Name: use of the invertebrate galleria mellonella as an infection model to study the mycobacterium tuberculosis complex
Uploaded: 2019-06-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex at JoVE.com

Este proyecto fue apoyado por subvenciones del Consejo de Investigación en Biotecnología y Ciencias Biológicas (BBSRC), otorgados a PRL e YL (BB/P001262/1), y el Centro Nacional para la Sustitución, Refinamiento y Reducción de Animales en Investigación (NC3Rs) otorgados a PRL, SMN, BDR e YL (NC/R001596/1).

NOTA: Todo el trabajo descrito a continuación debe llevarse a cabo en un laboratorio CL2 dentro de un gabinete de seguridad microbiológico (MSC) de clase 2 siguiendo las pautas locales de salud y seguridad.
1. Preparación de M. bovis BCG lux para la infección
<ol><li>Descongelar un glicerol congelado de 1,2 ml (15%) Stock de M. bovis BCG lux, la cepa vacunal Montreal transformada con el plásmido lanzadera pSMT1 que lleva los genes luxAB de <e...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Global tuberculosis report 2018. , (2018).</li><li>Colditz, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+BCG+Vaccine+in+the+prevention+of+tuberculosis:+meta-analysis+of+the+published+literature.">Efficacy of BCG Vaccine in the prevention of tuberculosis: meta-analysis of the published literature.</a> Journal of the American Medical Association. 271 (9), 698-702 (1994).</li><li>Meijer, A. H., Spaink, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions+made+transparent+with+the+zebrafish+model.">Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model.</a> Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).</li><li>Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+tuberculosis+in+translational+and+precision+medicine.">Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 717 (2017).</li><li>Gumbo, T., Lenaerts, A. J., Hanna, D., Romero, K., Nuermberger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclinical+models+for+antituberculosis+drug+development:+a+landscape+analysis.">Nonclinical models for antituberculosis drug development: a landscape analysis.</a> Journal of Infectious Diseases. 211 (Suppl 3), S83-S95 (2015).</li><li>Williams, A., Orme, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+tuberculosis:+an+overview.">Animal models of tuberculosis: an overview.</a> Microbiology Spectrum. 4 (4), (2016).</li><li>Myllym&#228;ki, H., Niskanen, M., Oksanen, K. E., R&#228;met, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+in+tuberculosis+research+-+where+is+the+beef?.">Animal models in tuberculosis research - where is the beef?.</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (8), 871-883 (2015).</li><li>Flynn, J. L., Gideon, H. P., Mattila, J. T., Lin, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+studies+in+non-human+primate+models+of+tuberculosis.">Immunology studies in non-human primate models of tuberculosis.</a> Immunological Reviews. 264 (1), 60-73 (2015).</li><li>Cook, S. M., McArthur, J. 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S., Proft, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galleria+mellonella+infection+models+for+the+study+of+bacterial+diseases+and+for+antimicrobial+drug+testing.">Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing.</a> Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).</li><li>Wojda, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+of+the+greater+wax+moth+Galleria+mellonella.">Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella.</a> Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).</li><li>Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+structural+and+functional+similarities+of+insect+hemocytes+and+mammalian+phagocytes.">An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes.</a> Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).</li><li>Arteaga Blanco, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+cellular+immune+response+of+Galleria+mellonella+to+Actinobacillus+pleuropneumoniae.">Differential cellular immune response of Galleria mellonella to Actinobacillus pleuropneumoniae.</a> Cell and Tissue Research. 370 (1), 153-168 (2017).</li><li>L&#243;pez Hern&#225;ndez, Y., Yero, D., Pinos-Rodr&#237;guez, J. M., Gibert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animals+devoid+of+pulmonary+system+as+infection+models+in+the+study+of+lung+bacterial+pathogens.">Animals devoid of pulmonary system as infection models in the study of lung bacterial pathogens.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 38 (2015).</li><li>Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Insect+Galleria+mellonella+as+a+powerful+infection+model+to+investigate+bacterial+pathogenesis.">The Insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galleria+mellonella+-+a+novel+infection+model+for+the+Mycobacterium+tuberculosis+complex.">Galleria mellonella - a novel infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex.</a> Virulence. 9 (1), 1126-1137 (2018).</li><li>Meir, M., Grosfeld, T., Barkan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+validation+of+Galleria+mellonella+as+a+novel+model+organism+to+study+Mycobacterium+abscessus+infection,+pathogenesis,+and+treatment.">Establishment and validation of Galleria mellonella as a novel model organism to study Mycobacterium abscessus infection, pathogenesis, and treatment.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (4), (2018).</li><li>Entwistle, F. M., Coote, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+greater+wax+moth+larvae,+Galleria+mellonella,+as+a+novel+in+vivo+model+for+non-tuberculosis+mycobacteria+infections+and+antibiotic+treatments.">Evaluation of greater wax moth larvae, Galleria mellonella, as a novel in vivo model for non-tuberculosis mycobacteria infections and antibiotic treatments.</a> Journal of Medical Microbiology. 67 (4), 585-597 (2018).</li><li>Snewin, V. A., Gares, M., #211;gaora, P., Hasan, Z., Brown, I. N., Young, D. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+moths+to+caterpillars:+Ideal+conditions+for+Galleria+mellonella+rearing+for+in+vivo+microbiological+studies.">From moths to caterpillars: Ideal conditions for Galleria mellonella rearing for in vivo microbiological studies.</a> Virulence. 9 (1), 383-389 (2018).</li><li>Kavanagh, K., Sheehan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+Galleria+mellonella+larvae+to+identify+novel+antimicrobial+agents+against+fungal+species+of+medical+interest.">The use of Galleria mellonella larvae to identify novel antimicrobial agents against fungal species of medical interest.</a> Journal of Fungi. 4 (3), 113 (2018).</li><li>Champion, O., Titball, R., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+G.+mellonella+larvae+to+provide+reliable+and+reproducible+results+in+the+study+of+fungal+pathogens.">Standardization of G. mellonella larvae to provide reliable and reproducible results in the study of fungal pathogens.</a> Journal of Fungi. 4 (3), 108 (2018).</li><li>Wojda, I., Taszlow, P., Jakubowicz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cold+shock+on+the+immune+response+of+the+greater+wax+moth+Galleria+mellonella+after+infection+with+entomopathogenic+bacteria+Bacillus+thuringiensis.">The effect of cold shock on the immune response of the greater wax moth Galleria mellonella after infection with entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis.</a> Journal of Maria Curie-Sklodowska University. 69 (2), 7-18 (2015).</li><li>Nascimento, I. P., Leite, L. C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+passaging+in+liquid+media+and+storage+on+Mycobacterium+bovis+-+BCG+growth+capacity+and+infectivity.">The effect of passaging in liquid media and storage on Mycobacterium bovis - BCG growth capacity and infectivity.</a> FEMS Microbiology Letters. 243 (1), 81-86 (2005).</li><li>De Groote, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+studies+evaluating+mouse+models+used+for+efficacy+testing+of+experimental+drugs+against+Mycobacterium+tuberculosis.">Comparative studies evaluating mouse models used for efficacy testing of experimental drugs against Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (3), 1237-1247 (2011).</li><li>Grosset, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+early+bactericidal+activity+in+murine+tuberculosis+provides+insights+into+the+activity+of+isoniazid+and+pyrazinamide.">Modeling early bactericidal activity in murine tuberculosis provides insights into the activity of isoniazid and pyrazinamide.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 109 (37), 15001-15005 (2012).</li><li>Vogel, H., Altincicek, B., Gl&#246;ckner, G., Vilcinskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+transcriptome+and+immune-gene+repertoire+of+the+lepidopteran+model+host+Galleria+mellonella.">A comprehensive transcriptome and immune-gene repertoire of the lepidopteran model host Galleria mellonella.</a> BMC Genomics. 12, 308 (2011).</li></ol>

Se ha establecido el uso de G. mellonella como modelo de infección para una serie de patógenos bacterianos y fúngicos para el estudio de la virulencia, la interacción huésped-patógeno, y como una pantalla para las nuevas terapias10,22. La siguiente discusión se basa en el procedimiento experimental para el uso de G. mellonella como modelo de infección para el MTBC.
La salud de las larvas ingenuas ante...

La tuberculosis (TB) es una amenaza importante para la salud pública mundial, con 9 millones de nuevos casos al año y 1,5 millones de muertes1. Además, se estima que una cuarta parte de la población mundial está infectada con el agente causante de la enfermedad, Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Entre la población infectada, entre el 5 y el 10 % desarrollará la enfermedad de tuberculosis activa a lo largo de su vida. Además, la aparición y propagación de Mtb resistente a múltiples fármacos (MDR) y ampliamente farmacológicos (XDR)representa una grave amenaza para el control de enfermedades, y 123 países informan al menos de un caso XDR 1. El tratamiento de la tuberculosis requiere un cóctel de al menos cuatro medicamentos antimicobacterianos, de los cuales se prescriben isoniazida y rifampicina por una duración mínima de seis meses; a menudo se asocia con efectos secundarios complejos y toxicidades. La protección contra la única vacuna autorizada contra la tuberculosis, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), es la variable 2. Una comprensión incompleta de la patogénesis de la tuberculosis dificulta significativamente el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas y de vacunación.
Durante décadas, los modelos de infección animal han sido vitales para que la investigación de la tuberculosis comprenda la patogénesis básica y la respuesta del huésped a la infección, y para evaluar nuevos agentes antimicobacterianos, inmunoterapéuticos y nuevos candidatos a vacunas3, 4. Sin embargo, la investigación utilizando modelos de infección animal de tuberculosis es notoriamente difícil ya que la patogénesis y la progresión de la infección por tuberculosis son complejas, y no hay un solo modelo animal que imite todo el espectro y las características importantes de la enfermedad5 ,6. Además, los experimentos con animales son costosos, consumen mucho tiempo para llevar a cabo y requieren una justificación ética completa. No obstante, se han descrito modelos de infección animal de tuberculosis en primates no humanos (por ejemplo, macacos), conejillos de indias, conejos, bovinos, cerdos, ratones y peces cebra, y cada uno tiene sus limitaciones3,4. El modelo murino es el modelo más utilizado debido al costo, disponibilidad de líneas endogámicas, reproducibilidad de la infección y abundancia de reactivos inmunológicos. Sin embargo, por lo general no forman granulomas asociados con áreas de hipoxia que son características de la infección por tuberculosis latente (LTBI)6. Los cerdos de Guinea son altamente susceptibles a la infección por Mtb, con patología y formación temprana de granuloma similares a los de los seres humanos, y se utilizan ampliamente en las pruebas de vacunas; sin embargo, la falta de reactivos inmunológicos dificulta su uso como infección modelo7. Los peces cebra son adecuados para el cribado a gran escala en estudios preclínicos en etapas tempranas debido a su pequeño tamaño, reproducción rápida y herramientas genéticas avanzadas, pero son anatómica y fisiológicamente diferentes a los seres humanos y sólo son susceptibles a Infección por Mycobacterium marinum 3. Los modelos animales que se asemejan más a la infección humana por Mtb son primates no humanos (por ejemplo, el macaco), pero son caros y tienen consideraciones éticas y prácticas significativas que limitan considerablemente su uso8.
La larva de insectos de la polilla de cera mayor o polilla de panal,Galleria mellonella, se han vuelto cada vez más populares como modelo de infección para una variedad de patógenos bacterianos y fúngicos9,y como una pantalla para nuevos candidatos a fármacos antimicrobianos 10. G. mellonella es un modelo invertebrado exitoso debido a su sofisticado sistema inmunológico innato (compuesto por defensas celulares y humorales) que comparte un alto grado de similitud estructural y funcional con el de los vertebrados11 . Esto incluye mecanismos inmunes como la fagocitosis de patógenos por hemocitos (funcionalmente similar a los macrófagos y neutrófilos de mamíferos)12,13, la producción y circulación de péptidos antimicrobianos (AMP) y proteínas similares a complementos dentro de la hemolinfa (análogos a la sangre de mamíferos) de G. mellonella11. Otras ventajas9,14,15 de G. mellonella larvas como modelo incluyen 1) su gran tamaño (20-30 mm) que permite una fácil manipulación e infección, así como la recolección de tejido y hemolinfa para análisis, 2) fácil mantenimiento a 37 oC, compatible para el estudio de patógenos humanos, 3) infección precisa por inyección sin necesidad de anestesia, 4) la eficacia de los agentes antimicrobianos puede evaluarse utilizando menos fármacos para evaluación, 5) falta de las limitaciones éticas en comparación con el uso de mamíferos, 6) tamaños de grupo grande se pueden utilizar en comparación con los modelos animales que permiten una mayor reproducibilidad, y 7) tiempos más cortos para experimentos de infección se requieren.
En un estudio reciente, demostramos que G. mellonella puede ser utilizado como un modelo de infección novedoso para estudiar la patogénesis de la infección por Bioluminiscente M. bovis BCG lux, una versión modificada genéticamente de la cepa vacunal y miembro del complejo Mtb (MTBC)16. Mientras que G. mellonella se ha utilizado previamente como un modelo de infección para micobacterias no tuberculosas (NTM), principalmente M. marinum y Mycobacterium absceso17,18, los estudios con MTBC se limitan a 16. Las cepas micobacterianas bioluminiscentes no patógenas, que se pueden utilizar a nivel de contención (CL) 2 como sustituto de Mtb, ofrecen las ventajas de seguridad y practicidad sobre las micobacterias patógenas. Después de la infección por BCG lux, las larvas comienzan a desarrollar estructuras tempranas similares al granuloma, lo que podría proporcionar información valiosa sobre el papel de la inmunidad innata en el establecimiento de la infección por tuberculosis16. Además, este sencillo modelo de infección por invertebrados tiene el potencial de proporcionar una evaluación rápida, de bajo costo y confiable de la patogénesis de la tuberculosis que incorpora desafío controlado y múltiples réplicas de reproducibilidad. Además, el modelo tiene el potencial de ser utilizado para examinar nuevos candidatos a fármacos antituberculosos y vacunas en desarrollo temprano, reduciendo el número total de animales en experimentación. La capacidad de medir los cambios en la estructura del huésped y del patógeno, el transcriptoma y el proteoma para determinar las dianas farmacológicas y evaluar los mecanismos de acción de nuevos fármacos y vacunas terapéuticas también son ventajosas.
Aquí describimos los protocolos experimentales para la preparación de un bioluminiscente M. bovis BCG lux inoculum y larvas de G. mellonella para la infección micobacteriana, así como la determinación de larvas y micobacterias supervivencia en respuesta a la infección.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5ml reaction tube (Eppendorf)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20, 200 and 1000 &#181;l pipette and filtered tips</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well culture plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 ml pipettes and pipette boy</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 compartment Petri dish (94/15mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>637102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II saftey cabinet</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask with vented cap (250 ml)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS40183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (&#62;99.7%)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>208221.321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galleria mellonella (250 per pk)</td>
			<td>Livefood Direct UK</td>
			<td>W250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogeniser (FastPrep-24 5G )</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116005500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-240CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer (Autolumat LB 953)</td>
			<td>Berthold</td>
			<td>34622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing matrix (S, 2.0ml)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116925500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro syringe (25 &#181;l, 25 ga)</td>
			<td>SGE</td>
			<td>3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H11 agar</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>283810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 broth</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook ADC enrichment</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>212352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook OADC enrichment</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>212240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium bovis BCG lux</td>
			<td>Various</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-decyl aldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7384-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaking incubator</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 80 (Tween-80)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8074-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small box</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>dark vented or non-sealed box recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Short and narrow tipped/Blunt long tweezers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Winterm (V1.08)</td>
			<td>Berthold</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Program LB953.TTB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (94/15mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>633181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper (94mm)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cut to fit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of the invertebrate galleria mellonella as an infection model to study the mycobacterium tuberculosis complex

La tuberculosis es la principal causa mundial de mortalidad por enfermedades infecciosas y se cree que aproximadamente una cuarta parte de la población mundial está infectada con Mycobacteriumtuberculosis. A pesar de décadas de investigación, muchos de los mecanismos detrás del éxito de M. tuberculosis como organismo patógeno aún están por investigar, y el desarrollo de medicamentos antimicobacterianos más seguros y eficaces son urgentemente necesarios para hacer frente al aumento y propagación de la tuberculosis farmacorresistente. Sin embargo, la progresión de la investigación de la tuberculosis se debe al cuello de botella de los modelos tradicionales de infección de mamíferos que son costosos, lentos y éticamente desafiantes. Anteriormente establecimos las larvas del insecto Galleria mellonella (mayor polilla de cera) como un modelo de infección novedoso, reproducible, de bajo costo, de alto rendimiento y éticamente aceptable para los miembros del complejo M. tuberculosis. Aquí describimos el mantenimiento, preparación e infección de G. mellonella con Bioluminiscentmycobacterium bovis BCG lux. Usando este modelo de infección, se puede observar virulencia dependiente de la dosis micobacteriana, y una lectura rápida de la carga micobacteriana in vivo utilizando mediciones de bioluminiscencia es fácilmente alcanzable y reproducible. Aunque existen limitaciones, como la falta de un genoma totalmente anotado para el análisis transcriptomático, se puede realizar análisis ontológicos contra insectos genéticamente similares. Como modelo de bajo costo, rápido y éticamente aceptable para la tuberculosis, G. mellonella se puede utilizar como pre-pantalla para determinar la eficacia y toxicidad de los medicamentos, y para determinar la virulencia micobacteriana comparativa antes del uso de mamíferos convencionales Modelos. El uso del modelo G. mellonella-mycobacterias conducirá a una reducción del número sustancial de animales utilizados actualmente en la investigación de la tuberculosis.

Aquí presentamos datos representativos que se pueden obtener utilizando el modelo de infección G. mellonella — BCG lux y destacamos los beneficios de G. mellonella como modelo de infección para los miembros del MTBC (Figura1). Los procedimientos experimentales con puntos técnicos clave se describen en la Figura2.
<img alt="Figure 1" clas...

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Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Uso de la Invertebrada Galleria mellonella como Modelo de Infección para Estudiar el Complejo Mycobacterium tuberculosis

Galleria mellonella se estableció recientemente como un modelo de infección reproducible, barato y éticamente aceptable para el complejo Mycobacterium tuberculosis. Aquí describimos y demostramos los pasos dados para establecer una infección exitosa de G. mellonella con Bioluminiscente Mycobacterium bovis BCG lux.

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...

Este protocolo describe el uso de Galleria mellonella como un modelo de infección alternativa para estudiar la tuberculosis, reduciendo el número de modelos de mamíferos utilizados en la investigación. En comparación con los modelos de mamíferos convencionales como los ratones, Galleria mellonella es un modelo más barato, éticamente aceptable y más accesible para estudiar la tuberculosis. Una mayor optimización de este modelo permitirá el cribado de la eficacia y toxicidad de los fármacos antimicobacterianos candidatos y contribuirá al desarrollo de nuevas terapias para la tuberculosis que se necesitan con urgencia.Galleria mellonella posee un complejo sistema inmune innato comparable al de los mamíferos. El estudio de la interacción huésped-patógeno puede revelar aún más el papel de la inmunidad innata en la tuberculosis. El uso de Galleria mellonella como modelo de infección no se limita a la tuberculosis y ha sido ampliamente utilizado para otros patógenos bacterianos y fúngicos en la última década.Para empezar, descongelar una reserva de glicerol congelado de 1,2 mililitros de Mycobacterium bovis BCG lux, la cepa de la vacuna de Montreal transformada con el plásmido lanzadera pSMT1 que transporta los genes luxAB. En un matraz Erlenmeyer de 250 mililitros etiquetado, inocular 15 mililitros de caldo Middlebrook 7H9 con una aliquot descongelada de 1,2 mililitros de BCG lux. Coloque el matraz en un recipiente sellado de bioseguridad e incubar a 37 grados centígrados en una incubadora de agitador orbital a 220 rpm durante 72 horas.Después de la incubación, preparar 1:10 diluciones del cultivo en solución salina tamponada con fosfato en tubos luminómetros, vórtice, y cargar los tubos del luminómetro en el luminómetro. Cargue el sustrato 1%n-decyl aldehído en etanol absoluto en la plataforma del inyector y mida la bioluminiscencia. Convierta la bioluminiscencia en unidades formadoras de colonias para comprobar el crecimiento del cultivo de lux BCG.Transfiera el cultivo a un tubo centrífugo y centrífuga a 2, 175 veces g durante 10 minutos a temperatura ambiente para peletizar las células. Deseche el sobrenadante en un desinfectante adecuado con actividad micobactericida conocida. Lavar el pellet celular dos veces en 50 mililitros de PBS-T centrifugando a 2, 175 veces g durante 10 minutos para evitar la acumulación bacteriana.Después del lavado final, decantar los residuos sobrenadantes y resuspender el pellet de célula micobacteriana en el volumen requerido de PBS-T para diluir la suspensión micobacteriana a la densidad celular deseada. A continuación, prepare diluciones seriales de 10 veces del inóculo en placas de 24 pocillos utilizando PBS-T. Placa 10 microlitros de cada dilución en placas de agar Middlebrook 7H11 en duplicado para enumerar los recuentos de CFU inóculo.Mantenga las larvas instar compradas en la oscuridad a 18 grados centígrados a su llegada y utilícense dentro de una semana de la compra. Identificar y seleccionar larvas sanas para la experimentación basadas en el color uniforme de la crema, tamaño y peso apropiados, alta motilidad, y poseer la capacidad de derechas cuando se entregan. Usando pinzas de extremo romo, cuente cuidadosamente las larvas sanas en un plato de Petri forrado con una capa de papel de filtro y guárdelo a temperatura ambiente en la oscuridad hasta su uso.Prepare la plataforma de inyección pegando un papel de filtro circular de 94 milímetros de diámetro en una superficie plana y elevada. Aspirar tres volúmenes de 70% de etanol en una microsinga de 25 microlitros para esterilizar, desechar y enjuagar aún más con tres volúmenes de PBS-T estéril. A continuación, resuspender el inóculo BCG lux preparado y aspirar 10 microlitros en la microsingación esterilizada.Utilice una jeringa separada para aspirar PBS-T para un control negativo. Después de 10 inyecciones, resuspender el inóculo de lux BCG para garantizar una suspensión celular uniforme. Use pinzas para recoger una larva y colocarla en la plataforma de inyección.En la plataforma, voltee la larva sobre su espalda e inmovilice asegurando la cabeza y la cola con las pinzas. Localice el último proleg izquierdo, contando hacia abajo desde la cabeza de la larva e inserte cuidadosamente la punta de la aguja de cinco a seis milímetros de profundidad en un ángulo de 10 a 20 grados hasta el plano horizontal. Inyecte el inóculo de la jeringa.Después de cada infección, transfiera la larva infectada a una placa de Petri forrada con una capa de papel de filtro. Un solo plato Petri de 94 milímetros puede acomodar hasta 30 larvas. Almacene el plato Petri en una caja oscura y ventilada dentro de una incubadora a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono.Monitorear la supervivencia de las larvas cada 24 horas. Las larvas se consideran muertas cuando no se mueven en respuesta al tacto. Registre la supervivencia y evalúe la significancia estadística con la prueba Mantel-Cox.Cada 24 horas, selecciona al azar cinco larvas infectadas y usa un hisopo de algodón empapado en 70% de etanol para esterilizar suavemente las superficies larvales. Coloque las larvas individualmente en tubos de matriz de dos mililitros que contengan 800 microlitros de PBS estéril. Luego, utilice un homogeneizador para homogeneizar las larvas durante 60 segundos a seis metros por segundo.Centrifugar los tubos de livalina a 3.500 veces g durante cinco segundos para eliminar el homogeneato de las tapas y decantar cuidadosamente el homogeneizar en cinco tubos de luminómetro estériles individualmente. Reserve 100 microlitros de homogeneizar en un tubo de reacción estéril de 1,5 mililitros. Recuperar cualquier homogeneizado restante lavando los tubos de matriz de lisamiento con un mililitro de PBS-T y pipeta en los tubos luminómetro correspondientes.Vórtice los tubos del luminómetro y medir la bioluminiscencia de los homogeneiza en un luminómetro. A continuación, prepare diluciones en serie de 10 veces de los 100 microlitros reservados de homogeneizar en placas de cultivo de 24 pocillos utilizando PBS-T. Pipetear 10 microlitros de la dilución en cada placa de agar Middlebrook 7H11 y utilizar un esparcidor de placa estéril para esparcir.Incubar a 37 grados centígrados durante dos semanas. Después de eso, cuenta las unidades formadoras de colonias. Determinar la relación entre RLU y CFU de BCG lux después de la infección in vivo.En este experimento, BCG lux virulencia dependiente de la dosis se observó en larvas de G.mellonella durante un período de incubación de 96 horas. Se determinó que la dosis letal necesaria para el 50% de la mortalidad larval era de una 10 veces a la potencia de siete UFC. Los grupos de control inyectados con una dosis de 10 microlitros de PBS-T o aquellos simplemente pinchados simulando lesiones con aguja no afectaron la salud larvaria ni condivan a un aumento de la mortalidad.Para las larvas infectadas con las dos veces 10 a la potencia de siete dosis de CFU de BCG lux, se observó melanización de la línea dorsal larval a partir de 48 horas después de la infección y se observó melanización sistémica a partir de 96 horas después de la infección. La infección con una 10 veces a la potencia de siete dosis de CFU de BCG lux dio lugar a una disminución inicial de la bioluminiscencia dentro de las primeras 72 horas después de la infección. Sin embargo, después de 72 horas después de la infección, la bioluminiscencia de BCG lux comenzó a meseta, lo que indica el establecimiento de una infección persistente.En este sistema de infección en particular, la relación in vivo de RLU y CFU osciló entre 2:1 y 5:1 con un promedio de 4:1 sobre el curso de tiempo de 168 horas. Durante la inyección, recuerde asegurar las larvas para minimizar el riesgo de sobrepenetración. La punción accidental del intestino podría conducir a un aumento de la mortalidad.Mediante la realización de análisis histopatológicos, se puede visualizar la introducción de micobacterias con las células huésped. Un análisis transcriptómico adicional podría revelar la interacción a nivel genómico. El uso de este modelo de infección puede permitir la prueba rápida de nuevos candidatos a medicamentos en una etapa temprana del desarrollo, reduciendo significativamente el número de animales utilizados en la detección de drogas.Este modelo de infección requiere el uso de una jeringa, que puede estar asociada con una lesión por pinchazo de aguja. Recomendamos el uso de nuestra técnica de inyección para minimizar dicho riesgo.

Research

JoVE Journal

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