Name: use of the invertebrate galleria mellonella as an infection model to study the mycobacterium tuberculosis complex
Uploaded: 2019-06-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex at JoVE.com

Этот проект был поддержан грантами От Совета по исследованиям в области биотехнологии и биологических наук (BBSRC), присуждаемого PRL и YL (BB/P001262/1), и Национального центра по замене, переработке и сокращению животных в научных исследованиях (NC3Rs), присуждаемого PRL, SMN, BDR и YL (NC/R001596/1).

ПРИМЕЧАНИЕ: Все работы, описанные ниже, должны быть выполнены в лаборатории CL2 в классе 2 микробиологической безопасности кабинета (MSC) в соответствии с местными стандартами здоровья и безопасности.
1. Подготовка M. bovis BCG lux для инфекции
<ol><li>Разморозить заморожен?...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Global tuberculosis report 2018. , (2018).</li><li>Colditz, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+BCG+Vaccine+in+the+prevention+of+tuberculosis:+meta-analysis+of+the+published+literature.">Efficacy of BCG Vaccine in the prevention of tuberculosis: meta-analysis of the published literature.</a> Journal of the American Medical Association. 271 (9), 698-702 (1994).</li><li>Meijer, A. H., Spaink, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions+made+transparent+with+the+zebrafish+model.">Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model.</a> Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).</li><li>Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+tuberculosis+in+translational+and+precision+medicine.">Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 717 (2017).</li><li>Gumbo, T., Lenaerts, A. J., Hanna, D., Romero, K., Nuermberger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclinical+models+for+antituberculosis+drug+development:+a+landscape+analysis.">Nonclinical models for antituberculosis drug development: a landscape analysis.</a> Journal of Infectious Diseases. 211 (Suppl 3), S83-S95 (2015).</li><li>Williams, A., Orme, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+tuberculosis:+an+overview.">Animal models of tuberculosis: an overview.</a> Microbiology Spectrum. 4 (4), (2016).</li><li>Myllym&#228;ki, H., Niskanen, M., Oksanen, K. E., R&#228;met, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+in+tuberculosis+research+-+where+is+the+beef?.">Animal models in tuberculosis research - where is the beef?.</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (8), 871-883 (2015).</li><li>Flynn, J. L., Gideon, H. P., Mattila, J. T., Lin, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+studies+in+non-human+primate+models+of+tuberculosis.">Immunology studies in non-human primate models of tuberculosis.</a> Immunological Reviews. 264 (1), 60-73 (2015).</li><li>Cook, S. M., McArthur, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+Galleria+mellonella+as+a+model+host+for+human+pathogens.">Developing Galleria mellonella as a model host for human pathogens.</a> Virulence. 4 (5), 350-353 (2013).</li><li>Tsai, C. J. -. Y., Loh, J. M. S., Proft, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galleria+mellonella+infection+models+for+the+study+of+bacterial+diseases+and+for+antimicrobial+drug+testing.">Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing.</a> Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).</li><li>Wojda, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+of+the+greater+wax+moth+Galleria+mellonella.">Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella.</a> Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).</li><li>Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+structural+and+functional+similarities+of+insect+hemocytes+and+mammalian+phagocytes.">An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes.</a> Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).</li><li>Arteaga Blanco, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+cellular+immune+response+of+Galleria+mellonella+to+Actinobacillus+pleuropneumoniae.">Differential cellular immune response of Galleria mellonella to Actinobacillus pleuropneumoniae.</a> Cell and Tissue Research. 370 (1), 153-168 (2017).</li><li>L&#243;pez Hern&#225;ndez, Y., Yero, D., Pinos-Rodr&#237;guez, J. M., Gibert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animals+devoid+of+pulmonary+system+as+infection+models+in+the+study+of+lung+bacterial+pathogens.">Animals devoid of pulmonary system as infection models in the study of lung bacterial pathogens.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 38 (2015).</li><li>Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Insect+Galleria+mellonella+as+a+powerful+infection+model+to+investigate+bacterial+pathogenesis.">The Insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galleria+mellonella+-+a+novel+infection+model+for+the+Mycobacterium+tuberculosis+complex.">Galleria mellonella - a novel infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex.</a> Virulence. 9 (1), 1126-1137 (2018).</li><li>Meir, M., Grosfeld, T., Barkan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+validation+of+Galleria+mellonella+as+a+novel+model+organism+to+study+Mycobacterium+abscessus+infection,+pathogenesis,+and+treatment.">Establishment and validation of Galleria mellonella as a novel model organism to study Mycobacterium abscessus infection, pathogenesis, and treatment.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (4), (2018).</li><li>Entwistle, F. M., Coote, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+greater+wax+moth+larvae,+Galleria+mellonella,+as+a+novel+in+vivo+model+for+non-tuberculosis+mycobacteria+infections+and+antibiotic+treatments.">Evaluation of greater wax moth larvae, Galleria mellonella, as a novel in vivo model for non-tuberculosis mycobacteria infections and antibiotic treatments.</a> Journal of Medical Microbiology. 67 (4), 585-597 (2018).</li><li>Snewin, V. A., Gares, M., #211;gaora, P., Hasan, Z., Brown, I. N., Young, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+immunity+to+mycobacterial+infection+with+luciferase+reporter+constructs.">Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs.</a> Infection and Immunity. 67 (9), 4586-4593 (1999).</li><li>Newton, S., Martineau, A., Kampmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+whole+blood+assay+to+measure+viability+of+mycobacteria,+using+reporter-gene+tagged+BCG+or+M.Tb+(BCG+lux/M.Tb+lux).">A functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux).</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Jorj&#227;o, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+moths+to+caterpillars:+Ideal+conditions+for+Galleria+mellonella+rearing+for+in+vivo+microbiological+studies.">From moths to caterpillars: Ideal conditions for Galleria mellonella rearing for in vivo microbiological studies.</a> Virulence. 9 (1), 383-389 (2018).</li><li>Kavanagh, K., Sheehan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+Galleria+mellonella+larvae+to+identify+novel+antimicrobial+agents+against+fungal+species+of+medical+interest.">The use of Galleria mellonella larvae to identify novel antimicrobial agents against fungal species of medical interest.</a> Journal of Fungi. 4 (3), 113 (2018).</li><li>Champion, O., Titball, R., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+G.+mellonella+larvae+to+provide+reliable+and+reproducible+results+in+the+study+of+fungal+pathogens.">Standardization of G. mellonella larvae to provide reliable and reproducible results in the study of fungal pathogens.</a> Journal of Fungi. 4 (3), 108 (2018).</li><li>Wojda, I., Taszlow, P., Jakubowicz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cold+shock+on+the+immune+response+of+the+greater+wax+moth+Galleria+mellonella+after+infection+with+entomopathogenic+bacteria+Bacillus+thuringiensis.">The effect of cold shock on the immune response of the greater wax moth Galleria mellonella after infection with entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis.</a> Journal of Maria Curie-Sklodowska University. 69 (2), 7-18 (2015).</li><li>Nascimento, I. P., Leite, L. C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+passaging+in+liquid+media+and+storage+on+Mycobacterium+bovis+-+BCG+growth+capacity+and+infectivity.">The effect of passaging in liquid media and storage on Mycobacterium bovis - BCG growth capacity and infectivity.</a> FEMS Microbiology Letters. 243 (1), 81-86 (2005).</li><li>De Groote, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+studies+evaluating+mouse+models+used+for+efficacy+testing+of+experimental+drugs+against+Mycobacterium+tuberculosis.">Comparative studies evaluating mouse models used for efficacy testing of experimental drugs against Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (3), 1237-1247 (2011).</li><li>Grosset, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+early+bactericidal+activity+in+murine+tuberculosis+provides+insights+into+the+activity+of+isoniazid+and+pyrazinamide.">Modeling early bactericidal activity in murine tuberculosis provides insights into the activity of isoniazid and pyrazinamide.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 109 (37), 15001-15005 (2012).</li><li>Vogel, H., Altincicek, B., Gl&#246;ckner, G., Vilcinskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+transcriptome+and+immune-gene+repertoire+of+the+lepidopteran+model+host+Galleria+mellonella.">A comprehensive transcriptome and immune-gene repertoire of the lepidopteran model host Galleria mellonella.</a> BMC Genomics. 12, 308 (2011).</li></ol>

Использование G. mellonella в качестве модели инфекции была создана для ряда бактериальных и грибковых патогенов для изучения вирулентности, взаимодействия хозяина-патогена, а также в качестве экрана для новых терапевтических 10,22. Следующее обсуждение о...

Туберкулез (ТБ) представляет собой серьезную угрозу для глобального общественного здравоохранения: 9 миллионов новых случаев заболевания в год и 1,5 миллиона случаев смерти1. Кроме того, по оценкам, четверть населения мира инфицирована возбудительным агентом болезни, Микобактерия туберкулеза (Mtb). Среди инфицированного населения в течение жизни у 5–10% будет развиваться активное заболевание туберкулезом. Кроме того, появление и распространение множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) и широко лекарственной (ШлУ) резистентной МТБ представляет собой серьезную угрозу для борьбы с болезнями, при этом 123 страны сообщают по крайней мере об одном случае ШЛУ1. Для лечения туберкулеза требуется коктейль из не менее четырех антимикобактериальных препаратов, из которых изониазид и рифампицин назначаются на минимальный срок в шесть месяцев; лечение часто связано со сложными побочными эффектами и токсичности. Защита от единственной лицензированной вакцины против туберкулеза, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Gu'rin (BCG), является переменной2. Неполное понимание патогенеза туберкулеза существенно затрудняет разработку новых терапевтических стратегий и стратегий вакцинации.
На протяжении десятилетий модели инфекции животных имеют жизненно важное значение для исследования туберкулеза, чтобы понять основной патогенез и принимающей ответ на инфекцию, а также оценить новые анти-микобактериальные агенты, иммуно-терапевтические и новые кандидаты вакцины3, 4.Однако исследования с использованием моделей инфекции животных тб, как известно, трудно, как патогенез и прогрессирование туберкулезной инфекции являются сложными, и нет единой модели животных, которая имитирует весь спектр и важные особенности болезни5 ,6. Кроме того, эксперименты на животных являются дорогостоящими, отнимают много времени и требуют полного этического обоснования. Тем не менее, модели инфекции животных туберкулеза были описаны у нечеловеческих приматов (например, макаки), морских свинок, кроликов, крупного рогатого скота, свиней, мышей и зебры, причем каждый из них имеет свои ограничения3,4. Модель мурина является наиболее часто используемой моделью из-за стоимости, наличия инбредных линий, воспроизводимости инфекции и обилия иммунологических реагентов. Однако, они обычно не образуют гранулемы, связанные с областями гипоксии, которые характерны для скрытой туберкулезной инфекции (LTBI)6. Гвинейские свиньи очень восприимчивы к инфекции Mtb, с патологией и ранним образованием гранулемы, аналогичным и тем, которые существуют у людей, и широко используются в тестировании вакцин; однако отсутствие иммунологических реагентов затрудняет ихиспользование в качестве инфекционной модели 7. Зебрафиш подходит для крупномасштабного скрининга на ранних стадиях доклинических исследований из-за их небольшого размера, быстрого размножения и передовых генетических инструментов, но анатомически и физиологически отличаются от человека и только восприимчивы к Микобактерия маринум инфекции3. Модели животных, наиболее похожие на человеческую инфекцию Mtb являются нечеловеческими приматами (например, макаки), но они дороги ею и имеют значительные этические и практические соображения, которые значительно ограничивают их использование8.
Личинки насекомых больше йош ной или сот моли, Galleria mellonella, становятся все более популярными в качестве модели инфекции для различных бактериальных и грибковых патогенов9, и в качестве экрана для новых кандидатов противомикробных препаратов наркотиков 10. G. mellonella является успешной моделью беспозвоночных из-за своей сложной врожденной иммунной системы (состоящей из клеточной и гуморальной защиты), которая разделяет высокую степень структурного и функционального сходства с позвоночными11 . Это включает в себя иммунные механизмы, такие как фагоцитоз патогенных микроорганизмов гемоцитами (функционально похожие на млекопитающих макрофага и нейтрофилов)12,13, производство и циркуляция антимикробных пептидов (АМП) и дополняют белки в гемолимфе (аналог крови млекопитающих) G. mellonella11. Другие преимущества9,14,15 личинок G. mellonella в качестве модели включают 1) их большой размер (20-30 мм), который позволяет легко манипуляции и инфекции, а также сбор тканей и гемолимфа для анализа, 2) легкое обслуживание при 37 градусах Цельсия, совместимое для изучения патогенных микроорганизмов человека, 3) точная инфекция путем инъекций без необходимости анестезии, 4) эффективность противомикробных препаратов может быть оценена с использованием меньше госпрепарата для оценки, 5) отсутствие этические ограничения по сравнению с использованием млекопитающих, 6) большие размеры группы могут быть использованы по сравнению с животными моделями, позволяющими большую воспроизводимость, и 7) более короткое время для экспериментов инфекции не требуется.
В недавнем исследовании, мы показали, что G. mellonella может быть использован в качестве новой модели инфекции для изучения патогенеза инфекции биолюминесцентных M. bovis BCG люкс, генетически модифицированная версия штамма вакцины и член комплекса Mtb (MTBC)16. В то время как G. mellonella ранее использовалась в качестве модели инфекции для нетуберкулезных микобактерий (NTM), в основном M. marinum и Mycobacterium abscessus17,18, исследования с использованием MTBC ограничены что Ли и др.16. Биолюминесцентные непатогенные микобактериальные штаммы, которые могут быть использованы на уровне сдерживания (CL) 2 в качестве суррогата Для Mtb, предлагают преимущества безопасности и практичности по сравнению с патогенными микобактериями. После заражения BCG lux, личинки начинают развивать ранние гранулемы-подобные структуры, которые могли бы дать ценную информацию о роли врожденного иммунитета в создании туберкулезной инфекции16. Кроме того, эта простая модель инфекции беспозвоночных может обеспечить быструю, недорогостоящую и надежную оценку патогенеза туберкулеза, включающую контролируемые вызовы и множественные репликации для воспроизводимости. Кроме того, эта модель может быть использована для скрининга новых противотуберкулезных препаратов и вакцин кандидатов в раннем развитии, что сокращает общее число животных в экспериментах. Способность измерять изменения в структуре хозяина и патогена, транскриптоме и протеоме для определения целей лекарств и оценки механизмов действия новых препаратов и терапевтических вакцин также выгодна.
Здесь мы описываем экспериментальные протоколы для подготовки биолюминесцентных M. bovis BCG lux inoculum и G. mellonella личинок для микобактериальной инфекции, а также определение как личинки, так и микобактерии выживаемости в ответ на инфекцию.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5ml reaction tube (Eppendorf)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20, 200 and 1000 &#181;l pipette and filtered tips</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well culture plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 ml pipettes and pipette boy</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 compartment Petri dish (94/15mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>637102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II saftey cabinet</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask with vented cap (250 ml)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS40183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (&#62;99.7%)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>208221.321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galleria mellonella (250 per pk)</td>
			<td>Livefood Direct UK</td>
			<td>W250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogeniser (FastPrep-24 5G )</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116005500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-240CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer (Autolumat LB 953)</td>
			<td>Berthold</td>
			<td>34622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing matrix (S, 2.0ml)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116925500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro syringe (25 &#181;l, 25 ga)</td>
			<td>SGE</td>
			<td>3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H11 agar</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>283810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 broth</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook ADC enrichment</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>212352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook OADC enrichment</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>212240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium bovis BCG lux</td>
			<td>Various</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-decyl aldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7384-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaking incubator</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 80 (Tween-80)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8074-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small box</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>dark vented or non-sealed box recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Short and narrow tipped/Blunt long tweezers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Winterm (V1.08)</td>
			<td>Berthold</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Program LB953.TTB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (94/15mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>633181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper (94mm)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cut to fit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of the invertebrate galleria mellonella as an infection model to study the mycobacterium tuberculosis complex

Туберкулез является ведущей глобальной причиной смертности от инфекционных заболеваний, и считается, что примерно четверть населения мира инфицирована туберкулезом микобактерий. Несмотря на десятилетия исследований, многие из механизмов успеха М. туберкулеза как патогенного организма еще предстоит изучить, и разработка более безопасных, более эффективных антимикобактериальных препаратов срочно необходимы для решения проблемы роста и распространение лекарственно-устойчивого туберкулеза. Тем не менее, прогрессирование исследований туберкулеза является узким местом традиционных моделей инфекции млекопитающих, которые являются дорогостоящими, трудоемкими и этически сложными. Ранее мы создали личинки насекомого Galleria mellonella (большая восковая моль) как новую, воспроизводимую, низкую стоимость, высокопроизводительную и этически приемлемую модель инфекции для членов туберкулезного комплекса М. Здесь мы описываем техническое обслуживание, подготовку и инфекцию G. mellonella с биолюминесцентным Mycobacterium bovis BCG lux. Используя эту модель инфекции, микобактериальная доза зависимой вирулентности можно наблюдать, и быстрое считывание in vivo микобактериальной нагрузки с использованием измерений биолюминесценции легко достижимо и воспроизводимо. Хотя существуют ограничения, такие как отсутствие полностью аннотированного генома для транскриптомического анализа, онтологический анализ против генетически похожих насекомых может быть проведен. Как низкая стоимость, быстрая и этически приемлемая модель для туберкулеза, G. mellonella может быть использован в качестве предварительного скрининга для определения эффективности и токсичности препарата, а также для определения сравнительной микобактериальной вирулентности до использования обычных млекопитающих Модели. Использование модели G. mellonella-mycobacteriaприведет к сокращению значительного числа животных, используемых в настоящее время в исследованиях туберкулеза.

Здесь мы представляем репрезентативные данные, которые могут быть получены с помощью G. mellonella - BCG lux инфекции модели и выделить преимущества G. mellonella как инфекционная модель для членов MTBC (Рисунок 1). Экспериментальные процедуры с ключевыми...

Watch this Scientific Journal Video about Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex at JoVE.com

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Использование беспозвоночных Galleria mellonella в качестве модели инфекции для изучения комплекса туберкулеза микобактерий

Galleria mellonella была недавно создана как воспроизводимая, дешевая и этически приемлемая модель инфекции для комплекса mycobacterium tuberculosis. Здесь мы описываем и демонстрируем шаги, предпринятые для создания успешной инфекции G. mellonella с биолюминесцентными Mycobacterium bovis BCG lux.

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...

Этот протокол описывает использование Galleria mellonella в качестве альтернативной модели инфекции для изучения туберкулеза, уменьшая количество моделей млекопитающих, используемых в исследованиях. По сравнению с обычными моделями млекопитающих, такими как мыши, Galleria mellonella является более дешевой, этически приемлемой и более доступной моделью для изучения туберкулеза. Дальнейшая оптимизация этой модели позволит скрининг эффективности и токсичности препарата-кандидата и будет способствовать разработке срочно необходимых новых терапевтических средств от туберкулеза.Galleria mellonella обладает сложной врожденной иммунной системой, сравнимой с системой млекопитающих. Изучение взаимодействия хозяина и патогена может еще больше выявить роль врожденного иммунитета при туберкулезе. Использование Galleria mellonella в качестве инфекционной модели не ограничивается туберкулезом и широко используется для других бактериальных и грибковых патогенов в течение последнего десятилетия.Для начала разморозите замороженный 1,2-миллилитровый глицерол запас Mycobacterium bovis BCG lux, штамм вакцины в Монреале, преобразованный с шаттл плазмидным pSMT1, несущим гены luxAB. В помеченной 250-миллилитровой колбе Erlenmeyer прививают 15 миллилитров бульона Middlebrook 7H9 с разморощенной 1,2-миллилитровой алицита BCG lux. Поместите колбу в герметичный контейнер для биобезопасности и инкубировать при 37 градусах цельсия в орбитальном инкубаторе шейкера при 220 об/мин в течение 72 часов.После инкубации приготовьте 1:10 разбавления культуры в фосфатно-буферном солевом растворе в люминометровых трубках, вихре и загрузите люминометрические трубки в люминометр. Загрузите субстрат 1%n-дециляльдегид в абсолютный этанол в платформу инжектора и измерить биолюминесценцию. Преобразование биолюминесценции в колониообразующие единицы для проверки роста культуры люкс BCG.Передача культуры в центрифугу трубки и центрифуги на 2, 175 раз г в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы гранулировать клетки. Откажитесь от супернатанта в соответствующее дезинфицирующее средство с известной микобактериоцидной активностью. Вымойте клеточные гранулы дважды в 50 миллилитров PBS-T путем центрифугирования в 2, 175 раз г в течение 10 минут, чтобы предотвратить бактериальное слипание.После окончательной стирки, декант отходов supernatant и повторно mycobacterial ячейки гранулы в требуемом объеме PBS-T разбавить микобактериальной подвески до желаемой плотности клеток. Затем приготовьте 10-кратное серийное разбавление инокулума в 24-х пластинах с помощью PBS-T. Плита из 10 микролитров каждого разбавления на Middlebrook 7H11 агар пластин в дублировать перечислить инокулума CFU рассчитывает.Поддерживайте приобретенные личинки instar в темноте при 18 градусах по Цельсию по прибытии и используйте в течение одной недели после покупки. Определите и выберите здоровых личинок для экспериментов на основе равномерного цвета крема, соответствующего размера и веса, высокой подвижности, и обладающих способностью исправить себя при включении. Используя пинцет тупого конца, тщательно подсчитайте здоровых личинок в чашку Петри выстроились с слоем фильтровальной бумаги и хранить при комнатной температуре в темноте до использования.Подготовьте платформу впрыска, приклеив круглую фильтровальную бумагу диаметром 94 миллиметра к плоской, поднятой поверхности. Аспирировать три тома 70% этанола в 25-микролитер микросирол для стерилизации, отбрасывания и дальнейшего полоскания с тремя томами стерильных PBS-T. Затем, resuspend подготовленный BCG люкс inoculum и аспирировать 10 микролитров в стерилизованной микросырья.Используйте отдельный шприц для аспирации PBS-T для отрицательного контроля. После 10 инъекций, повторно использовать BCG люкс inoculum для обеспечения равномерной подвески клеток. Используйте пинцет, чтобы забрать одну личинку и поместить на платформу инъекций.На платформе переверните личинку на спину и обездвиживайте, закрепив голову и хвост пинцетом. Найдите последний левый пролег, отсчитывание от головы личинки и тщательно вставьте кончик иглы глубиной от пяти до шести миллиметров под углом от 10 до 20 градусов к горизонтальной плоскости. Ввимить инокулум из шприца.После каждой инфекции перенесите зараженную личинку в чашку Петри, облицованную слоем фильтровальной бумаги. Одна 94-миллиметровая чашка Петри может вместить до 30 личинок. Храните чашку Петри в вентилируемой темной коробке внутри инкубатора при 37 градусах Цельсия с 5%углекислым газом.Следите за выживаемость личинок каждые 24 часа. Личинки считаются мертвыми, когда они не могут двигаться в ответ на прикосновения. Завехать выживаемость и оценить статистическую значимость с помощью теста Мантел-Кокс.Каждые 24 часа, случайным образом выбрать пять инфицированных личинок и использовать ватный тампон, пропитанный 70% этанола мягко стерилизовать личиночинок поверхностей. Поместите личинки по отдельности в двухми миллилитровые лизайные матричные трубки, содержащие 800 микролитров стерильных PBS. Затем используйте гомогенизатор для гомогенизации личинок в течение 60 секунд при шести метрах в секунду.Центрифуга лисинг трубки на 3, 500 раз g в течение пяти секунд, чтобы удалить гомогенат из крышки и тщательно декант гомогената в пять стерильных люминометр трубки индивидуально. Зарезервировать 100 микролитров гомогената в стерильной 1,5-миллилитровой реакционной трубке. Восстановите оставшийся гомогенат путем мытья лизных матричных трубок одним миллилитром PBS-T и пипеткой в соответствующие люминометрические трубки.Вихрь люминометра труб и измерения биолюминесценции гомогенатов на люминометре. Затем приготовьте 10-кратное серийное разбавление зарезервированных 100 микролитров гомогената в 24-колодец культурных пластин с помощью PBS-T. Pipette 10 микролитров разбавления на каждой агарной пластине Middlebrook 7H11 и использовать стерильный пластины распределитель для распространения.Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение двух недель. После этого подсчитывайте колониообразующие единицы. Определите RLU к CFU отношение BCG lux следуя за инфекцией in vivo.В этом эксперименте, BCG люкс доза зависит вирулентность наблюдалась в личинках G.mellonella в течение 96-часового инкубационный период. Смертельная доза, необходимая для 50%ларвал смертности было установлено, что один раз 10 к власти семь CFU. Контрольные группы, вводимые с 10-микролитерной дозой PBS-T или те, которые просто кололи, имитируя травмы иглы, не повлияли на здоровье личинок и не привели к увеличению смертности.Для личинок, инфицированных два раза 10 к власти семь CFU дозы BCG люкс, меланизация личинок спинной линии наблюдалось от 48 часов после инфекции и системной меланизации наблюдалось от 96 часов после инфекции. Инфекция с одним раз 10 к власти семь CFU дозы BCG люкс привело к первоначальному снижению биолюминесценции в течение первых 72 часов после инфекции. Однако, после 72 часов после заражения, биолюминесценция BCG люкс начал плато, что свидетельствует о создании стойких инфекции.В этой конкретной инфекционной системе коэффициент in vivo RLU и CFU колебался от 2:1 до 5:1 при среднем 4:1 в течение 168-часового курса. Во время инъекции не забудьте обезопасить личинки так, чтобы свести к минимуму риск чрезмерного протенетирования. Случайный прокол кишечника может привести к увеличению смертности.Проводя гистопатологический анализ, можно визуализировать введение микобактерий с клетками-хозяинами. Дальнейший транскриптомный анализ может выявить взаимодействие на геномном уровне. Использование этой инфекционной модели может позволить быстрое тестирование новых кандидатов наркотиков на ранней стадии разработки, значительно сократив количество животных, используемых в скрининге наркотиков.Эта модель инфекции требует использования шприца, который может быть связан с травмой иглы палкой. Мы рекомендуем использовать нашу технику инъекций, чтобы свести к минимуму такой риск.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Представляем напряжения сдвига в изучении бактериальной адгезии

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Рост Микобактерий туберкулеза Биопленки

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

Насекомые<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Как мощная модель инфекции по расследованию бактериального патогенеза

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Экспериментальная модель для изучения Туберкулез-малярией Коинфекция на естественной передачи Микобактерии туберкулеза И Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Использование<em&gt; Галерея MELLONELLA</em&gt; В качестве модельного организма по изучению<em&gt; Легионелл</em&gt; Инфекция

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Демонстрация с множественной лекарственной устойчивостью<em&gt; Микобактерии туберкулеза</em&gt; Усиление микрочипов

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Создание и Оптимизация Верховного установки пропускной изучать<em&gt; Эпидермальный стафилококк</em&gt; И<em&gt; Mycobacterium Marinum</em&gt; Инфекция в качестве модели для Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

3D-человека легочной ткани Модель функциональных исследований по<em&gt; Микобактерии туберкулеза</em&gt; Инфекция

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Анализ 18FDG ПЭТ/КТ изображений как инструмент для обучения микобактерии инфекции и лечение в Non-human приматов

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Микобактерии изображений в мышах с флуоресценцией фермента репортер

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...