Name: use of the invertebrate galleria mellonella as an infection model to study the mycobacterium tuberculosis complex
Uploaded: 2019-06-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex at JoVE.com

Este projeto foi apoiado por subsídios do Conselho de pesquisa em biotecnologia e ciências biológicas (BBSRC), concedido a PRL e YL (BB/P001262/1), e ao centro nacional de substituição, refinamento e redução de animais em pesquisa (NC3Rs) concedido ao PRL, SMN, BDR e YL (NC/R001596/1).

Nota: todo o trabalho descrito abaixo deve ser realizado em um laboratório CL2 dentro de um gabinete de segurança microbiológica classe 2 (MSC) seguindo as diretrizes locais de saúde e segurança.
1. preparação de M. bovis BCG Lux para infeção
<ol><li>Degelo um 1,2 mL de glicerol congelado (15%) estoque de M. bovis BCG Lux, a cepa vacinal de Montreal transformada com o plasmídeo de transporte PSMT1 carregando os genes luxab de Vibrio ...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Global tuberculosis report 2018. , (2018).</li><li>Colditz, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+BCG+Vaccine+in+the+prevention+of+tuberculosis:+meta-analysis+of+the+published+literature.">Efficacy of BCG Vaccine in the prevention of tuberculosis: meta-analysis of the published literature.</a> Journal of the American Medical Association. 271 (9), 698-702 (1994).</li><li>Meijer, A. H., Spaink, H. 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J., Hanna, D., Romero, K., Nuermberger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclinical+models+for+antituberculosis+drug+development:+a+landscape+analysis.">Nonclinical models for antituberculosis drug development: a landscape analysis.</a> Journal of Infectious Diseases. 211 (Suppl 3), S83-S95 (2015).</li><li>Williams, A., Orme, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+tuberculosis:+an+overview.">Animal models of tuberculosis: an overview.</a> Microbiology Spectrum. 4 (4), (2016).</li><li>Myllym&#228;ki, H., Niskanen, M., Oksanen, K. 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S., Proft, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galleria+mellonella+infection+models+for+the+study+of+bacterial+diseases+and+for+antimicrobial+drug+testing.">Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing.</a> Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).</li><li>Wojda, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+of+the+greater+wax+moth+Galleria+mellonella.">Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella.</a> Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).</li><li>Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+structural+and+functional+similarities+of+insect+hemocytes+and+mammalian+phagocytes.">An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes.</a> Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).</li><li>Arteaga Blanco, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+cellular+immune+response+of+Galleria+mellonella+to+Actinobacillus+pleuropneumoniae.">Differential cellular immune response of Galleria mellonella to Actinobacillus pleuropneumoniae.</a> Cell and Tissue Research. 370 (1), 153-168 (2017).</li><li>L&#243;pez Hern&#225;ndez, Y., Yero, D., Pinos-Rodr&#237;guez, J. M., Gibert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animals+devoid+of+pulmonary+system+as+infection+models+in+the+study+of+lung+bacterial+pathogens.">Animals devoid of pulmonary system as infection models in the study of lung bacterial pathogens.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 38 (2015).</li><li>Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Insect+Galleria+mellonella+as+a+powerful+infection+model+to+investigate+bacterial+pathogenesis.">The Insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galleria+mellonella+-+a+novel+infection+model+for+the+Mycobacterium+tuberculosis+complex.">Galleria mellonella - a novel infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex.</a> Virulence. 9 (1), 1126-1137 (2018).</li><li>Meir, M., Grosfeld, T., Barkan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+validation+of+Galleria+mellonella+as+a+novel+model+organism+to+study+Mycobacterium+abscessus+infection,+pathogenesis,+and+treatment.">Establishment and validation of Galleria mellonella as a novel model organism to study Mycobacterium abscessus infection, pathogenesis, and treatment.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (4), (2018).</li><li>Entwistle, F. M., Coote, P. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+moths+to+caterpillars:+Ideal+conditions+for+Galleria+mellonella+rearing+for+in+vivo+microbiological+studies.">From moths to caterpillars: Ideal conditions for Galleria mellonella rearing for in vivo microbiological studies.</a> Virulence. 9 (1), 383-389 (2018).</li><li>Kavanagh, K., Sheehan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+Galleria+mellonella+larvae+to+identify+novel+antimicrobial+agents+against+fungal+species+of+medical+interest.">The use of Galleria mellonella larvae to identify novel antimicrobial agents against fungal species of medical interest.</a> Journal of Fungi. 4 (3), 113 (2018).</li><li>Champion, O., Titball, R., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+G.+mellonella+larvae+to+provide+reliable+and+reproducible+results+in+the+study+of+fungal+pathogens.">Standardization of G. mellonella larvae to provide reliable and reproducible results in the study of fungal pathogens.</a> Journal of Fungi. 4 (3), 108 (2018).</li><li>Wojda, I., Taszlow, P., Jakubowicz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cold+shock+on+the+immune+response+of+the+greater+wax+moth+Galleria+mellonella+after+infection+with+entomopathogenic+bacteria+Bacillus+thuringiensis.">The effect of cold shock on the immune response of the greater wax moth Galleria mellonella after infection with entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis.</a> Journal of Maria Curie-Sklodowska University. 69 (2), 7-18 (2015).</li><li>Nascimento, I. P., Leite, L. C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+passaging+in+liquid+media+and+storage+on+Mycobacterium+bovis+-+BCG+growth+capacity+and+infectivity.">The effect of passaging in liquid media and storage on Mycobacterium bovis - BCG growth capacity and infectivity.</a> FEMS Microbiology Letters. 243 (1), 81-86 (2005).</li><li>De Groote, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+studies+evaluating+mouse+models+used+for+efficacy+testing+of+experimental+drugs+against+Mycobacterium+tuberculosis.">Comparative studies evaluating mouse models used for efficacy testing of experimental drugs against Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (3), 1237-1247 (2011).</li><li>Grosset, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+early+bactericidal+activity+in+murine+tuberculosis+provides+insights+into+the+activity+of+isoniazid+and+pyrazinamide.">Modeling early bactericidal activity in murine tuberculosis provides insights into the activity of isoniazid and pyrazinamide.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 109 (37), 15001-15005 (2012).</li><li>Vogel, H., Altincicek, B., Gl&#246;ckner, G., Vilcinskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+transcriptome+and+immune-gene+repertoire+of+the+lepidopteran+model+host+Galleria+mellonella.">A comprehensive transcriptome and immune-gene repertoire of the lepidopteran model host Galleria mellonella.</a> BMC Genomics. 12, 308 (2011).</li></ol>

O uso de G. mellonella como modelo de infecção foi estabelecido para um número de patógenos bacterianos e fúngicos para o estudo da virulência, interação hospedeiro-patógeno e como tela para a nova terapêutica10,22. A discussão a seguir é baseada no procedimento experimental para o uso de G. mellonella como um modelo de infecção para o mtbc.
A saúde das larvas ingênuas antes da experimentaçã...

A tuberculose (TB) é uma grande ameaça à saúde pública global com 9 milhões casos novos por ano e 1,5 milhões mortes1. Além disso, estima-se que um quarto da população mundial está infectado com o agente causador da doença, Mycobacterium tuberculosis (MTB). Entre a população infectada, 5 − 10% desenvolverão doença ativa da TB ao longo de sua vida. Além disso, a emergência e a propagação do MTB resistente do multi-droga (MDR) e do extensivamente-droga (XDR) representa uma ameaça séria ao controle da doença, com os 123 países que reportam pelo menos um caso XDR1. O tratamento da TB requer um coquetel de pelo menos quatro medicamentos antimicobacterianos, dos quais isoniazida e rifampicina são prescritos por uma duração mínima de seis meses; o tratamento é associado frequentemente com os efeitos secundários e as toxicidades complexos. A proteção da única vacina licenciada contra a TB, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), é variável2. Uma compreensão incompleta da patogênese da TB dificulta significativamente o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas e de vacinação.
Durante décadas, os modelos de infecção animal têm sido vitais para a pesquisa de TB para compreender a patogênese básica e a resposta do hospedeiro à infecção, e para avaliar novos agentes antimicobacterianos, imuno-terapêutica e novas candidatas à vacina3, 4. no entanto, a pesquisa utilizando modelos de infecção animal da TB é notoriamente difícil, pois a patogênese e a progressão da infecção por TB são complexas, e não há um modelo animal único que imita o espectro completo e as características importantes da doença5 ,6. Além disso, experimentos com animais são caros, demorados a empreender e necessitam de plena justificação ética. No entanto, modelos de infecção animal de TB têm sido descritos em primatas não humanos (por exemplo, macaques), cobaias, coelhos, bovinos, suínos, camundongos e zebrafish, cada um com suas limitações3,4. O modelo murino é o modelo mais comumente utilizado devido ao custo, disponibilidade de linhagens, reprodutibilidade da infecção e abundância de reagentes imunológicos. Entretanto, não formam tipicamente granulomas associados a áreas de hipóxia que são características de infecção latente por tuberculose (LTBI)6. As cobaias são altamente suscetíveis à infecção de MTB , com patologia e formação adiantada do granuloma similar àquelas nos seres humanos, e são amplamente utilizadas no teste da vacina; ainda a falta de reagentes imunológicos dificulta seu uso como modelo de infecção7. Os zebrafish são apropriados para a seleção em grande escala em estudos pré-clínicos do cedo-estágio devido a seu tamanho pequeno, a reprodução rápida e as ferramentas genéticas avançadas, mas são anatomicamente e fisiologicamente diferentes aos seres humanos e são somente suscetíveis a Infecção do marinum do Mycobacterium 3. Os modelos animais mais parecido com a infecção humana MTB são primatas não-humanos (por exemplo, o macaco), mas eles são caros e têm considerações éticas e práticas significativas que limita consideravelmente o seu uso8.
A larva do inseto da traça maior da cera ou da traça do favo de mel, Galleria mellonella, tornou-se cada vez mais popular como um modelo da infecção para uma variedade de micróbios patogénicos bacterianos e fungosos9, e como uma tela para candidatos antimicrobial novos da droga 10. G. mellonella é um modelo de invertebrados de sucesso devido ao seu sofisticado sistema imunológico inato (composto por defesas celulares e humorais) que compartilha um alto grau de semelhança estrutural e funcional com o dos vertebrados11 . Isso inclui mecanismos imunes como a fagocitose de patógenos por hemócitos (funcionalmente semelhantes aos macrófagos de mamíferos e neutrófilos)12,13, a produção e circulação de peptídeos antimicrobianos (AMPS) e proteínas complemento-like dentro da hemolinfa (análoga ao sangue de mamíferos) de G. mellonella11. Outras vantagens9,14,15 de larvas de G. mellonella como um modelo incluem 1) seu tamanho grande (20 − 30 milímetros) que permite a manipulação e a infecção fáceis, assim como a coleção do tecido e hemolinfa para análises, 2) fácil manutenção a 37 ° c, compatível para estudo de patógenos humanos, 3) infecção precisa por injeção sem necessidade de anestesia, 4) a eficácia dos agentes antimicrobianos pode ser avaliada utilizando menos medicamentos para avaliação, 5) falta de restrições éticas em relação ao uso de mamíferos, 6) grandes tamanhos de grupo podem ser usados em comparação com modelos animais permitindo maior reprodutibilidade, e 7) tempos mais curtos para experimentos de infecção são necessários.
Em um estudo recente, Nós demonstramos que G. mellonella pode ser usada como um modelo novo da infecção para estudar a patogénese da infecção pelo Luxbioluminescente de M. bovis BCG, uma versão genetically modificada da tensão da vacina e do membro do complexo MTB (mtbc)16. Enquanto G. mellonella tem sido usada anteriormente como um modelo de infecção para micobactérias não tuberculosas (NTM), principalmente M. marinum e Mycobacterium abscessus17,18, estudos usando mtbc são limitados a de Li et al.16. Cepas micobacterianas não patogênicas bioluminescentes, que podem ser usadas no nível de contenção (CL) 2 como um substituto para MTB, oferecem as vantagens de segurança e praticidade sobre micobactérias patogênicas. Após a infecção pelo BCG Lux, as larvas começam a desenvolver estruturas semelhantes ao Granuloma precoce, o que poderia fornecer uma visão valiosa sobre o papel da imunidade inata no estabelecimento da infecção por TB16. Além disso, este modelo simples de infecção por invertebrados tem o potencial de fornecer uma avaliação rápida, de baixo custo e confiável da patogênese da TB incorporando desafio controlado e múltiplas repetições para reprodutibilidade. Além disso, o modelo tem o potencial para ser usado para a tela de novos candidatos a drogas e vacinas anti-TB no desenvolvimento precoce, reduzindo o número total de animais em experimentação. A capacidade de medir mudanças na estrutura hospedeira e patógeno, transcriptoma e proteoma para determinar alvos de drogas e avaliar mecanismos de ação de novas drogas e vacinas terapêuticas, também são vantajosas.
Aqui nós descrevemos os protocolos experimentais para a preparação de um inocular bioluminescente de M. bovis BCG Lux e de larvas de G. mellonella para a infecção Mycobacterial, assim como a determinação de larval e de Mycobacterial sobrevivência em resposta à infecção.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5ml reaction tube (Eppendorf)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20, 200 and 1000 &#181;l pipette and filtered tips</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well culture plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 ml pipettes and pipette boy</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 compartment Petri dish (94/15mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>637102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II saftey cabinet</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask with vented cap (250 ml)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS40183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (&#62;99.7%)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>208221.321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galleria mellonella (250 per pk)</td>
			<td>Livefood Direct UK</td>
			<td>W250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogeniser (FastPrep-24 5G )</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116005500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-240CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer (Autolumat LB 953)</td>
			<td>Berthold</td>
			<td>34622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing matrix (S, 2.0ml)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116925500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro syringe (25 &#181;l, 25 ga)</td>
			<td>SGE</td>
			<td>3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H11 agar</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>283810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 broth</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook ADC enrichment</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>212352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook OADC enrichment</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>212240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium bovis BCG lux</td>
			<td>Various</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-decyl aldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7384-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaking incubator</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 80 (Tween-80)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8074-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small box</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>dark vented or non-sealed box recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Short and narrow tipped/Blunt long tweezers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Winterm (V1.08)</td>
			<td>Berthold</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Program LB953.TTB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (94/15mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>633181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper (94mm)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cut to fit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of the invertebrate galleria mellonella as an infection model to study the mycobacterium tuberculosis complex

A tuberculose é a principal causa global de mortalidade por doenças infecciosas e cerca de um quarto da população mundial é acreditado para ser infectado com Mycobacterium tuberculosis. Apesar de décadas de pesquisa, muitos dos mecanismos por trás do sucesso da M. tuberculosis como um organismo patogénico continuam a ser investigados, e o desenvolvimento de drogas antimiccobacterianas mais seguras e eficazes são urgentemente necessários para enfrentar o aumento e disseminação da tuberculose resistente à droga. No entanto, a progressão da investigação da tuberculose é estrangulada por modelos tradicionais de infecção de mamíferos que são dispendiosos, demorados e eticamente desafiadores. Previamente nós estabelecemos as larvas do inseto Galleria mellonella (maior traça de cera) como uma novela, reprodutível, de baixo custo, de alta taxa de transferência e eticamente aceitável modelo de infecção para os membros do complexo M. tuberculosis . Aqui nós descrevemos a manutenção, a preparação, e a infecção de G. mellonella com o Lux bioluminescente do Mycobacterium bovis BCG . Usando este modelo da infecção, a virulência dependente da dose Mycobacterial pode ser observada, e um leitura rápido da carga Mycobacterial in vivo usando medidas do bioluminescência é facilmente alcançável e reprodutível. Embora existam limitações, como a falta de um genoma totalmente anotado para a análise transcriptômica, a análise ontológica contra insetos geneticamente semelhantes pode ser realizada. Como um modelo de baixo custo, rápido e eticamente aceitável para a tuberculose, G. mellonella pode ser usado como uma pré-tela para determinar a eficácia e toxicidade da droga, e para determinar a virulência micobacteriana comparativa antes do uso de mamíferos convencionais Modelos. O uso do modelo de G. mellonella-micobactérias levará a uma redução no número substancial de animais atualmente utilizados na pesquisa em tuberculose.

Aqui apresentamos dados representativos que podem ser obtidos usando o modelo de infecção por g. mellonella — BCG Lux e destacam os benefícios de g. mellonella como um modelo de infecção para os membros do mtbc (Figura 1). Os procedimentos experimentais com pontos técnicos principais estão descritos na Figura 2.
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Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Uso do invertebrado Galleria mellonella como modelo de infecção para estudo do complexo Mycobacterium tuberculosis

A Galleria mellonella foi recentemente estabelecida como um modelo de infecção reprodutível, barato e eticamente aceitável para o complexo Mycobacterium tuberculosis . Aqui nós descrevemos e demonstramos as etapas tomadas para estabelecer a infecção bem sucedida de G. mellonella com o Lux bioluminescente do Mycobacterium bovis BCG .

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...

Este protocolo descreve o uso da Galleria mellonella como um modelo alternativo de infecção para estudar a tuberculose, reduzindo o número de modelos mamíferos utilizados na pesquisa. Quando comparada com modelos convencionais de mamíferos, como camundongos, a Galleria mellonella é um modelo mais barato, eticamente aceitável e mais acessível para estudar a tuberculose. Uma maior otimização desse modelo permitirá a triagem da eficácia e toxicidade de medicamentos antimicobacterianos candidatos e contribuirá para o desenvolvimento de novas terapêuticas urgentemente necessárias para a tuberculose.Galleria mellonella possui um complexo sistema imunológico inato comparável ao dos mamíferos. O estudo da interação hospedeiro-patógeno pode revelar ainda mais o papel da imunidade inata na tuberculose. O uso da Galleria mellonella como modelo de infecção não se limita à tuberculose e tem sido amplamente utilizado para outros patógenos bacterianos e fúngicos na última década.Para começar, descongele um estoque de glicerol congelado de 1,2 mililitro de Mycobacterium bovis BCG lux, a cepa de vacina de Montreal transformada com o pSMT1 de transporte plasmídeo carregando os genes luxAB. Em um frasco de 250 mililitros erlenmeyer, inoculado 15 mililitros de caldo Middlebrook 7H9 com uma alíquota de 1,2 mililitro de BCG lux. Coloque o frasco em um recipiente de biossegurança selado e incubar a 37 graus Celsius em uma incubadora de shaker orbital a 220 rpm por 72 horas.Após a incubação, prepare 1:10 diluições da cultura em soro fisiológico tamponado por fosfato em tubos luminômetros, vórtice e carregue os tubos de luminômetro no luminômetro. Carregue o substrato 1%n-decidido em etanol absoluto na plataforma injetor e meça a bioluminescência. Converta a bioluminescência em unidades formadoras de colônias para verificar o crescimento da cultura BCG lux.Transfira a cultura para um tubo de centrífuga e centrífuga a 2.175 vezes g por 10 minutos à temperatura ambiente para pelotar as células. Descarte o supernasal em um desinfetante apropriado com atividade micobactericida conhecida. Lave a pelota celular duas vezes em 50 mililitros de PBS-T por centrifugação a 2.175 vezes g por 10 minutos para evitar a aglomeração bacteriana.Após a lavagem final, decante o supernanato de resíduos e resuspendice a pelota de célula micobacteriana no volume necessário de PBS-T para diluir a suspensão micobacteriana à densidade celular desejada. Em seguida, prepare diluições seriais de 10 vezes do inóculo em placas de 24 poços usando PBS-T. Emplaque 10 microliters de cada diluição em placas de ágar Middlebrook 7H11 em duplicata para enumerar contagens de CFU inóculo.Mantenha as larvas instar compradas no escuro a 18 graus Celsius na chegada e use dentro de uma semana após a compra. Identifique e selecione larvas saudáveis para experimentação com base na cor do creme uniforme, tamanho e peso adequados, alta motilidade e possuindo a capacidade de se corrigir quando virado. Usando pinças de ponta sem corte, conte cuidadosamente as larvas saudáveis em uma placa de Petri forrada com uma camada de papel filtro e armazene à temperatura ambiente no escuro até o uso.Prepare a plataforma de injeção gravando um papel filtro circular de 94 milímetros de diâmetro em uma superfície plana e elevada. Aspire três volumes de 70% de etanol em uma microsiringe de 25 microliter para esterilizar, descartar e enxaguar ainda mais com três volumes de PBS-T estéreis. Em seguida, resuspenque o inóculo BCG lux preparado e aspire 10 microliters na microsiringe esterilizada.Use uma seringa separada para aspirar PBS-T para um controle negativo. Após 10 injeções, resuspenja o bcg lux inóculo para garantir a suspensão uniforme da célula. Use pinças para pegar uma larva e colocar na plataforma de injeção.Na plataforma, vire a larva para as costas e imobilize,prendendo a cabeça e a cauda com a pinça. Localize o último proleg esquerdo, em contagem regressiva da cabeça da larva e insira cuidadosamente a ponta da agulha de cinco a seis milímetros de profundidade em um ângulo de 10 a 20 graus para o plano horizontal. Injete o inóculo da seringa.Após cada infecção, transfira a larva infectada para uma placa de Petri forrada com uma camada de papel filtro. Uma única placa de Petri de 94 milímetros pode acomodar até 30 larvas. Armazene a placa de Petri em uma caixa escura e ventilada dentro de uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.Monitore a sobrevivência das larvas a cada 24 horas. Larvas são consideradas mortas quando não se movem em resposta ao toque. Regissão a sobrevida e avalie a significância estatística com o teste de Mantel-Cox.A cada 24 horas, selecione aleatoriamente cinco larvas infectadas e use um cotonete de algodão embebido em 70% de etanol para esterilizar suavemente as superfícies larval. Coloque as larvas individualmente em tubos de matriz de dois mililitros contendo 800 microliters de PBS estéreis. Em seguida, use um homogeneizador para homogeneizar as larvas por 60 segundos a seis metros por segundo.Centrifugar os tubos de lise a 3.500 vezes g durante cinco segundos para remover o homogeneato das tampas e decantar cuidadosamente o homogeneizar em cinco tubos luminômetros estéreis individualmente. Reserve 100 microlitadores de homogeneizar em um tubo de reação estéril de 1,5 mililitro. Recupere qualquer homogeneizar restante lavando os tubos de matriz de lise com um mililitro de PBS-T e pipeta nos tubos de luminômetro correspondentes.Vórtice dos tubos luminómetros e medir a bioluminescência dos homogeneiza em um luminômetro. Em seguida, prepare diluições seriais 10 vezes dos 100 microlitadores reservados de homogeneizar em placas de cultura de 24 poços usando PBS-T. Pipeta 10 microliters da diluição em cada placa de ágar Middlebrook 7H11 e use um espalhador de placa estéril para espalhar.Incubar a 37 graus Celsius por duas semanas. Depois disso, conte unidades formadoras de colônias. Determine a razão RLU para CFU de BCG lux após infecção in vivo.Neste experimento, a virulência dependente de dose BCG lux foi observada em larvas G.mellonella durante um período de incubação de 96 horas. A dose letal necessária para mortalidade larval de 50% foi determinada em uma vezes 10 ao poder de sete UFC. Grupos de controle injetados com uma dose de 10 microliter de PBS-T ou aqueles simplesmente picados simulando lesões de agulha não afetaram a saúde larval ou levaram a um aumento da mortalidade.Para larvas infectadas com as duas vezes 10 à potência de sete doses de UFC lux, observou-se melanização da linha dorsal larval a partir de 48 horas após a infecção e observou-se melanização sistêmica a partir de 96 horas após a infecção. A infecção com uma dose de uma vezes 10 ao poder de sete doses de CFU de BCG lux resultou em um declínio inicial da bioluminescência nas primeiras 72 horas após a infecção. No entanto, após 72 horas após a infecção, a bioluminescência da BCG lux começou a planar, indicando o estabelecimento de infecção persistente.Neste sistema de infecção em particular, a razão in vivo de RLU e CFU variou de 2:1 a 5:1 com uma média de 4:1 ao longo do curso de 168 horas. Durante a injeção, lembre-se de fixar as larvas para que o risco de sobrepenetração seja minimizado. Punção acidental do intestino pode levar ao aumento da mortalidade.Ao realizar análise histopatológica, a introdução de micobactérias com as células hospedeiras pode ser visualizada. Uma análise transcriômica adicional pode revelar a interação no nível genômico. O uso deste modelo de infecção pode permitir o teste rápido de novos candidatos a medicamentos em um estágio inicial de desenvolvimento, reduzindo significativamente o número de animais usados na triagem de medicamentos.Este modelo de infecção requer o uso de uma seringa, que pode estar associada a lesões de agulha.. Recomendamos o uso de nossa técnica de injeção para minimizar esse risco.

Research

JoVE Journal

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