle1. Behandling av TB krever en cocktail av minst fire anti-mykobakterieinfeksjoner narkotika, hvorav isoniazid og Rifampicin er foreskrevet for en minimumsvarighet på seks måneder; behandling er ofte forbundet med komplekse bivirkninger og toksisitet. Beskyttelse fra den eneste lisensierte vaksinen mot TB, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-GUÉRIN (BCG), er variabel2. En ufullstendig forståelse av patogenesen av TUBERKULOSE signifikant hemmer utviklingen av nye terapeutiske og vaksinasjon strategier.
I flere ti år har dyr infeksjon modeller vært avgjørende for TB forskning for å forstå de grunnleggende patogenesen og vert respons på infeksjon, og å evaluere romanen anti-mykobakterieinfeksjoner agenter, Immuno-legemiddel og nye vaksine kandidater3, 4. imidlertid, forskning benytter dyr infeksjon modeller av TB er bekjent vanskelig idet patogenesen og progresjon av TB infeksjon er innviklet, og det er nei enkelt dyr modell det etterligner det i sin helhet gjenferd og betydelig vise egenskaper av sykdommen5 ,6. Videre dyr eksperimenter er dyrt, tidkrevende å gjennomføre og krever full etisk begrunnelse. Likevel, dyr infeksjon modeller av TB har blitt beskrevet i ikke-menneskelige primater (f. eks, aper), marsvin, kaniner, storfe, griser, mus og sebrafisk, med hver har sine begrensninger3,4. Den murine modellen er den mest brukte modellen på grunn av kostnader, tilgjengelighet av innavlet linjer, reproduserbarhet av infeksjon og overflod av immunologiske reagenser. Men de vanligvis ikke danner granulomer knyttet til områder av hypoksi som er karakteristisk for latent tuberkulose infeksjon (LTBI)6. Guinea Pigs er høylig mottagelig å MTB infeksjon, med patologi og tidlig granulom formasjon analog med dem inne human, og er vidt anvendt inne vaccine tester; men mangelen på immunologiske reagenser hemmer deres bruk som en infeksjon modell7. Sebrafisk er egnet for storstilt screening i tidlig stadium prekliniske studier på grunn av sin lille størrelse, rask reproduksjon og avanserte genetiske verktøy, men er anatomisk og fysiologisk annerledes enn mennesker og er bare utsatt for Mycobacterium marinum infeksjon3. Dyret modeller mest ligner menneskelig MTB infeksjon er ikke-menneskelige primater (f. eks, macaque), men de er dyre og har betydelige etiske og praktiske hensyn som betydelig begrenser deres bruk8.
Insekt Larven av større voks møll eller honeycomb møll, Galleria mellonella, har blitt stadig mer populært som en infeksjon modell for en rekke bakterielle og fungal patogener9, og som en skjerm for romanen antimikrobielle narkotika kandidater 10. G. mellonella er en vellykket virvelløse modell på grunn av sin sofistikerte medfødte immunsystem (bestående av mobilnettet og humoral forsvar) som deler en høy grad av strukturelle og funksjonelle likhet med virveldyr11 . Dette inkluderer immun mekanismer som fagocytose av patogener ved hemocytes (funksjonelt ligner på pattedyr macrophage og nøytrofile)12,13, produksjon og sirkulasjon av anti-mikrobielle peptider (forsterkere) og komplement-lignende proteiner i hemolymph (analogt til pattedyr blod) av G. mellonella11. Andre fordeler9,14,15 av G. mellonella larver som modell inkluderer 1) deres store størrelse (20 − 30 mm) som gjør det mulig for enkel manipulasjon og infeksjon, samt innsamling av vev og hemolymph for analyser, 2) enkelt vedlikehold ved 37 ° c, kompatibel for å studere menneskelige patogener, 3) presis infeksjon ved injeksjon uten behov for anestesi, 4) effekt av antimikrobielle midler kan vurderes ved hjelp av mindre legemiddel for evaluering, 5) mangel på etiske begrensninger i forhold til bruk av pattedyr, 6) store gruppe størrelser kan brukes i forhold til dyremodeller som gir større reproduserbarhet, og 7) kortere tid for infeksjon eksperimenter er nødvendig.
I en fersk studie viste vi at G. mellonella kan brukes som en roman infeksjon modell for å studere patogenesen av smitte ved Puerto Mosquito M. bovis BCG Lux, en genmodifisert versjon av vaksinen stamme og medlem av MTB -komplekset (MTBC)16. Mens G. mellonella tidligere har blitt brukt som en infeksjon modell for ikke-tuberkuløs mykobakterier (NTM), hovedsakelig M. marinum og Mycobacterium abscessus17,18, studier med MTBC er begrenset til av Li et al.16. Puerto Mosquito ikke-patogene mykobakterieinfeksjoner stammer, som kan brukes på forvaring nivå (CL) 2 som et surrogat for MTB, tilbyr fordelene av sikkerhet og praktisk over patogene mykobakterier. Etter infeksjon med BCG Lux, larver begynner å utvikle tidlige granulom strukturer, som kan gi verdifull innsikt i rollen som medfødt immunitet i ETABLERINGEN av TB infeksjon16. I tillegg har denne enkle virvelløse infeksjon modellen potensial til å gi en rask, rimelig og pålitelig evaluering av TB patogenesen innlemme kontrollert utfordring og flere replikerer for reproduserbarhet. Videre har modellen potensial til å bli brukt til skjermen romanen anti-TB narkotika og vaksine kandidater i tidlig utvikling, redusere det totale antall dyr i eksperimentering. Muligheten til å måle endringer i verts-og patogen struktur, transcriptome og proteom å bestemme narkotika mål og vurdere virkningsmekanismer av romanen narkotika og terapeutiske vaksiner, er også en fordel.
Her beskriver vi de eksperimentelle protokollene for utarbeidelse av en Puerto Mosquito M. bovis BCG Lux inokulum og G. mellonella larver for mykobakterieinfeksjoner infeksjon, samt fastsettelse av både larvestadiet og mykobakterieinfeksjoner overlevelse som reaksjon på infeksjon.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5ml reaction tube (Eppendorf)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20, 200 and 1000 &#181;l pipette and filtered tips</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well culture plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 ml pipettes and pipette boy</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 compartment Petri dish (94/15mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>637102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II saftey cabinet</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask with vented cap (250 ml)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS40183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (&#62;99.7%)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>208221.321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galleria mellonella (250 per pk)</td>
			<td>Livefood Direct UK</td>
			<td>W250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogeniser (FastPrep-24 5G )</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116005500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-240CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer (Autolumat LB 953)</td>
			<td>Berthold</td>
			<td>34622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing matrix (S, 2.0ml)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116925500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro syringe (25 &#181;l, 25 ga)</td>
			<td>SGE</td>
			<td>3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H11 agar</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>283810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 broth</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook ADC enrichment</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>212352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook OADC enrichment</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>212240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium bovis BCG lux</td>
			<td>Various</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-decyl aldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7384-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaking incubator</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 80 (Tween-80)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8074-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small box</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>dark vented or non-sealed box recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Short and narrow tipped/Blunt long tweezers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Winterm (V1.08)</td>
			<td>Berthold</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Program LB953.TTB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (94/15mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>633181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper (94mm)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cut to fit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of the invertebrate galleria mellonella as an infection model to study the mycobacterium tuberculosis complex

Tuberkulose er den ledende globale årsaken til smittsomme sykdommer dødelighet og omtrent en fjerdedel av verdens befolkning antas å være smittet med Mycobacterium tuberkulose. Til tross for ti år med forskning, mange av mekanismene bak suksessen til M. tuberkulose som en patogene organisme gjenstår å bli undersøkt, og utvikling av sikrere, mer effektive antimykobakteriell narkotika er presserende behov for å takle økningen og spredning av legemiddelresistent tuberkulose. Imidlertid er progresjon av tuberkulose forskning flaskehalser av tradisjonelle pattedyr infeksjon modeller som er dyre, tidkrevende, og etisk utfordrende. Tidligere har vi etablert larver av insekt Galleria mellonella (større voks møll) som en roman, reproduserbar, lav pris, høy gjennomstrømming og etisk akseptabel infeksjon modell for medlemmer av M. tuberkulose kompleks. Her beskriver vi vedlikehold, forberedelser og smitte av G. mellonella med Puerto Mosquito Mycobacterium bovis BCG Lux. Ved hjelp av denne infeksjonen modellen, mykobakterieinfeksjoner dose avhengige virulens kan observeres, og en rask avlesning av in vivo mykobakterieinfeksjoner byrde ved hjelp av bioluminesens målinger er lett oppnåelig og reproduserbar. Selv om det finnes begrensninger, slik som mangelen på en fullt kommentert Genova for transcriptomic analyse, kan ontologiske analyse mot genetisk lignende insekter utføres. Som en lav kostnad, rask og etisk akseptabel modell for tuberkulose, kan G. mellonella brukes som en pre-Screen for å bestemme legemiddel effekt og toksisitet, og for å bestemme sammenlignende mykobakterieinfeksjoner virulens før bruk av konvensjonell pattedyr Modeller. Bruken av G. mellonella-mykobakterier modellen vil føre til en reduksjon i betydelig antall dyr som i dag brukes i tuberkulose forskning.

Her presenterer vi representative data som kan fås ved hjelp av g. mellonella -BCG Lux infeksjon modell og fremheve fordelene ved g. mellonella som en infeksjon modell for medlemmer av MTBC (figur 1). Eksperimentelle prosedyrer med viktige tekniske punkter er skissert i figur 2.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59703...

Watch this Scientific Journal Video about Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex at JoVE.com

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Bruk av virvelløse Galleria mellonella som en infeksjon modell for å studere Mycobacterium tuberkulose kompleks

Galleria mellonella ble nylig etablert som en reproduserbar, billig og etisk akseptabel infeksjon modell for Mycobacterium tuberkulose kompleks. Her beskriver vi og demonstrerer trinnene tatt for å etablere en vellykket infeksjon av G. mellonella med Puerto Mosquito Mycobacterium bovis BCG Lux.

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...

Denne protokollen beskriver bruken av Galleria mellonella som en alternativ infeksjonsmodell for å studere tuberkulose, noe som reduserer antall pattedyrmodeller som brukes i forskning. Sammenlignet med konvensjonelle pattedyrmodeller som mus, er Galleria mellonella en billigere, etisk akseptabel og mer tilgjengelig modell for å studere tuberkulose. Ytterligere optimalisering av denne modellen vil tillate screening av kandidat antimycobacterial narkotika effekt og toksisitet og vil bidra til utviklingen av sårt tiltrengte nye terapeutiske midler for tuberkulose.Galleria mellonella har et komplekst medfødt immunsystem som kan sammenlignes med pattedyr. Studien av host-patogen interaksjon kan ytterligere avsløre rollen med medfødt immunitet i tuberkulose. Bruken av Galleria mellonella som infeksjonsmodell er ikke begrenset til tuberkulose og har vært mye brukt til andre bakterielle og sopppatogener det siste tiåret.Til å begynne med tine en frossen 1,2-milliliter glyserolbestand av Mycobacterium bovis BCG lux, Montreal-vaksinestammen forvandlet med skyttelen plasmid pSMT1 som bærer luxAB-genene. I en merket 250-milliliter Erlenmeyer kolbe, inokulerer 15 milliliter Av Middlebrook 7H9 kjøttkraft med en tint 1,2-milliliter aliquot av BCG lux. Legg kolben i en forseglet biosikkerhetsbeholder og inkuber ved 37 grader Celsius i en orbital shaker inkubator ved 220 rpm i 72 timer.Etter inkubasjon, forberede 1:10 fortynninger av kulturen i fosfatbufret saltvann i luminometer rør, vortex, og laste luminometer rør inn i luminometeret. Last substratet 1%n-decyl aldehyd i absolutt etanol inn i injektorplattformen og mål bioluminescensen. Konverter bioluminescensen til kolonidannende enheter for å sjekke veksten av BCG lux kultur.Overfør kulturen til et sentrifugerør og sentrifuge ved 2, 175 ganger g i 10 minutter ved romtemperatur for å pellet cellene. Kast supernatanten til et passende desinfeksjonsmiddel med kjent mykobaktericidale aktivitet. Vask cellepellet to ganger i 50 milliliter PBS-T ved sentrifugering ved 2, 175 ganger g i 10 minutter for å forhindre bakteriell klumping.Etter den endelige vasken, dekantere avfallet supernatant og resuspend mykobakteriell celle pellet i det nødvendige volumet av PBS-T for å fortynne mykobakteriell suspensjon til ønsket celletetthet. Deretter klargjør du 10 ganger seriell fortynning av inokulumet i 24-brønnsplater ved hjelp av PBS-T. Plate ut 10 mikroliter av hver fortynning på Middlebrook 7H11 agar plater i duplikat for å liste opp inoculum CFU teller.Opprettholde den kjøpte instar larver i mørket på 18 grader Celsius ved ankomst og bruk innen en uke etter kjøpet. Identifiser og velg sunne larver for eksperimentering basert på ensartet kremfarge, passende størrelse og vekt, høy motilitet og inneha evnen til å rette seg selv når de blir omgjort. Bruk sløve pinsett, telle forsiktig de sunne larver i en petriskål foret med et lag med filterpapir og lagre ved romtemperatur i mørket til bruk.Forbered injeksjonsplattformen ved å teipe et sirkulært filterpapir med diameter på 94 millimeter til en flat, hevet overflate. Aspirer tre volumer på 70% etanol i en 25-mikroliter mikrosyring for å sterilisere, kaste og ytterligere skylle med tre volumer steril PBS-T. Deretter bruker du den tilberedte BCG lux inoculum og aspirerer 10 mikroliter inn i den steriliserte mikrosyringen.Bruk en separat sprøyte til å aspirere PBS-T for en negativ kontroll. Etter 10 injeksjoner, resuspend BCG lux inoculum for å sikre ensartet celle suspensjon. Bruk pinsett til å plukke opp en larve og plassere på injeksjonsplattformen.På plattformen, snu larven på ryggen og immobilisere ved å feste hodet og halen med pinsett. Finn den siste venstre proleg, telle ned fra hodet av larven og forsiktig sette spissen av nålen fem til seks millimeter dypt i en 10 til 20-graders vinkel til horisontalplanet. Injiser inokulumet fra sprøyten.Etter hver infeksjon, overfør den infiserte larven til en petriskål foret med et lag med filterpapir. En enkelt 94-millimeter petriskål har plass til opptil 30 larver. Oppbevar petriskålen i en ventilert, mørk boks inne i en inkubator ved 37 grader Celsius med 5%karbondioksid.Overvåk larvenes overlevelse hver 24. Larver anses som døde når de ikke beveger seg som svar på berøring. Registrer overlevelsen og vurder statistisk signifikans med Mantel-Cox-testen.Hver 24. Plasser larvene individuelt i to milliliter lysing matriserør som inneholder 800 mikroliter sterile PBS. Deretter bruker du en homogenisator til å homogenisere larver i 60 sekunder på seks meter per sekund.Sentrifuger lysingsrørene ved 3, 500 ganger g i fem sekunder for å fjerne homogenatet fra lokkene og forsiktig dekantere homogenatet til fem sterile luminometerrør individuelt. Reserver 100 mikroliter homogenat i et sterilt reaksjonsrør på 1,5 milliliter. Gjenopprett eventuelle gjenværende homogenat ved å vaske lysing matriserørene med en milliliter PBS-T og pipette inn i de tilsvarende luminometerrørene.Vortex luminometerrørene og måle bioluminescensen til homogenatene på et luminometer. Deretter forbereder du 10-ganger seriell fortynning av de reserverte 100 mikroliter homogenat i 24-brønns kulturplater ved hjelp av PBS-T. Pipette 10 mikroliter av fortynningen på hver Middlebrook 7H11 agar plate og bruk en steril platespreder for å spre seg.Inkuber ved 37 grader Celsius i to uker. Etter det teller du kolonidannende enheter. Bestem RLU-forholdet mellom CFU og BCG lux etter in vivoinfeksjon.I dette eksperimentet ble BCG lux doseavhengig virulens observert hos G.mellonella larver over en 96-timers inkubasjonsperiode. Den dødelige dosen som kreves for 50% larval dødelighet ble fastslått å være en ganger 10 til kraften av syv CFU. Kontrollgrupper injisert med en 10-mikroliter dose PBS-T eller de som rett og slett stakk simulere nåleskader påvirket ikke larval helse eller føre til en økning i dødeligheten.For larver infisert med to ganger 10 til kraften i syv CFU-dose BCG lux, ble melanisering av larvaldoselinjen observert fra 48 timer etter infeksjon og systemisk melanisering ble observert fra 96 timer etter infeksjon. Infeksjon med en gang 10 til kraften i syv CFU dose bcg lux resulterte i en innledende nedgang av bioluminescens i løpet av de første 72 timene etter infeksjon. Men etter 72 timer etter infeksjon begynte bioluminescensen av BCG lux å platå, noe som indikerer etablering av vedvarende infeksjon.I dette infeksjonssystemet varierte in vivo-forholdet mellom RLU og CFU fra 2:1 til 5:1 med et gjennomsnitt på 4:1 over 168-timers tidskurs. Under injeksjonen må du huske å sikre larver slik at risikoen for overpenetrasjon minimeres. Utilsiktet punktering av tarmen kan føre til økt dødelighet.Ved å utføre histopatologisk analyse kan innføring av mykobakterier med vertscellene visualiseres. Ytterligere transkripsjonsanalyse kan avsløre interaksjonen på genomisk nivå. Bruken av denne infeksjonsmodellen kan tillate rask testing av nye legemiddelkandidater på et tidlig stadium i utviklingen, noe som reduserer antall dyr som brukes i narkotikascreening betydelig.Denne infeksjonsmodellen krever bruk av en sprøyte, som kan være forbundet med nålepinneskade. Vi anbefaler bruk av injeksjonsteknikken vår for å minimere slik risiko.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Vekst av Mycobacterium tuberculosis Biofilm

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

Insektet<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Som en kraftig infeksjon Model for å etterforske Bakteriell Patogenese

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

En eksperimentell modell for å studere Tuberkulose-Malaria coinfection på Natural Overføring av Mycobacterium tuberculosis Og Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Ved å bruke<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Som modellorganisme for å studere<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infeksjon

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Demonstrerer en multiresistent<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Amplification Mikromatrise

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Etablering og optimalisering av en høy gjennomstrømning Oppsett for å studere<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Og<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infeksjon som en modell for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

En 3D Menneskelig lungevev Modell for funksjonelle studier på<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infeksjon

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analyse av 18FDG PET/CT Imaging som et verktøy for studerer Mycobacterium tuberculosis infeksjon og behandling i ikke-menneskelige primater

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis i mus med Reporter enzym fluorescens

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...