Name: use of the invertebrate galleria mellonella as an infection model to study the mycobacterium tuberculosis complex
Uploaded: 2019-06-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex at JoVE.com

Bu proje Biyoteknoloji ve biyolojik Bilim Araştırma Konseyi (BBSRC), PRL ve YL (BB/P001262/1) ve Ulusal Merkezi değiştirme, arıtma ve araştırma hayvanların azaltma (NC3Rs) için verilen hibe tarafından desteklenmektedir PRL, SMN, BDR ve YL (NC/R001596/1).

Not: aşağıda açıklanan tüm çalışmalar, yerel sağlık ve güvenlik kurallarına uygun bir sınıf 2 Mikrobiyolojik Emniyet kabininde (MSC) CL2 bir laboratuvarda gerçekleştirilecektir.
1. enfeksiyon için M. Bovis BCG Lux hazırlanması
<ol><li>Dondurulmuş 1,2 mL gliserol (% 15) defrost M. Bovis BCG Luxhisse senedi, Montreal aşı gerinim Vibrio harveyi Lusiferaz enzim19kodlama luxab genler taşıyan mek...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Global tuberculosis report 2018. , (2018).</li><li>Colditz, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+BCG+Vaccine+in+the+prevention+of+tuberculosis:+meta-analysis+of+the+published+literature.">Efficacy of BCG Vaccine in the prevention of tuberculosis: meta-analysis of the published literature.</a> Journal of the American Medical Association. 271 (9), 698-702 (1994).</li><li>Meijer, A. H., Spaink, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions+made+transparent+with+the+zebrafish+model.">Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model.</a> Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).</li><li>Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+tuberculosis+in+translational+and+precision+medicine.">Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 717 (2017).</li><li>Gumbo, T., Lenaerts, A. J., Hanna, D., Romero, K., Nuermberger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclinical+models+for+antituberculosis+drug+development:+a+landscape+analysis.">Nonclinical models for antituberculosis drug development: a landscape analysis.</a> Journal of Infectious Diseases. 211 (Suppl 3), S83-S95 (2015).</li><li>Williams, A., Orme, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+tuberculosis:+an+overview.">Animal models of tuberculosis: an overview.</a> Microbiology Spectrum. 4 (4), (2016).</li><li>Myllym&#228;ki, H., Niskanen, M., Oksanen, K. E., R&#228;met, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+in+tuberculosis+research+-+where+is+the+beef?.">Animal models in tuberculosis research - where is the beef?.</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (8), 871-883 (2015).</li><li>Flynn, J. L., Gideon, H. P., Mattila, J. T., Lin, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+studies+in+non-human+primate+models+of+tuberculosis.">Immunology studies in non-human primate models of tuberculosis.</a> Immunological Reviews. 264 (1), 60-73 (2015).</li><li>Cook, S. M., McArthur, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+Galleria+mellonella+as+a+model+host+for+human+pathogens.">Developing Galleria mellonella as a model host for human pathogens.</a> Virulence. 4 (5), 350-353 (2013).</li><li>Tsai, C. J. -. Y., Loh, J. M. S., Proft, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galleria+mellonella+infection+models+for+the+study+of+bacterial+diseases+and+for+antimicrobial+drug+testing.">Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing.</a> Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).</li><li>Wojda, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+of+the+greater+wax+moth+Galleria+mellonella.">Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella.</a> Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).</li><li>Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+structural+and+functional+similarities+of+insect+hemocytes+and+mammalian+phagocytes.">An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes.</a> Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).</li><li>Arteaga Blanco, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+cellular+immune+response+of+Galleria+mellonella+to+Actinobacillus+pleuropneumoniae.">Differential cellular immune response of Galleria mellonella to Actinobacillus pleuropneumoniae.</a> Cell and Tissue Research. 370 (1), 153-168 (2017).</li><li>L&#243;pez Hern&#225;ndez, Y., Yero, D., Pinos-Rodr&#237;guez, J. M., Gibert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animals+devoid+of+pulmonary+system+as+infection+models+in+the+study+of+lung+bacterial+pathogens.">Animals devoid of pulmonary system as infection models in the study of lung bacterial pathogens.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 38 (2015).</li><li>Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Insect+Galleria+mellonella+as+a+powerful+infection+model+to+investigate+bacterial+pathogenesis.">The Insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galleria+mellonella+-+a+novel+infection+model+for+the+Mycobacterium+tuberculosis+complex.">Galleria mellonella - a novel infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex.</a> Virulence. 9 (1), 1126-1137 (2018).</li><li>Meir, M., Grosfeld, T., Barkan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+validation+of+Galleria+mellonella+as+a+novel+model+organism+to+study+Mycobacterium+abscessus+infection,+pathogenesis,+and+treatment.">Establishment and validation of Galleria mellonella as a novel model organism to study Mycobacterium abscessus infection, pathogenesis, and treatment.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (4), (2018).</li><li>Entwistle, F. M., Coote, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+greater+wax+moth+larvae,+Galleria+mellonella,+as+a+novel+in+vivo+model+for+non-tuberculosis+mycobacteria+infections+and+antibiotic+treatments.">Evaluation of greater wax moth larvae, Galleria mellonella, as a novel in vivo model for non-tuberculosis mycobacteria infections and antibiotic treatments.</a> Journal of Medical Microbiology. 67 (4), 585-597 (2018).</li><li>Snewin, V. A., Gares, M., #211;gaora, P., Hasan, Z., Brown, I. N., Young, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+immunity+to+mycobacterial+infection+with+luciferase+reporter+constructs.">Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs.</a> Infection and Immunity. 67 (9), 4586-4593 (1999).</li><li>Newton, S., Martineau, A., Kampmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+whole+blood+assay+to+measure+viability+of+mycobacteria,+using+reporter-gene+tagged+BCG+or+M.Tb+(BCG+lux/M.Tb+lux).">A functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux).</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Jorj&#227;o, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+moths+to+caterpillars:+Ideal+conditions+for+Galleria+mellonella+rearing+for+in+vivo+microbiological+studies.">From moths to caterpillars: Ideal conditions for Galleria mellonella rearing for in vivo microbiological studies.</a> Virulence. 9 (1), 383-389 (2018).</li><li>Kavanagh, K., Sheehan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+Galleria+mellonella+larvae+to+identify+novel+antimicrobial+agents+against+fungal+species+of+medical+interest.">The use of Galleria mellonella larvae to identify novel antimicrobial agents against fungal species of medical interest.</a> Journal of Fungi. 4 (3), 113 (2018).</li><li>Champion, O., Titball, R., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+G.+mellonella+larvae+to+provide+reliable+and+reproducible+results+in+the+study+of+fungal+pathogens.">Standardization of G. mellonella larvae to provide reliable and reproducible results in the study of fungal pathogens.</a> Journal of Fungi. 4 (3), 108 (2018).</li><li>Wojda, I., Taszlow, P., Jakubowicz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cold+shock+on+the+immune+response+of+the+greater+wax+moth+Galleria+mellonella+after+infection+with+entomopathogenic+bacteria+Bacillus+thuringiensis.">The effect of cold shock on the immune response of the greater wax moth Galleria mellonella after infection with entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis.</a> Journal of Maria Curie-Sklodowska University. 69 (2), 7-18 (2015).</li><li>Nascimento, I. P., Leite, L. C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+passaging+in+liquid+media+and+storage+on+Mycobacterium+bovis+-+BCG+growth+capacity+and+infectivity.">The effect of passaging in liquid media and storage on Mycobacterium bovis - BCG growth capacity and infectivity.</a> FEMS Microbiology Letters. 243 (1), 81-86 (2005).</li><li>De Groote, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+studies+evaluating+mouse+models+used+for+efficacy+testing+of+experimental+drugs+against+Mycobacterium+tuberculosis.">Comparative studies evaluating mouse models used for efficacy testing of experimental drugs against Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (3), 1237-1247 (2011).</li><li>Grosset, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+early+bactericidal+activity+in+murine+tuberculosis+provides+insights+into+the+activity+of+isoniazid+and+pyrazinamide.">Modeling early bactericidal activity in murine tuberculosis provides insights into the activity of isoniazid and pyrazinamide.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 109 (37), 15001-15005 (2012).</li><li>Vogel, H., Altincicek, B., Gl&#246;ckner, G., Vilcinskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+transcriptome+and+immune-gene+repertoire+of+the+lepidopteran+model+host+Galleria+mellonella.">A comprehensive transcriptome and immune-gene repertoire of the lepidopteran model host Galleria mellonella.</a> BMC Genomics. 12, 308 (2011).</li></ol>

G. mellonella 'nın bir enfeksiyon modeli olarak kullanımı, virulence, ana bilgisayar patojen etkileşimi ve yeni terapi10,22için bir ekran olarak bir dizi bakteriyel ve mantar patojenler için kurulmuştur. Aşağıdaki tartışma MTBC için bir enfeksiyon modeli olarak G. mellonella kullanımı için deneysel prosedür dayanmaktadır.
Deneyden önce saf larvaları sağlık, deney sonucu üzerinde önemli...

Tüberküloz (TB) yıl başına 9.000.000 yeni vaka ve 1.500.000 ölüm1ile küresel kamu sağlığı için önemli bir tehdittir. Buna ek olarak, dünya nüfusunun dörtte birinin hastalığın etken maddesi, Mycobacterium tüberküloz (MTB) ile enfekte olduğu tahmin edilmektedir. Virüslü nüfus arasında, 5 − 10% ömrü boyunca aktif TB hastalığı gelişecektir. Ayrıca, çok ilaç dirençli (MDR) ve kapsamlı-ilaç (XDR) dirençli MTB ortaya çıkması ve yayılması, 123 ülkeleri en az BIR XDR vaka1raporlama ile hastalık kontrolü için ciddi bir tehdit oluşturmaktadır. TB tedavisi, en az dört Anti-Mikobakteriyel ilaçların bir kokteyli gerektirir, hangi izoazid ve rifampisin altı ay minimum süre için reçete edilir; tedavi genellikle karmaşık yan etkileri ve toksisite ile ilişkilidir. TB karşı tek lisanslı aşı koruma, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), değişken2. Tüberküloz patogenezinin tamamlanmamış bir anlayışı, yeni terapötik ve aşılama stratejilerinin gelişmesini önemli ölçüde engelliyor.
Onlarca yıl boyunca hayvan enfeksiyonu modelleri tüberküloz araştırmalarında enfeksiyona temel patogenezi ve ev sahibi tepkisini anlamaları ve yeni anti-Mikobakteriyel ajanlar, immüno-terapi ve aşı adaylarının3' ü değerlendirmek için hayati önem taşıyor. 4. ancak, TB enfeksiyonunun patogenezi ve ilerlemesi karmaşıktır ve hastalığın tam spektrumunu ve önemli özelliklerini taklit eden tek bir hayvan modeli olmadığı için, tüberkülozdaki hayvan enfeksiyonu modellerini kullanarak araştırma oldukça zordur5 ,6. Ayrıca, hayvan deneyleri pahalı, zaman alıcı taahhüt ve tam etik gerekçe gerektirir. Yine de, TB hayvan enfeksiyonu modelleri (örneğin, Macaques), kobay, tavşan, sığır, domuz, fareler ve zebrafish insan olmayan primatlar, her biri kendi sınırlamaları3,4sahip açıklanmıştır. Duvar modeli, maliyet, doğuştan hatları, enfeksiyon ve immünolojik reaktifler bolluğu tekrarlanabilirlik mevcudiyeti nedeniyle en sık kullanılan modeldir. Ancak, genellikle gizli Tüberküloz enfeksiyonu (LTBI)6karakteristik olan hipoksi alanları ile ilişkili granülomlar oluşturmaz. Gine domuzları MTB enfeksiyonuna son derece hassastır, patolojiler ve insanlarda benzer erken Granülom oluşumu ile, ve aşı testinde yaygın olarak kullanılır; henüz immünolojik reaktiflerin eksikliği bir enfeksiyon modeli olarak kullanımını engelliyor7. Zebrafish küçük boyutu, hızlı üreme ve gelişmiş genetik araçlar nedeniyle erken evre preklinik çalışmalarda büyük ölçekli tarama için uygundur, ancak anatomik ve fizyolojik olarak insanlara farklı ve sadece duyarlı Mycobacterium Marinum enfeksiyonu3. İnsan MTB enfeksiyonu en yakından benzeyen hayvan modelleri insan olmayan primatlar (örn., macaque), ama pahalı ve önemli ölçüde kullanımı sınırlar ciddi etik ve pratik hususlar var8.
Büyük balmumu güvesi veya petek güve böcek larva,Galleria mellonella, bakteriyel ve mantar patojenler çeşitli için bir enfeksiyon modeli olarak giderek daha popüler hale gelmiştir9, ve yeni antimikrobiyal uyuşturucu adayları için bir ekran olarak 10. G. mellonella onun sofistike doğuştan gelen bağışıklık sistemi nedeniyle başarılı bir omurgasız model (hücresel ve humoral savunma oluşur) bu vertebratlar için yapısal ve işlevsel benzerlik yüksek ölçüde hisse11 . Bu hemanositler tarafından patojenlerin phagositoz gibi bağışıklık mekanizmaları içerir (işlevsel olarak memeliler makrophaj ve nötrofiller benzer)12,13, anti-mikrobiyal peptidler üretim ve dolaşım (amper) ve G. mellonella11' in hemolymph içinde (mammalin kanına benzer) tamamlayıcı benzeri proteinler. Diğer avantajları9,14, G. mellonella larvaları bir model olarak15 dahil) onların büyük boyutu (20 − 30 mm) kolay manipülasyon ve enfeksiyon sağlar, yanı sıra doku toplama ve analizler için hemolymph, 2) 37 °C ' de kolay bakım, insan patojenleri okumak için uyumlu, 3) anesteziye gerek duymadan enjeksiyon ile hassas enfeksiyon, 4) antimikrobiyal ajanların etkinliği, değerlendirme için daha az ilaç kullanılarak değerlendirilebilir, 5) eksikliği memelilerin kullanımına kıyasla etik kısıtlamalar, 6) büyük grup boyutları, daha fazla yeniden Üretilebilirlik sağlayan hayvan modellerine göre kullanılabilir ve 7) enfeksiyon deneyleri için daha kısa saatler gereklidir.
Yeni bir çalışmada, biz G. mellonella Bioluminesans M. Bovis BCG Lux, aşı gerilme ve üye genetiği değiştirilmiş versiyonu tarafından enfeksiyonun patogenezi okuyan için bir yeni enfeksiyon modeli olarak kullanılabilir göstermiştir MTB kompleksi (mtbc)16. G. mellonella daha önce tüberküloz olmayan mikobakteriler (NTM) için bir enfeksiyon modeli olarak kullanıldığında, özellikle M. Marinum ve Mycobacterium abscessus17,18, mtbc kullanarak çalışmalar sınırlıdır Li ve al.16. MTB için bir vekil olarak koruma SEVIYESINDE (CL) 2 ' de kullanılabilecek Bioluminesans olmayan patojenik Mikobakteriyel suşlar, patojenik mikobakteriler üzerinde güvenlik ve pratiklik avantajlarını sunar. BCG Luxile enfeksiyonun ardından LARVALARı, TB enfeksiyonu16' nın kurulması sırasında doğuştan gelen dokunulmazlığın rolü ile ilgili değerli bilgiler sağlayabilen erken granülom benzeri yapıları geliştirmeye başlar. Buna ek olarak, bu basit omurgasız enfeksiyon modeli, kontrol edilen zorluk ve yeniden üretilebilirlik için birden çok çoğaltır içeren TB patogenezinin hızlı, düşük maliyetli ve güvenilir bir şekilde değerlendirilmesine imkân sağlar. Ayrıca, model, deney hayvanların genel sayısını azaltarak, erken gelişiminde yeni anti-TB ilaç ve aşı adaylarını ekrana kullanılacak potansiyele sahiptir. Ev sahibi ve patojen yapısında, transkriptom ve proteomdaki değişiklikleri, uyuşturucu hedeflerini belirlemek ve yeni ilaçların ve terapötik aşıların eylem mekanizmalarını değerlendirmek için ölçmek yeteneği de avantajlıdır.
Burada, Mikobakteriyel Enfeksiyon için Bioluminesans M. Bovis BCG Lux inokulumunu ve G. mellonella larvaları hazırlanması için deneysel protokoller ve hem larva hem de Mikobakteriyel enfeksiyona yanıt olarak hayatta kalma.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5ml reaction tube (Eppendorf)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20, 200 and 1000 &#181;l pipette and filtered tips</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well culture plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 ml pipettes and pipette boy</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 compartment Petri dish (94/15mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>637102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II saftey cabinet</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask with vented cap (250 ml)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS40183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (&#62;99.7%)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>208221.321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galleria mellonella (250 per pk)</td>
			<td>Livefood Direct UK</td>
			<td>W250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogeniser (FastPrep-24 5G )</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116005500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-240CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer (Autolumat LB 953)</td>
			<td>Berthold</td>
			<td>34622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing matrix (S, 2.0ml)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116925500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro syringe (25 &#181;l, 25 ga)</td>
			<td>SGE</td>
			<td>3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H11 agar</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>283810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 broth</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook ADC enrichment</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>212352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook OADC enrichment</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>212240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium bovis BCG lux</td>
			<td>Various</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-decyl aldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7384-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaking incubator</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 80 (Tween-80)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8074-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small box</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>dark vented or non-sealed box recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Short and narrow tipped/Blunt long tweezers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Winterm (V1.08)</td>
			<td>Berthold</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Program LB953.TTB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (94/15mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>633181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper (94mm)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cut to fit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of the invertebrate galleria mellonella as an infection model to study the mycobacterium tuberculosis complex

Tüberküloz, bulaşıcı hastalık ölümlerinin önde gelen küresel nedenidir ve dünyanın nüfusu yaklaşık dörtte biri Mycobacterium tüberkülozile enfekte olduğuna inanılmaktadır. Onlarca yıl süren araştırmaya rağmen, M. tüberkülozunun patojenik bir organizma olarak başarısının arkasındaki mekanizmalar incelenmeye devam ediyor ve daha güvenli, daha etkili antimikobakteriyel ilaçların geliştirilmesi, yükselmenin üstesinden gelmek için acilen gerekli ilaç geçirmez tüberküloz yayılması. Ancak, tüberküloz araştırmalarının ilerlemesi pahalı, zaman alıcı ve etik açıdan zorlu olan geleneksel memeliyen enfeksiyon modelleri ile darboğazlıdır. Daha önce M. tüberküloz kompleksi üyeleri için bir roman, tekrarlanabilir, düşük maliyetli, yüksek verim ve etik olarak kabul edilebilir enfeksiyon modeli olarak böcek Galleria mellonella (büyük balmumu güvesi) larvaları kurduk. Burada Bioluminesans Mycobacterium bovis BCG Lux ile G. mellonella 'nın bakım, hazırlama ve enfeksiyonunu tarif ediyoruz . Bu enfeksiyon modelini kullanarak, Mikobakteriyel doz bağımlı virülans görülebilir, ve biyoluminesans ölçümleri kullanarak in vivo Mikobakteriyel yükü hızlı bir okuma kolayca ulaşılabilir ve yeniden oluşturulabilir. Transcriptomik analiz için tam açıklamalı genom eksikliği gibi sınırlamalar mevcut olsa da, genetik olarak benzer böceklere karşı ontolojik analiz yapılabilir. Tüberküloz için düşük maliyetli, hızlı ve etik olarak kabul edilebilir bir model olarak, G. mellonella ilaç etkinliğini ve toksisitesi belirlemek için bir ön ekran olarak kullanılabilir ve konvansiyonel memelilerin kullanımından önce karşılaştırmalı Mikobakteriyel virülans belirlemek için Model. G. mellonella-mycobakteriler modelinin kullanımı, tüberküloz araştırmalarında Şu anda kullanılan hayvanların önemli sayıda azalmasına yol açacaktır.

Burada g. mellonella -BCG Lux enfeksiyon modeli kullanılarak elde edilebilir temsili veri sunuyoruz ve mtbc üyeleri için bir enfeksiyon modeli olarak g. mellonella yararları vurgulamak (Şekil 1). Önemli teknik noktalarıyla deneysel prosedürler Şekil 2' de özetlenmiştir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/5970...

Watch this Scientific Journal Video about Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex at JoVE.com

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Mycobacterium tüberküloz kompleksinin incelenmesi Için bir enfeksiyon modeli olarak ınvertebrate Galleria mellonella kullanımı

Galleria mellonella son zamanlarda Mycobacterium tüberküloz kompleksi için reproducible, ucuz ve etik olarak kabul edilebilir bir enfeksiyon modeli olarak kurulmuştur. Burada, Bioluminesans Mycobacterium bovis BCG Lux ile G. mellonella 'nın başarılı enfeksiyonunu kurmak için alınan adımları tarif ediyoruz ve gösteriyoruz .

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...

Bu protokol, galleria mellonella'nın tüberküloz üzerinde çalışmak için alternatif bir enfeksiyon modeli olarak kullanımını açıklamaktadır ve araştırmada kullanılan memeli modellerinin sayısını azaltır. Fareler gibi geleneksel memeli modelleri ile karşılaştırıldığında, Galleria mellonella tüberküloz çalışmak için daha ucuz, etik olarak kabul edilebilir ve daha erişilebilir bir modeldir. Bu modelin daha fazla optimizasyon aday antimikobakteriyel ilaç etkinliği ve toksisitesi tarama için izin verecek ve tüberküloz için acil ihtiyaç duyulan yeni terapötik gelişimine katkıda bulunacaktır.Galleria mellonella memelilerinkiyle karşılaştırılabilir karmaşık bir doğuştan gelen bağışıklık sistemine sahip. Konak-patojen etkileşimi çalışması tüberkülozda doğuştan gelen bağışıklığın rolünü daha da ortaya çıkarabilir. Bir enfeksiyon modeli olarak Galleria mellonella kullanımı tüberküloz ile sınırlı değildir ve yaygın olarak son on yıl içinde diğer bakteriyel ve mantar patojenler için kullanılmıştır.Başlamak için, Mycobacterium bovis BCG lux bir dondurulmuş 1.2 mililitrelik gliserol stok defrost, Montreal aşı suşu luxAB genleri taşıyan mekik plazmid pSMT1 ile dönüştürülmüştür. Etiketli 250 mililitrelik Erlenmeyer şişesinde, 15 mililitre Middlebrook 7H9 suyu ile 1.2 mililitrelik BCG lux'un buzunu çözün. Şişeyi kapalı bir biyogüvenlik kabına yerleştirin ve 37 santigrat derecede 72 saat boyunca 220 rpm'de orbital shaker inkübatörde kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra, luminometre tüpleri, girdap larda fosfat tamponlu tuzlu 1:10 kültür seyreltme hazırlamak ve luminometre tüpleri luminometre içine yükleyin. Substrat 1%n-decyl aldehitmutlak etanol enjektör platformu içine yük ve biyolüminesans ölçmek. BCG lux kültürünün büyümesini kontrol etmek için biyolüminesansı koloni oluşturan birimlere dönüştürün.Kültürü 2, 175 kez g'de oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bir santrifüj tüpüne ve santrifüje aktarın. Bilinen mikobactericidal aktivite ile uygun bir dezenfektan içine supernatant atın. Hücre peletini 50 mililitre PBS-T'de 2, 175 kez g santrifüj ederek iki kez yıkayın ve bakteri kümelenmesini önleyin.Son yıkamadan sonra, mikobakteriyel süspansiyonu istenilen hücre yoğunluğuna seyreltmek için atık süpernatantını decant ve gerekli miktarda ki mikobakteriyel hücre peletini pbs-T'nin gerekli hacminde yeniden askıya alın. Daha sonra, PBS-T kullanarak 24 kuyulu plakalarda inokül 10 kat seri seyreltme hazırlayın. Inoculum CFU sayımlarını saymak için yinelenen Middlebrook 7H11 agar plakaları üzerine her seyreltme 10 mikrolitre dışarı plaka.Satın alınan yıldız larvalarını varışta 18 santigrat derecede karanlıkta koruyun ve satın alma işleminden sonraki bir hafta içinde kullanın. Tek tip krem rengi, uygun boyut ve ağırlık, yüksek hareketlilik ve teslim edildiğinde kendilerini düzeltme yeteneğine sahip dayalı deneme için sağlıklı larvaları belirleyin ve seçin. Künt uçlu cımbız kullanarak, sağlıklı larvaları filtre kağıdı tabakası ile kaplı bir Petri kabına dikkatlice sayın ve kullanıma kadar karanlıkta oda sıcaklığında saklayın.94 milimetre çapında dairesel filtre kağıdını düz, yükseltilmiş bir yüzeye bantlayarak enjeksiyon platformuna hazırlayın. Sterilize etmek, atmak ve steril PBS-T üç cilt ile daha fazla durulamak için 25 mikrolitrelik bir mikroşinil içine% 70 etanol üç cilt aspire. Daha sonra, sterilize mikroşiniş içine hazırlanan BCG lux inoculum ve aspire 10 mikrolitre resuspend.Negatif kontrol için PBS-T aspirate için ayrı bir şırınga kullanın. 10 enjeksiyondan sonra, tek tip hücre süspansiyonu sağlamak için BCG lux inoculum'u yeniden askıya alın. Bir larva almak ve enjeksiyon platformu üzerine yer için cımbız kullanın.Platformda larvayı sırtına çevirin ve cımbızla baş ve kuyruğu nu emniyete alarak hareketsiz kalın. Larvanın başından geriye doğru sayarak son sol deleg'i bulun ve iğnenin ucunu yatay düzleme 10 ila 20 derecelik bir açıyla 5 ila 6 milimetre derine dikkatlice yerleştirin. Şırıngadan inoculumu enjekte edin.Her enfeksiyondan sonra, enfekte larvayı filtre kağıdı tabakası ile kaplı bir Petri kabına aktarın. Tek bir 94 milimetrelik Petri çanak kadar 30 larva barındırabilir. Petri kabını %5 karbondioksitle 37 derecede bir kuvözde havalanmış, karanlık bir kutuda saklayın.Her 24 saatte bir larvaların hayatta kalmasını izleyin. Larvalar dokunmaya tepki olarak hareket edemediklerinde ölü olarak kabul edilirler. Mantel-Cox testi ile sağkalımı kaydedin ve istatistiksel anlamlılığı değerlendirin.Her 24 saatte bir, rastgele beş enfekte larva seçin ve hafifçe larva yüzeyleri sterilize etmek için% 70 etanol batırılmış bir pamuk tomurcuk bezi kullanın. Larvaları tek tek 800 mikrolitre steril PBS içeren iki mililitrelik matris tüplere yerleştirin. Daha sonra, larvaları saniyede 6 metre de 60 saniye homojenize etmek için bir homogenizer kullanın.Homojeni kapaklardan çıkarmak için 3, 500 kez g'de 5 saniyede sandrifut yapın ve homojeni tek tek beş steril luminometre tüpüne ayırın. Steril 1,5 mililitrelik reaksiyon tüpünde 100 mikrolitre homojenlik ayırın. Kalan homojenleri, bir mililitre PBS-T ve pipetle ilgili luminometre tüplerine yıkayarak kurtarın.Vortex luminometer tüpleri ve bir luminometre üzerinde homojenatların biyolüminesans ölçmek. Daha sonra, PBS-T kullanarak 24 kuyulu kültür plakalarında ayrılmış 100 mikrolitre homojenin 10 kat seri seyreltmelerini hazırlayın. Pipet her Middlebrook 7H11 agar plaka üzerine seyreltme 10 mikrolitre ve yaymak için steril bir plaka dağıtıcı kullanın.İki hafta boyunca 37 derecede kuluçkaya yat. Ondan sonra koloni oluşturan birimleri say. In vivo enfeksiyon sonrası BCG lux RLU-CFU oranını belirleyin.Bu deneyde G.mellonella larvalarında 96 saatlik kuluçka döneminde BCG lux doza bağımlı virülans gözlendi. %50 larva mortalitesi için gerekli olan öldürücü doz, yedi CFU gücünde 10 kat daha fazla olarak belirlendi. PBS-T 10 mikrolitre doz ile enjekte kontrol grupları veya bu sadece iğne yaralanmaları simüle iğne lerva sağlığını etkilemez veya mortalite artışına yol açmadı.BcG lux yedi CFU dozu gücüne iki kez 10 ile enfekte larvalar için, larva dorsal line melanizasyon gözlendi 48 saat sonrası enfeksiyon ve sistemik melanizasyon gözlendi 96 saat sonrası enfeksiyon. BCG lux yedi CFU dozu gücüne bir kez 10 ile enfeksiyon ilk 72 saat sonrası enfeksiyon içinde biyolüminesans ilk düşüş ile sonuçlandı. Ancak, enfeksiyon sonrası 72 saat sonra, BCG lux biyolüminesans yayla başladı, kalıcı enfeksiyon kurulması gösteren.Bu özel enfeksiyon sisteminde, RLU ve CFU in vivo oranı 168 saatlik zaman dilimi boyunca ortalama 4:1 ile 2:1 ile 5:1 arasında değişmektedir. Enjeksiyon sırasında, aşırı penetrasyon riskinien aza indirmek böylece larvaları güvenli unutmayın. Kazara bağırsak delinmesi mortalitenin artmasına neden olabilir.Histopatolojik analizler ile mikobakterilerin konak hücrelerle tanıştırılması görselleştirilebilir. Daha fazla transkripsiyonel analiz genomik düzeyde etkileşimortaya çıkarabilir. Bu enfeksiyon modelinin kullanımı, yeni ilaç adaylarının gelişimin erken bir aşamasında hızlı bir şekilde test edilmesine olanak sağlayarak, uyuşturucu taramasında kullanılan hayvan sayısını önemli ölçüde azaltabilir.Bu enfeksiyon modeli iğne-sopa yaralanması ile ilişkili olabilir bir şırınga, kullanımını gerektirir. Bu riski en aza indirmek için enjeksiyon tekniğimizi kullanmanızı öneririz.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Büyüme Mycobacterium tuberculosis Biyofilmler

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

Böcek<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Bakteriyel Patogenez İnceleyecek Güçlü Enfeksiyon Model olarak

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Doğal İletim üzerine Tüberküloz-Sıtma Koenfeksiyonu Çalışması için Deneysel Bir Model Mycobacterium tuberculosis Ve Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Kullanımı<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Bir Model Organizma olarak Eğitim için<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Enfeksiyon

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Çok ilaca dirençli Demonstrating<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Amplifikasyon Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Kuruluş ve Eğitim için bir Yüksek Verimli Kur Optimizasyonu<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Ve<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Enfeksiyon İlaç Keşif için bir model olarak

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Fonksiyonel Araştırmaları 3D İnsan Akciğer Doku Modeli<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Enfeksiyon

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analiz 18FDG PET/BT uzmanı Mycobacterium tüberküloz enfeksiyon ve insan olmayan primatlarda tedavisi için bir araç olarak görüntüleme

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Mycobacterium tüberküloz ile muhabir enzim Floresans farelerde görüntüleme

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...